שיטות חלופיות לאיתור ייצור אניון סופראוקסיד בטסיות הדם

אניון סופראוקסיד (O₂^•-) הוא ה-ROS הרלוונטי ביותר מבחינה תפקודית שנוצר בטסיות¹. O₂^•- הוא תוצר של הפחתת חמצן מולקולרי ומבשר של ROS ² רבים ושונים. הדימוטציה של O₂^•- מובילה ליצירת מי חמצן (H₂O₂) באמצעות תגובות ספונטניות בתמיסה מימית או תגובות המזורזות על ידי דיסמוטאזות סופראוקסיד (^{SODs 3}). למרות שהוצעו מקורות אנזימטיים שונים (למשל, קסנטין אוקסידאז⁴, ליפאוקסיגנאז⁵, ציקלואוקסיגנאז^{6 וחנקן} חמצני סינתאז⁷), נשימה מיטוכונדריאלית ^8,9 וניקוטין-אמיד אדנין דינוקלאוטיד פוספט-אוקסידאז (NOXs)¹⁰ הם המקורות הבולטים ביותר של סופראוקסיד אניון בתאים איקריוטים. נראה שזה המקרה גם בטסיות דם, שם דליפת אלקטרונים מנשימה מיטוכונדריאלית ^11,12 והפעילות האנזימטית של^{NOXs 13,14} תוארו כתורמים העיקריים לתפוקת האניון סופראוקסיד.

למרות שמספר מחקרים התמקדו בוויסות טסיות הדם על ידי O₂^•-, אין הסכמה לגבי המנגנונים המולקולריים האחראים. אפנון פעילות קולטני פני השטח באמצעות חמצון ישיר ויצירת קשר דיסולפיד הוצע עבור קולטני טסיות שונים. הוויסות החיובי של אינטגרין αIIbβ3 על ידי ROS באמצעות חמצון ישיר של שאריות ציסטאין הוצע 15,16,17. באופן דומה, מאחר שתגובות טסיות הדם לקולגן תלויות בדימריזציה תלוית דיסולפיד וכתוצאה מכך בדימריזציה של הגליקופרוטאין VI (GPVI)¹⁸, הוצעה הגברת פעילות הקולטן על ידי חמצון תלוי ROS¹⁹, אם כי לא הוכחה באופן מלא בניסוי. לבסוף, חמצון המושרה על ידי ROS של קבוצות סולפידריל של גליקופרוטאין Ib (GPIb) הוכח כמקדם הידבקות טסיות ואינטראקציה טסיות-לויקוציטים במהלך דלקת²⁰. לעומת זאת, כתוצאה אפשרית של ירידה בחמצון קבוצת סולפידריל והפעלת קולטן, השלת האקטודומיין של GPVI ו- GPIb מצטמצמת על ידי הפחתת תנאים²¹.

כמו כן הוצעו דרכי פעולה שאינן תלויות בחמצון ישיר של קולטני טסיות הדם. ROS, כולל O₂^•-, הוכחו כמווסתים באופן חיובי את קולטן הקולגן GPVI על ידי החלשת הפעילות של החלבון טירוזין פוספטאז 2 (SHP-2) המכיל הומולוגיה Src, אשר מווסת באופן שלילי את מפל האיתות של קולטן זה²². יתר על כן, O₂^•- יכול לייצר ^ONOO- (peroxynitrite) על ידי תגובה מהירה עם תחמוצת החנקן (NO), אשר בדרך כלל מעכב טסיות דרך ציקלאז גואניל לא רגיש (NO-GC) ואת הדור של וסת טסיות שלילי GMP מחזורי (cGMP) ^23,24. הירידה ברמות NO כתוצאה מכך יכולה להוביל להגברת טסיות הדם. לחלופין, הדור של O₂^•- על ידי NOX2 הוצע לתרום חמצון שומנים והיווצרות isoprostane, אשר חיוני עבור הפעלת טסיות והדבקה²⁵. לבסוף, חלבון קינאז חוץ-תאי המופעל על ידי מיטוגן (MAPK) קינאז מווסת אות חוץ-תאי 5 (ERK5), חלבון קינאז המוצע כחיישן עקת חמצון-חיזור בטסיות²⁶, מופעל על ידי O₂^•- ומשרה פנוטיפ מעודד קרישה בטסיות הדם (כפי שמוערך על ידי מדידה מבוססת ציטומטריה של זרימה של החצנת פוספטידיל-סרין)²⁷.

