طرق بديلة للكشف عن توليد أنيون الأكسيد الفائق في الصفائح الدموية
Summary
يعد توليد أنيون الأكسيد الفائق ضروريا لتحفيز الصفائح الدموية ، وإذا كان غير منظم ، فهو ضروري للأمراض الخثارية. هنا ، نقدم ثلاثة بروتوكولات للكشف الانتقائي عن أنيونات الأكسيد الفائق ودراسة تنظيم الصفائح الدموية المعتمدة على الأكسدة والاختزال.
Abstract
أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هي جزيئات تحتوي على الأكسجين غير مستقرة للغاية. عدم استقرارها الكيميائي يجعلها شديدة التفاعل ويمنحها القدرة على التفاعل مع جزيئات حيوية مهمة مثل البروتينات والأحماض النووية والليبيدات. أنيونات الأكسيد الفائق هي أنواع الأكسجين التفاعلية المهمة الناتجة عن تقليل الأكسجين الجزيئي (أي الحصول على إلكترون واحد). على الرغم من آثارها الأولية حصريا في عمليات الشيخوخة والتنكسية والمسببة للأمراض ، إلا أن مشاركتها في الاستجابات الفسيولوجية المهمة أصبحت واضحة مؤخرا. في الجهاز الوعائي، ثبت أن الأنيونات فوق الأكسيد تعدل تمايز خلايا العضلات الملساء الوعائية ووظيفتها، وتكاثر الخلايا البطانية الوعائية وهجرتها في تكوين الأوعية، والاستجابة المناعية، وتنشيط الصفائح الدموية في الإرقاء. دور أنيونات الأكسيد الفائق مهم بشكل خاص في عدم تنظيم الصفائح الدموية ومضاعفات القلب والأوعية الدموية المرتبطة بعدد كبير من الحالات ، بما في ذلك السرطان والعدوى والالتهابات والسكري والسمنة. لذلك ، أصبح من المهم للغاية في أبحاث القلب والأوعية الدموية أن تكون قادرة على قياس توليد الأنيونات الفائقة الأكسيد بشكل فعال بواسطة الصفائح الدموية البشرية ، وفهم الآليات المعتمدة على الأكسدة والاختزال التي تنظم التوازن بين الإرقاء والتخثر ، وفي النهاية ، تحديد أدوات دوائية جديدة لتعديل استجابات الصفائح الدموية التي تؤدي إلى تجلط الدم ومضاعفات القلب والأوعية الدموية. تقدم هذه الدراسة ثلاثة بروتوكولات تجريبية تم تبنيها بنجاح للكشف عن أنيونات الأكسيد الفائق في الصفائح الدموية ودراسة الآليات المعتمدة على الأكسدة والاختزال التي تنظم الإرقاء والتخثر: 1) اكتشاف أنيون الأكسيد الفائق القائم على ثنائي هيدرويثيديوم (DHE) عن طريق قياس التدفق الخلوي. 2) تصور وتحليل أنيون الأكسيد الفائق القائم على DHE عن طريق تصوير الصفائح الدموية الفردية ؛ و 3) القياس الكمي القائم على المسبار المغزلي لإخراج أنيون الأكسيد الفائق في الصفائح الدموية بواسطة الرنين المغنطيسي للإلكترون (EPR).
Introduction
أنيون الأكسيد الفائق (O2 • –) هو أكثر أنواع الأكسجين التفاعلية ذات الصلة وظيفيا المتولدة في الصفائح الدموية1. O2 • – هو نتاج تقليل الأكسجين الجزيئي وسلائف العديد من أنواع ROS 2 المختلفة. يؤدي تفكك O2•- إلى توليد بيروكسيد الهيدروجين (H2O2) عن طريق التفاعلات التلقائية في محلول مائي أو تفاعلات تحفزها ديسموتاز الأكسيد الفائق (SODs3). على الرغم من اقتراح مصادر إنزيمية مختلفة (على سبيل المثال ، أوكسيديز الزانثين4 ، وأكسيجينازالشحمي 5 ، وأنزيمات الأكسدة الحلقية6 ، وسينسيز أكسيد النيتريك7) ، فإن تنفس الميتوكوندريا8،9 ونيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد فوسفات أوكسيديز (NOXs)10 هي أبرز مصادر أنيون الأكسيد الفائق في الخلايا حقيقية النواة. يبدو أن هذا هو الحال أيضا في الصفائح الدموية ، حيث تم وصف تسرب الإلكترون من تنفس الميتوكوندريا 11,12 والنشاط الأنزيمي لأكاسيد النيتروجين13,14 على أنهما المساهمان الرئيسيان في إخراج أنيون الأكسيد الفائق.
