Metodi alternativi per la rilevazione della generazione di anioni superossido nelle piastrine

L’anione superossido (O₂^•-) è il ROS più rilevante dal punto di vista funzionale generato nelle piastrine¹. O₂^•- è il prodotto della riduzione dell’ossigeno molecolare ed è il precursore di molti ROS ² diversi. La dismutazione di O₂^•- porta alla generazione di perossido di idrogeno (H₂O₂) tramite reazioni spontanee in soluzione acquosa o reazioni catalizzate da superossido dismutasi (SODs³). Sebbene siano state suggerite diverse fonti enzimatiche (ad esempio, xantina ossidasi⁴, lipossigenasi⁵, cicloossigenasi^{6 e ossido} nitrico sintasi⁷), la respirazione mitocondriale ^8,9 e la nicotinammide adenina dinucleotide fosfato-ossidasi (NOX)¹⁰ sono le fonti più importanti di anione superossido nelle cellule eucariotiche. Questo sembra essere anche il caso delle piastrine, dove la perdita di elettroni dalla respirazione mitocondriale ^11,12 e l’attività enzimatica dei NOX^13,14 sono stati descritti come i principali contributori all’output di anione superossido.

Sebbene diversi studi si siano concentrati sulla regolazione delle piastrine da parte di O₂^•-, non c’è consenso riguardo ai meccanismi molecolari responsabili. La modulazione dell’attività dei recettori di superficie attraverso l’ossidazione diretta e la formazione di legami disolfuro è stata proposta per diversi recettori piastrinici. E’ stata suggerita la regolazione positiva dell’integrina αIIbβ3 da parte dei ROS attraverso l’ossidazione diretta dei residui di cisteina 15,16,17. Allo stesso modo, poiché le risposte piastriniche al collagene dipendono dalla dimerizzazione disolfuro-dipendente e dalla conseguente dimerizzazione della glicoproteina VI (GPVI)¹⁸, è stato proposto il potenziamento dell’attività del recettore mediante ossidazione ROS-dipendente¹⁹, sebbene non completamente dimostrato sperimentalmente. Infine, è stato dimostrato che l’ossidazione indotta da ROS dei gruppi sulfidrilici della glicoproteina Ib (GPIb) promuove l’adesione piastrinica e l’interazione piastrina-leucocitaria durante l’infiammazione²⁰. Al contrario, come possibile conseguenza della diminuzione dell’ossidazione del gruppo sulfidrilico e dell’attivazione del recettore, la perdita dell’ectodominio sia di GPVI che di GPIb è diminuita dalle condizioni riducenti²¹.

Sono stati proposti anche modi di azione indipendenti da un’ossidazione diretta dei recettori di superficie piastrinica. È stato dimostrato che i ROS, incluso l’O₂^•-, modulano positivamente il recettore del collagene GPVI attenuando l’attività della proteina tirosina fosfatasi 2 (SHP-2) contenente la regione di omologia Src, che regola negativamente la cascata di segnalazione di questo recettore²². Inoltre, l’O₂^•- può generare ONOO^– (perossinitrito) mediante una rapida reazione con l’ossido nitrico (NO), che normalmente inibisce le piastrine attraverso la guanilil ciclasi NO-sensibile (NO-GC) e la generazione del regolatore piastrinico negativo GMP ciclico (cGMP)^23,24. La conseguente diminuzione dei livelli di NO può portare al potenziamento piastrinico. In alternativa, è stato suggerito che la generazione di O₂^•- da parte di NOX2 contribuisca alla perossidazione lipidica e alla formazione di isoprostano, che è essenziale per l’attivazione e l’adesione piastrinica²⁵. Infine, la chinasi 5 regolata dal segnale extracellulare della proteina chinasi attivata dal mitogeno (MAPK), una proteina chinasi proposta come sensore di stress redox nelle piastrine²⁶, è attivata da O₂^•- e induce un fenotipo procoagulante nelle piastrine (come stimato dalla misurazione basata sulla citometria a flusso dell’esternalizzazione della fosfatidilserina)²⁷.