חוסר הוויסות של O₂^•- ודור ROS אחר בטסיות הדם נקשר לתגובה המוסטטית מוגזמת המובילה לסיבוכים קרדיווסקולריים טרומבוטיים הקשורים לטרשת עורקים, סוכרת, יתר לחץ דם, השמנת יתר וסרטן^28,29. בהגדרות פתולוגיות אלה, תפוקת ה- ROS על ידי טסיות הדם מוגברת, מה שמוביל להגברה של תגובות הדבק והצבירה שלהם. בנוסף להשפעה על תגובות טסיות הדם, לתפוקת הרדיקלים החופשיים של טסיות הדם עשויות להיות השלכות על תאי דם אחרים ומבנים וסקולריים, שהוא תחום שאינו מובן היטב ולא נחקר מספיק של בריאות הלב וכלי הדם³⁰. למרות ההבנה המוגבלת שלנו של המנגנונים המולקולריים המקשרים בין עקה חמצונית לתנאים טרומבוטיים, הרלוונטיות הקלינית של נוגדי חמצון להגנה מפני מחלות לב וכלי דם זכתה לתשומת לב רבה. רמות נוגדות חמצון בפלזמה הוכחו בקורלציה הפוכה עם הסיכון לפתח מחלות לב וכלי דם, וצריכת נוגדי חמצון תזונתיים הוכחה כמגנה מפני מחלת עורקים כליליים^31,32. כתוצאה מכך, השימוש בנוגדי חמצון תזונתיים נתמך כגישה מבטיחה למניעת מחלות לב וכלי דם 33,34,35. בין ההשפעות של יצירת ROS בטסיות הדם, לעלייה באפופטוזיס יכולות להיות השפעות פתופיזיולוגיות חשובות^36,37. בסך הכל, פרוטוקולים אמינים לזיהוי וכימות פלט O₂^•- על ידי טסיות רלוונטיים יותר ויותר במחקר הלב וכלי הדם.

כיום, לטכניקות הזמינות לזיהוי ROS יש מגבלות חשובות של ספציפיות (כלומר, האופי הכימי של מולקולות החמצון שזוהו אינו ידוע) ואמינות (כלומר, האינטראקציה הבלתי רצויה עם מולקולות ביולוגיות וריאגנטים ניסיוניים מובילה לתוצאות לא פיזיולוגיות מוטות)^38,39. הגישה הנפוצה ביותר לזיהוי ROS בטסיות מבוססת על שימוש בדיכלורודיהידרופלואורסצאין דיאצטט (DCFDA), המומר לדיכלורודיהידרופלואורסצאין (DCFH) על ידי אסטראזות תוך-תאיות וכתוצאה מכך לדיכלורופלואורסצאין פלואורסצאין (DCF) על ידי מחמצנים תאיים, כולל רדיקלים הידרוקסילים ומתווכים פרוקסידאז-H₂O₂ ^40,41. למרות השימוש הרחב בה, הועלו שאלות רציניות לגבי אמינותה של גישה זו למדידת ROS³⁸ תוך תאי. החמצון של DCFH ל-DCF יכול להיגרם, למעשה, על ידי יוני מתכת מעבר (למשל, Fe²⁺) או אנזימים המכילים הם (למשל, ציטוכרומים) במקום ROS⁴². יתר על כן, DCFDA מומר על ידי peroxidases התא לצורת רדיקלים חופשיים semiquinone שלה (^DCF•-), אשר בתורו מחומצן DCF על ידי תגובה עם חמצן מולקולרי (O₂) עם שחרור של O₂^•-, מה שמוביל להגברה מלאכותית של תגובות חמצון 41,43,44 . לכן, זיהוי ROS תוך-תאי על ידי DCFDA שימושי להשגת תובנות ראשוניות אך דורש שיקול זהיר ובקרות ניסוי נרחבות^38,39.

מחקר זה מציג שלוש טכניקות חלופיות לזיהוי ומדידה של הרגולטור העיקרי של תפקוד טסיות הדם O₂^•-1. הטכניקה הראשונה היא זיהוי באמצעות DHE וציטומטריית זרימה, המציעה יתרונות של אמינות וספציפיות על פני DCFDA. הטכניקה השנייה המוצעת כאן משתמשת גם היא ב- DHE, אך שיטת הזיהוי היא הדמיה פלואורסצנטית של טסיות חיה, המאפשרת לחקור את הדור של O₂^•- על איתות טסיות עם קינטיקה מהירה ורזולוציה של תא בודד. לבסוף, פרוטוקול המבוסס על השימוש בגשושית ספין הידרוקסילאמין 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) בניסויי תהודה EPR מציע את האפשרות לכמת את קצב יצירת O₂^•- על ידי טסיות והשוואתו בתנאים שונים.