على الرغم من أن العديد من الدراسات قد ركزت على تنظيم الصفائح الدموية بواسطة O2 • – ، إلا أنه لا يوجد إجماع بشأن الآليات الجزيئية المسؤولة. تم اقتراح تعديل نشاط المستقبلات السطحية عن طريق الأكسدة المباشرة وتكوين رابطة ثاني كبريتيد لمستقبلات الصفائح الدموية المختلفة. تم اقتراح التنظيم الإيجابي للإنتغرين αIIbβ3 بواسطة أنواع الأكسجين التفاعلية عن طريق الأكسدة المباشرة لبقايا السيستين15،16،17. وبالمثل ، نظرا لأن استجابات الصفائح الدموية للكولاجين تعتمد على التحلل المعتمد على ثاني كبريتيد وما يترتب على ذلك من تثبيط البروتين السكري السادس (GPVI) 18 ، فقد تم اقتراح تقوية نشاط المستقبلات بواسطة الأكسدة المعتمدة على أنواع الأكسجينالتفاعلية 19 ، على الرغم من عدم إثباتها تجريبيا بشكل كامل. أخيرا ، تبين أن الأكسدة التي يسببها ROS لمجموعات سلفهيدريل من البروتين السكري Ib (GPIb) تعزز التصاق الصفائح الدموية وتفاعل الصفائح الدموية والكريات البيض أثناء الالتهاب20. على العكس من ذلك ، كنتيجة محتملة لانخفاض أكسدة مجموعة سلفهيدريل وتنشيط المستقبلات ، يتم تقليل سفك المجال الخارجي لكل من GPVI و GPIb عن طريق تقليل الظروف21.
كما تم اقتراح طرق عمل مستقلة عن الأكسدة المباشرة لمستقبلات سطح الصفائح الدموية. ثبت أن أنواع الأكسجين التفاعلية ، بما في ذلك O2 • – ، تعدل بشكل إيجابي مستقبلات الكولاجين GPVI عن طريق تخفيف نشاط منطقة التماثل Src 2 التي تحتوي على بروتين التيروزين الفوسفاتيز 2 (SHP-2) ، والذي ينظم سلبا سلسلة الإشارات لهذا المستقبل22. علاوة على ذلك ، يمكن أن يولد O2 • – ONOO- (بيروكسي نيتريت) عن طريق التفاعل السريع مع أكسيد النيتريك (NO) ، والذي يثبط عادة الصفائح الدموية من خلال سيكلاز غوانيليل غير الحساس (NO-GC) وتوليد منظم الصفائح الدموية السلبي الدوري GMP (cGMP) 23,24. يمكن أن يؤدي الانخفاض الناتج في مستويات NO إلى تقوية الصفائح الدموية. بدلا من ذلك ، تم اقتراح توليد O2 • – بواسطة NOX2 للمساهمة في بيروكسيد الدهون وتكوين الأيزوبروستان ، وهو أمر ضروري لتنشيط الصفائح الدموية والالتصاق25. أخيرا ، يتم تنشيط بروتين كيناز المنشط بالميتوجين (MAPK) كيناز 5 المنظم للإشارة خارج الخلية (ERK5) ، وهو بروتين كيناز مقترح كمستشعر إجهاد الأكسدة والاختزال في الصفائح الدموية26 ، بواسطة O2 • – ويحث على النمط الظاهري للتخثر في الصفائح الدموية (كما هو مقدر من خلال القياس القائم على قياس التدفق الخلوي للفوسفاتيديل سيرين الخارجي)27.
