Méthodes alternatives pour la détection de la génération d’anions superoxyde dans les plaquettes

L’anion superoxyde (O₂^•-) est le ROS le plus pertinent sur le plan fonctionnel généré dans les plaquettes¹. O₂^•- est le produit de la réduction de l’oxygène moléculaire et le précurseur de nombreux ROS ² différents. La dismutation de O₂^•- conduit à la génération de peroxyde d’hydrogène (H₂O₂) par des réactions spontanées en solution aqueuse ou des réactions catalysées par des superoxydes dismutases (SODs³). Bien que différentes sources enzymatiques aient été suggérées (par exemple, la xanthine oxydase⁴, la lipoxygénase⁵, la cyclooxygénase^{6 et} l’oxyde nitrique synthase⁷), la respiration mitochondriale ^8,9 et les nicotinamide adénine dinucléotide phosphate-oxydases (NOXs⁾¹⁰ sont les sources les plus importantes d’anion superoxyde dans les cellules eucaryotes. Cela semble également être le cas dans les plaquettes, où la fuite d’électrons de la respiration mitochondriale^11,12 et l’activité enzymatique des NOX^13,14 ont été décrites comme les principaux contributeurs à la production d’anions superoxydes.

Bien que plusieurs études se soient intéressées à la régulation des plaquettes par l’O₂^•-, il n’y a pas de consensus sur les mécanismes moléculaires responsables. La modulation de l’activité des récepteurs de surface via l’oxydation directe et la formation de liaisons disulfure a été proposée pour différents récepteurs plaquettaires. La régulation positive de l’intégrine αIIbβ3 par les ROS via l’oxydation directe des résidus de cystéine a été suggérée 15,16,17. De même, étant donné que les réponses plaquettaires au collagène dépendent de la dimérisation dépendante du disulfure et de la dimérisation conséquente de la glycoprotéine VI (GPVI)¹⁸, la potentialisation de l’activité du récepteur par oxydation dépendante des ROS a été proposée¹⁹, bien que non entièrement prouvée expérimentalement. Enfin, il a été démontré que l’oxydation induite par les ROS des groupes sulfhydryles de la glycoprotéine Ib (GPIb) favorise l’adhésion plaquettaire et l’interaction plaquettes-leucocytes pendant l’inflammation²⁰. Inversement, comme conséquence possible de la diminution de l’oxydation du groupe sulfhydryle et de l’activation des récepteurs, l’élimination de l’ectodomaine de GPVI et GPIb est diminuée par les conditions réductrices²¹.

Des modes d’action indépendants d’une oxydation directe des récepteurs de surface plaquettaire ont également été proposés. Il a été démontré que les ROS, y compris l’O₂^•-, modulent positivement le récepteur de collagène GPVI en atténuant l’activité de la protéine tyrosine phosphatase 2 (SHP-2), qui régule négativement la cascade de signalisation de ce récepteur²². De plus, l’O₂^•- peut générer de l’ONOO^– (peroxynitrite) par réaction rapide avec l’oxyde nitrique (NO), qui inhibe normalement les plaquettes par l’intermédiaire de la guanylyl cyclase sensible au NO (NO-GC) et la génération du régulateur plaquettaire négatif GMP cyclique (^GMPc)23,24. La diminution des niveaux de NO qui en résulte peut entraîner une potentialisation plaquettaire. Par ailleurs, il a été suggéré que la génération d’O₂^•- par NOX2 contribue à la peroxydation lipidique et à la formation d’isoprostane, ce qui est essentiel à l’activation et à l’adhésion des plaquettes²⁵. Enfin, la protéine kinase extracellulaire régulée par le signal 5 (ERK5), une protéine kinase proposée comme capteur de stress redox dans les plaquettes²⁶, est activée par O₂^•- et induit un phénotype procoagulant dans les plaquettes (tel qu’estimé par la mesure basée sur la cytométrie en flux de l’externalisation de la phosphatidylsérine)²⁷.