La disregolazione dell’O₂^•- e di altre generazioni di ROS nelle piastrine è stata associata all’esagerata risposta emostatica che porta a complicanze cardiovascolari trombotiche associate ad aterosclerosi, diabete mellito, ipertensione, obesità e cancro^28,29. In questi contesti patologici, l’emissione di ROS da parte delle piastrine è aumentata, il che porta ad un potenziamento delle loro risposte adesive e aggregatorie. Oltre all’effetto sulle risposte piastriniche, l’emissione di radicali liberi delle piastrine può avere conseguenze su altre cellule del sangue e strutture vascolari, che è un’area della salute cardiovascolare poco compresa e poco studiata³⁰. Nonostante la nostra limitata comprensione dei meccanismi molecolari che legano lo stress ossidativo alle condizioni trombotiche, la rilevanza clinica degli antiossidanti per la protezione contro le malattie cardiovascolari ha ricevuto notevole attenzione. È stato dimostrato che i livelli plasmatici di antiossidanti sono inversamente correlati al rischio di sviluppare condizioni cardiovascolari e il consumo di antiossidanti alimentari ha dimostrato di proteggere dalla malattia coronarica^31,32. Di conseguenza, l’uso di antiossidanti alimentari è stato sostenuto come un approccio promettente per la prevenzione delle malattie cardiovascolari 33,34,35. Tra gli effetti della generazione di ROS nelle piastrine, l’aumento dell’apoptosi può avere importanti effetti fisiopatologici^36,37. Nel complesso, protocolli affidabili per rilevare e quantificare l’output di O₂^•- da parte delle piastrine sono sempre più rilevanti nella ricerca cardiovascolare.

Attualmente, le tecniche disponibili per la rilevazione dei ROS presentano importanti limitazioni di specificità (ad esempio, la natura chimica delle molecole ossidanti rilevate è sconosciuta) e di affidabilità (ad esempio, l’interazione indesiderata con molecole biologiche e reagenti sperimentali porta a risultati non fisiologici distorti)^38,39. L’approccio più comunemente utilizzato per la rilevazione di ROS nelle piastrine si basa sull’uso del diclorodiidrofluoresceina diacetato (DCFDA), che viene convertito in diclorodiidrofluoresceina (DCFH) dalle esterasi intracellulari e di conseguenza in diclorofluoresceina altamente fluorescente (DCF) dagli ossidanti cellulari, inclusi i radicali ossidrilici e gli intermedi della perossidasi-H₂O₂ ^40,41. Nonostante il suo ampio utilizzo, sono stati sollevati seri dubbi sull’affidabilità di questo approccio per la misurazione del ROS³⁸ intracellulare. L’ossidazione del DCFH a DCF può essere, infatti, indotta da ioni metalli di transizione (ad esempio, Fe²⁺) o enzimi contenenti eme (ad esempio, citocromi) invece che da ROS⁴². Inoltre, il DCFDA viene convertito dalle perossidasi cellulari nella sua forma di radicale libero semichinone (DCF^•-), che a sua volta viene ossidato a DCF per reazione con l’ossigeno molecolare (O₂) con il rilascio di O₂^•-, che porta all’amplificazione artificiale delle risposte ossidative 41,43,44. Pertanto, la rilevazione di ROS intracellulari mediante DCFDA è utile per ottenere informazioni iniziali, ma richiede un’attenta considerazione e ampi controlli sperimentali^38,39.

Questo studio presenta tre tecniche alternative per il rilevamento e la misurazione del regolatore chiave della funzione piastrinica O₂^•-1. La prima tecnica è la rilevazione mediante DHE e citometria a flusso, che offre vantaggi di affidabilità e specificità rispetto alla DCFDA. La seconda tecnica qui proposta utilizza anche il DHE, ma il metodo di rilevamento è l’imaging a fluorescenza piastrinica dal vivo, che consente lo studio della generazione di O₂^•- sulla segnalazione piastrinica con cinetica rapida e risoluzione di singole cellule. Infine, un protocollo basato sull’utilizzo della sonda di spin idrossilammina 1-idrossi-3-metossicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina (CMH) in esperimenti di risonanza EPR offre la possibilità di quantificare il tasso di generazione di O₂^•- da parte delle piastrine e confrontarlo in diverse condizioni.