ارتبط عدم تنظيم O2 • – وتوليد ROS الآخر في الصفائح الدموية باستجابة مرقئ مبالغ فيها مما يؤدي إلى مضاعفات القلب والأوعية الدموية الخثارية المرتبطة بتصلب الشرايين والسكري وارتفاع ضغط الدم والسمنة والسرطان28,29. في هذه الإعدادات المرضية ، يتم زيادة إنتاج ROS بواسطة الصفائح الدموية ، مما يؤدي إلى تقوية استجاباتها اللاصقة والتجميعية. بالإضافة إلى التأثير على استجابات الصفائح الدموية ، قد يكون لإخراج الجذور الحرة للصفائح الدموية عواقب على خلايا الدم الأخرى والهياكل الوعائية ، وهي منطقة غير مفهومة بشكل جيد ولا يتم التحقيق فيها بشكل كاف في صحة القلب والأوعية الدموية30. على الرغم من فهمنا المحدود للآليات الجزيئية التي تربط الإجهاد التأكسدي بحالات التخثر ، فقد حظيت الأهمية السريرية لمضادات الأكسدة للحماية من أمراض القلب والأوعية الدموية باهتمام كبير. لقد ثبت أن مستويات مضادات الأكسدة في البلازما ترتبط عكسيا بخطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية ، وقد ثبت أن استهلاك مضادات الأكسدة الغذائية يحمي من مرض الشريان التاجي31,32. وبالتالي ، تمت الدعوة إلى استخدام مضادات الأكسدة الغذائية كنهج واعد للوقاية من أمراض القلب والأوعية الدموية33،34،35. من بين آثار توليد ROS في الصفائح الدموية ، يمكن أن يكون للزيادة في موت الخلايا المبرمج تأثيرات فسيولوجية مرضية مهمة36,37. بشكل عام ، فإن البروتوكولات الموثوقة للكشف عن إخراج O2 • – بواسطة الصفائح الدموية وقياسها ذات أهمية متزايدة في أبحاث القلب والأوعية الدموية.
حاليا ، التقنيات المتاحة للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية لها قيود مهمة على الخصوصية (أي أن الطبيعة الكيميائية للجزيئات المؤكسدة المكتشفة غير معروفة) والموثوقية (أي أن التفاعل غير المرغوب فيه مع الجزيئات البيولوجية والكواشف التجريبية يؤدي إلى نتائج غير فسيولوجية متحيزة)38,39. يعتمد النهج الأكثر استخداما للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية في الصفائح الدموية على استخدام ثنائي كلورو ثنائي هيدروفلوريسئين ثنائي الأسيتات (DCFDA) ، والذي يتم تحويله إلى ثنائي كلورو ثنائي هيدروفلوريسئين (DCFH) بواسطة استرات داخل الخلايا وبالتالي إلى ثنائي كلورو فلوروريسئين عالي الفلورسنت (DCF) بواسطة المؤكسدات الخلوية ، بما في ذلك جذور الهيدروكسيل و peroxidase-H2O2 وسيطة40,41. على الرغم من استخدامه على نطاق واسع ، فقد أثيرت أسئلة خطيرة بشأن موثوقية هذا النهج لقياس ROS38 داخل الخلايا. في الواقع ، يمكن أن تحدث أكسدة DCFH إلى DCF بواسطة أيونات المعادن الانتقالية (على سبيل المثال ، Fe2+) أو الإنزيمات المحتوية على الهيم (مثل السيتوكرومات) بدلا من ROS42. علاوة على ذلك ، يتم تحويل DCFDA بواسطة بيروكسيديز الخلية إلى شكل الجذور الحرة شبه الكينون (DCF • –) ، والذي يتأكسد بدوره إلى DCF عن طريق التفاعل مع الأكسجين الجزيئي (O2) مع إطلاق O2 • – ، مما يؤدي إلى التضخيم الاصطناعي للاستجابات المؤكسدة41،43،44. لذلك ، فإن اكتشاف أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا بواسطة DCFDA مفيد للحصول على رؤى أولية ولكنه يتطلب دراسة حذرة وضوابط تجريبية واسعةالنطاق 38,39.
تقدم هذه الدراسة ثلاث تقنيات بديلة للكشف عن وقياس المنظم الرئيسي لوظيفة الصفائح الدموية O2 • –1. التقنية الأولى هي الكشف باستخدام DHE وقياس التدفق الخلوي ، والذي يوفر مزايا الموثوقية والنوعية على DCFDA. تستخدم التقنية الثانية المقترحة هنا أيضا DHE ، لكن طريقة الكشف هي التصوير الفلوري للصفائح الدموية الحية ، والذي يسمح بدراسة توليد O2 • – عند إشارات الصفائح الدموية بحركية سريعة ودقة خلية واحدة. أخيرا ، يوفر بروتوكول يعتمد على استخدام مسبار الدوران هيدروكسيلامين 1-هيدروكسي-3-ميثوكسي كربونيل-2،2،5،5-رباعي ميثيل بيروليدين (CMH) في تجارب الرنين EPR إمكانية تحديد معدل O2 • – توليد بواسطة الصفائح الدموية ومقارنته في ظروف مختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المخطوطة ، نقدم ثلاث تقنيات مختلفة مع إمكانية تعزيز القدرة على التحقيق في التنظيم المعتمد على الأكسدة والاختزال لوظيفة الصفائح الدموية عن طريق الكشف الانتقائي عن O2 • –. الطريقتان الأوليان هما تحسين التقنيات الحالية بسبب مسبار الأكسدة والاختزال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة القلب البريطانية (PG / 15/40/31522) ، وأبحاث الزهايمر في المملكة المتحدة (ARUK-PG2017A-3) ، ومنح مجلس البحوث الأوروبي (# 10102507) إلى G. Pula.