La dérégulation de la génération d’O₂^•- et d’autres ROS dans les plaquettes a été associée à une réponse hémostatique exagérée entraînant des complications cardiovasculaires thrombotiques associées à l’athérosclérose, au diabète sucré, à l’hypertension, à l’obésité et au cancer^28,29. Dans ces contextes pathologiques, la production de ROS par les plaquettes est augmentée, ce qui conduit à une potentialisation de leurs réponses adhésives et agrégatoires. En plus de l’effet sur les réponses plaquettaires, la production de radicaux libres par les plaquettes peut avoir des conséquences sur d’autres cellules sanguines et structures vasculaires, ce qui est un domaine^{de la santé} cardiovasculaire mal compris et sous-étudié. Malgré notre compréhension limitée des mécanismes moléculaires reliant le stress oxydatif aux conditions thrombotiques, la pertinence clinique des antioxydants pour la protection contre les maladies cardiovasculaires a fait l’objet d’une attention considérable. Il a été démontré que les niveaux d’antioxydants plasmatiques sont inversement corrélés avec le risque de développer des maladies cardiovasculaires, et il a été démontré que la consommation d’antioxydants alimentaires protège contre les maladies coronariennes^31,32. Par conséquent, l’utilisation d’antioxydants alimentaires a été préconisée comme une approche prometteuse pour la prévention des maladies cardiovasculaires 33,34,35. Parmi les effets de la génération de ROS dans les plaquettes, l’augmentation de l’apoptose peut avoir des effets physiopathologiques importants^36,37. Dans l’ensemble, des protocoles fiables pour détecter et quantifier la production d’O₂^•- par les plaquettes sont de plus en plus pertinents dans la recherche cardiovasculaire.

À l’heure actuelle, les techniques disponibles pour la détection des ROS présentent d’importantes limites en termes de spécificité (c’est-à-dire que la nature chimique des molécules oxydantes détectées est inconnue) et de fiabilité (c’est-à-dire que l’interaction indésirable avec les molécules biologiques et les réactifs expérimentaux conduit à des résultats non physiologiques biaisés)^38,39. L’approche la plus couramment utilisée pour la détection des ROS dans les plaquettes est basée sur l’utilisation du diacétate de dichlorodihydrofluorescéine (DCFDA), qui est converti en dichlorodihydrofluorescéine (DCFH) par les estérases intracellulaires et par conséquent en dichlorofluorescéine hautement fluorescente (DCF) par les oxydants cellulaires, y compris les radicaux hydroxyles et les intermédiaires de la peroxydase-H₂O₂ ^40,41. Malgré sa large utilisation, de sérieuses questions ont été soulevées quant à la fiabilité de cette approche pour la mesure des ROS³⁸ intracellulaires. L’oxydation du DCFH en DCF peut en effet être induite par des ions de métaux de transition (par exemple, Fe²⁺) ou des enzymes contenant de l’hème (par exemple, les cytochromes) au lieu de ROS⁴². De plus, le DCFDA est converti par les peroxydases cellulaires en sa forme de radical libre semiquinone (DCF^•-), qui est à son tour oxydée en DCF par réaction avec l’oxygène moléculaire (O₂) avec la libération de O₂^•-, ce qui conduit à l’amplification artificielle des réponses oxydatives 41,43,44. Par conséquent, la détection des ROS intracellulaires par le DCFDA est utile pour obtenir des informations initiales, mais nécessite une réflexion prudente et des contrôles expérimentaux approfondis^38,39.

Cette étude présente trois techniques alternatives pour la détection et la mesure du régulateur clé de la fonction plaquettaire O₂^•-1. La première technique est la détection à l’aide de la DHE et de la cytométrie en flux, qui offre des avantages de fiabilité et de spécificité par rapport à la DCFDA. La deuxième technique proposée ici utilise également la DHE, mais la méthode de détection est l’imagerie par fluorescence plaquettaire en direct, qui permet d’étudier la génération d’O₂^•- lors de la signalisation plaquettaire avec une cinétique rapide et une résolution unicellulaire. Enfin, un protocole basé sur l’utilisation de la sonde de spin d’hydroxylamine 1-hydroxy-3-méthoxycarbonyl-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidine (CMH) dans des expériences de résonance EPR offre la possibilité de quantifier le taux de génération d’O₂^•- par les plaquettes et de le comparer dans différentes conditions.