Materials
| 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-02.1-50mg | Reagent for EPR (spin probe) |
| BD FACSAria III | BD Biosciences | NA | Flow cytometer |
| Bovine Serum Albumin | Merck/Sigma | A7030 | For μ-slide coating |
| Bruker E-scan M (Noxyscan) | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-E.11-BES | EPR spectrometer |
| Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.) | Merck/Sigma | C4963 | Hydrogen peroxide scavenger (specificity control) |
| ChronoLog Model 490+4 | Labmedics/Chronolog | NA | Aggregometer |
| CM radical | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-20.1-100mg | Reagent for EPR (calibration control) |
| deferoxamine | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-09.1-100mg | Reagent for EPR |
| diethyldithiocarbamate (DETC) | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-10.1-1g | Reagent for EPR |
| Dihydroethidium | Thermo Fisher Scientifics | D11347 | Superoxide anion probe |
| Dimethyl sulfoxide | Merck/Sigma | 34869 | For stock solution preparation |
| EPR sealing wax plates | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-A.3-VPM | Consumable for EPR |
| EPR-grade water | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-07.7.1-0.5L | Reagent for EPR |
| Fibrinogen from human plasma | Merck/Sigma | F4883 | For μ-slide coating |
| FITC anti-human CD41 Antibody | BioLegend | 303704 | Platelet-specific staining for flow cytometry |
| Glass cuvettes | Labmedics/Chronolog | P/N 312 | Consumable for incubation in aggregometer |
| Horm Collagen | Labmedics/Chronolog | P/N 385 | For platelet stimulation |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | NA | ImageJ 1.53t (Wayne Rasband) |
| Indomethacin | Merck/Sigma | I7378 | For platelet isolation |
| Micropipettes DURAN 50µl | Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH | NOX-G.6.1-50µL | Consumable for EPR |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Merck/Sigma | P2658 | For μ-slide coating |
| Prostaglandin E1 (PGE1) | Merck/Sigma | P5515 | For platelet isolation |
| Sodium citrate (4% w/v solution) | Merck/Sigma | S5770 | For platelet isolation |
| Stirring bars (Teflon-coated) | Labmedics/Chronolog | P/N 313 | Consumable for incubation in aggregometer |
| Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD) | Merck/Sigma | S9549 | Superoxide anion scavenger (specificity control) |
| Thrombin from human plasma | Merck/Sigma | T6884 | For platelet stimulation and μ-slide coating |
| VAS2870 | Enzo Life Science | BML-EI395 | NOX inhibitor |
| Zeiss 510 LSM confocal microscope | Zeiss | NA | Confocal microscope |
References
- Vara, D., Cifuentes-Pagano, E., Pagano, P. J., Pula, G. A novel combinatorial technique for simultaneous quantification of oxygen radicals and aggregation reveals unexpected redox patterns in the activation of platelets by different physiopathological stimuli. Haematologica. 104 (9), 1879-1891 (2019).
- Fridovich, I. Superoxide radical: An endogenous toxicant. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 239-257 (1983).
- Keele, B. B., Mccord, J. M., Fridovich, I. Superoxide dismutase from Escherichia coli B. A new manganese-containing enzyme. J Biol Chem. 245 (22), 6176-6181 (1970).
- Berry, C. E., Hare, J. M. Xanthine oxidoreductase and cardiovascular disease: Molecular mechanisms and pathophysiological implications. J Physiol. 555, 589-606 (2004).
- Kim, C., Kim, J. Y., Kim, J. H. Cytosolic phospholipase a(2), lipoxygenase metabolites, and reactive oxygen species. BMB Rep. 41 (2), 555-559 (2008).
- Armstead, W. M., Mirro, R., Busija, D. W., Leffler, C. W. Postischemic generation of superoxide anion by newborn pig brain. Am J Physiol. 255 (2), H401-H403 (1988).
- Mayer, B., et al. Nitric oxide synthase-catalyzed activation of oxygen and reduction of cytochromes: Reaction mechanisms and possible physiological implications. J Cardiovasc Pharmacol. 20, S54-S56 (1992).
- Du, G., Mouithys-Mickalad, A., Sluse, F. E. Generation of superoxide anion by mitochondria and impairment of their functions during anoxia and reoxygenation in vitro. Free Radic Biol Med. 25 (9), 1066-1074 (1998).
- Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
- Jiang, F., Zhang, Y., Dusting, G. J. Nadph oxidase-mediated redox signaling: Roles in cellular stress response, stress tolerance, and tissue repair. Pharmacol Rev. 63 (1), 218-242 (2011).
- Wang, Z., et al. The role of mitochondria-derived reactive oxygen species in hyperthermia-induced platelet apoptosis. PLoS One. 8 (9), e75044 (2013).
- Wachowicz, B., Olas, B., Zbikowska, H. M., Buczynski, A. Generation of reactive oxygen species in blood platelets. Platelets. 13 (3), 175-182 (2002).
- Vara, D., et al. Nadph oxidases are required for full platelet activation in vitro and thrombosis in vivo but dispensable for plasma coagulation and hemostasis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 41 (2), 683-697 (2021).
- Violi, F., Pignatelli, P. Platelet nox, a novel target for anti-thrombotic treatment. Thromb Haemost. 111 (5), 817-823 (2014).
- Begonja, A. J., et al. Platelet NAD(P)H-oxidase-generated ros production regulates alphaiibbeta3-integrin activation independent of the NO/CGMP pathway. Blood. 106 (8), 2757-2760 (2005).
- Vara, D. S., et al. Autocrine amplification of integrin αIIbβ3 activation and platelet adhesive responses by deoxyribose-1-phosphate. Thromb Haemost. 109 (6), 1108-1119 (2013).
- Essex, D. W. The role of thiols and disulfides in platelet function. Antioxid Redox Signal. 6 (4), 736-746 (2004).
- Arthur, J. F., et al. Ligand binding rapidly induces disulfide-dependent dimerization of glycoprotein vi on the platelet plasma membrane. J Biol Chem. 282 (42), 30434-30441 (2007).
- Arthur, J. F., Gardiner, E. E., Kenny, D., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet receptor redox regulation. Platelets. 19 (1), 1-8 (2008).
- Kim, K., Li, J., Tseng, A., Andrews, R. K., Cho, J. Nox2 is critical for heterotypic neutrophil-platelet interactions during vascular inflammation. Blood. 126 (16), 1952-1964 (2015).
- Hosseini, E., Solouki, A., Roudsari, Z. O., Kargar, F., Ghasemzadeh, M. Reducing state attenuates ectodomain shedding of GPVI while restoring adhesion capacities of stored platelets: Evidence addressing the controversy around the effects of redox condition on thrombosis. J Thromb Thrombolysis. 50 (1), 123-134 (2020).
- Jang, J. Y., et al. Reactive oxygen species play a critical role in collagen-induced platelet activation via SHP-2 oxidation. Antioxid Redox Signal. 20 (16), 2528-2540 (2014).
- Beckman, J. S., Koppenol, W. H. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: The good, the bad, and ugly. Am J Physiol. 271 (5), C1424-C1437 (1996).
- Koppenol, W. H., Kissner, R., Beckman, J. S. Syntheses of peroxynitrite: To go with the flow or on solid grounds. Methods Enzymol. 269, 296-302 (1996).
- Cammisotto, V., et al. Nox2-mediated platelet activation by glycoprotein (GP) VI: Effect of rivaroxaban alone and in combination with aspirin. Biochem Pharmacol. 163, 111-118 (2019).
- Yang, M., et al. Platelet CD36 promotes thrombosis by activating redox sensor ERK5 in hyperlipidemic conditions. Blood. 129 (21), 2917-2927 (2017).
- Yang, M., et al. Platelet CD36 signaling through ERK5 promotes caspase-dependent procoagulant activity and fibrin deposition in vivo. Blood Adv. 2 (21), 2848-2861 (2018).
- Freedman, J. E. Oxidative stress and platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (3), s11-s16 (2008).
- Masselli, E., et al. ROS in platelet biology: Functional aspects and methodological insights. Int J Mol Sci. 21 (14), 4866 (2020).
- Madamanchi, N. R., Vendrov, A., Runge, M. S. Oxidative stress and vascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (1), 29-38 (2005).
- Riemersma, R. A., et al. Risk of angina pectoris and plasma concentrations of vitamins a, c, and e and carotene. Lancet. 337 (8732), 1-5 (1991).
- Rimm, E. B., et al. Vitamin E consumption and the risk of coronary heart disease in men. N Engl J Med. 328 (20), 1450-1456 (1993).
- Zhang, W., Zheng, Y., Yan, F., Dong, M., Ren, Y. Research progress of quercetin in cardiovascular disease. Front Cardiovasc Med. 10, 1203713 (2023).
- Russell, C., Keshavamurthy, S., Saha, S. Nutraceuticals in the management of cardiovascular risk factors: Where is the evidence. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 21 (3), 150-161 (2021).
- Rotariu, D., et al. Oxidative stress – complex pathological issues concerning the hallmark of cardiovascular and metabolic disorders. Biomed Pharmacother. 152, 113238 (2022).
- Hosseini, E., Ghasemzadeh, M., Atashibarg, M., Haghshenas, M. R. O. S. scavenger, n-acetyl-l-cysteine and NOX specific inhibitor, VAS2870 reduce platelets apoptosis while enhancing their viability during storage. Transfusion. 59 (4), 1333-1343 (2019).
- Hosseini, E., Nodeh, F. K., Ghasemzadeh, M. Gamma irradiation induces a pro-apoptotic state in longer stored platelets, without progressing to an overt apoptosis by day 7 of storage. Apoptosis. 28 (7-8), 1141-1153 (2023).
- Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: A scientific statement from the American heart association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
- Hempel, S. L., Buettner, G. R., O’malley, Y. Q., Wessels, D. A., Flaherty, D. M. Dihydrofluorescein diacetate is superior for detecting intracellular oxidants: Comparison with 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate, 5(and 6)-carboxy-2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate, and dihydrorhodamine 123. Free Radic Biol Med. 27 (1-2), 146-159 (1999).
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: Challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
- Burkitt, M. J., Wardman, P. Cytochrome c is a potent catalyst of dichlorofluorescin oxidation: Implications for the role of reactive oxygen species in apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 282 (1), 329-333 (2001).
- Rota, C., Fann, Y. C., Mason, R. P. Phenoxyl free radical formation during the oxidation of the fluorescent dye 2′,7′-dichlorofluorescein by horseradish peroxidase. Possible consequences for oxidative stress measurements. J Biol Chem. 274 (40), 28161-28168 (1999).
- Rota, C., Chignell, C. F., Mason, R. P. Evidence for free radical formation during the oxidation of 2′-7′-dichlorofluorescin to the fluorescent dye 2′-7′-dichlorofluorescein by horseradish peroxidase: Possible implications for oxidative stress measurements. Free Radic Biol Med. 27 (7-8), 873-881 (1999).
- Rodig, S. J. Attaching suspension cells to slides for staining. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (12), (2020).
- Abubaker, A. A., Vara, D., Eggleston, I., Canobbio, I., Pula, G. A novel flow cytometry assay using dihydroethidium as redox-sensitive probe reveals NADPH oxidase-dependent generation of superoxide anion in human platelets exposed to amyloid peptide beta. Platelets. 30 (2), 181-189 (2019).
- Gaspar, R. S., et al. Protein disulphide isomerase and NADPH oxidase 1 cooperate to control platelet function and are associated with cardiometabolic disease risk factors. Antioxidants (Basel). 10 (3), 497 (2021).
- Gaspar, R. S., Ferreira, P. M., Mitchell, J. L., Pula, G., Gibbins, J. M. Platelet-derived extracellular vesicles express NADPH oxidase-1 (NOX-1), generate superoxide and modulate platelet function. Free Radic Biol Med. 165, 395-400 (2021).
- Vara, D., et al. NADPH oxidase 1 is a novel pharmacological target for the development of an antiplatelet drug without bleeding side effects. FASEB J. 34 (10), 13959-13977 (2020).
- Lopes-Pires, M. E., et al. Zinc regulates reactive oxygen species generation in platelets. Platelets. 32 (3), 368-377 (2021).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and mitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: Another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Linden, M. D. Platelet flow cytometry. Methods Mol Biol. 992, 241-262 (2013).
- Kauffman, M. E., et al. MitoSOX-based flow cytometry for detecting mitochondrial ROS. React Oxyg Species (Apex). 2 (5), 361-370 (2016).
- Sonkar, V. K., et al. NOX2 NADPH oxidase is dispensable for platelet activation or arterial thrombosis in mice. Blood Adv. 3 (8), 1272-1284 (2019).
- Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor’ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radic Res. 45 (4), 417-430 (2011).
- Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).
