フローサイトメトリーを用いたシナプス材料のミクログリア包絡の定量化

実験手順の一般的な図を 図1Aにグラフで示します。生きた動物の取り扱いに関するすべての実験は、ドイツ動物保護法に厳密に従って行われ、ベルリンの地域保健社会サービス局(Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Germany)によって承認されました。マウスは、マックス・デルブリュック分子医学センター(MDC)の動物コア施設で、標準的な実験室条件下で12:12の明暗サイクルで換気ケージにグループ収容されました。食料と水は自由に提供されました 。 バッファーと試薬の組成については 表1 を、このプロトコルで使用されるすべての試薬、機器、および材料に関連する詳細については 、材料表 を参照してください。vGLUT1特異的アッセイでは、原稿全体で in vivo*という用語を使用し、フローサイトメトリーには組織の均質化と細胞単離が必要であり、単離手順後にミクログリアが約95%の生存率を示すことを認めました(図1B および 補足図S1)。したがって、それらは、固定されるまで、 生体外でシナプス材料を飲み込む能力を短時間保持します。したがって、vGLUT1+ ミクログリアの定量は、固定ステップまでの in vivo および短期の ex vivo エンベロープの両方で構成されます。 1. ミクログリアによるグルタミン酸作動性シナプスの in vivo* 飲み込み検出のための細胞内vGLUT1染色 注:以下の細胞単離手順は、16.細胞単離のすべてのステップは氷上で実施する必要があります。 ペントバルビタールの腹腔内注射を使用してマウスに麻酔をかけます。マウスを10 mLの氷冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で心内投与し、~2分間灌流します。注:サンプル(n)ごとに1つのマウスが使用されます。 頭蓋骨から脳を取り出し、1mLの神経細胞培地に保存します。注:Hibernate-A培地などの神経細胞培地は、組織解離プロセス後の細胞の高い生存率を確保するために使用されます。 1mLの氷冷神経細胞培地で満たされたシャーレに脳を移し、前述のように海馬を解剖する17。 海馬を 1 mL の神経細胞培地で満たされた Dounce ホモジナイザーに移し、緩い乳棒を使用して組織を約 ~25 回の穏やかなストロークで解離します。 5 mLのポリプロピレンチューブに70 μmのストレーナーを置き、500 μLの神経細胞培地を加えます。組織ホモジネートをストレーナーを介して5mLポリプロピレンチューブに移します。 Dounce ホモジナイザーを 1 mL の冷神経細胞培地で 2 回すすぎ、サンプルを 400 × g で 8 分間遠心分離します。 上清を吸引し、穏やかなピペッティングにより、ペレットを500 μLの氷冷DPBSに再懸濁します。均質な懸濁液を確保し、DPBSを使用して最終容量を1.5mLまで完成させます。 500 μLの等張性Percoll溶液をサンプルに加え、穏やかに再懸濁し、さらに2 mLの冷たくしたDPBSで覆います。 サンプルを3,000 × g で10分間遠心分離し、全加速とブレーキなしの運転を行います。最上層と中相のミエリンディスクを吸引します。注:以下のすべての遠心分離ステップは、特に指定がない限り、4 °Cで実行されます。 4 mLの冷DPBSを加え、サンプルを400 × g で10分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞を100 μLの固定生存率染色溶液に再懸濁し、サンプルを4°Cで30分間インキュベートします。 1 mLの冷たくしたDPBSをサンプルに加え、サンプルを300 × g で5分間遠心分離します。上清を捨て、100 μLのCD16/CD32染色溶液(1/200 in FACS buffer)を加えます。ボルテックスを~5秒間ボルテックスし、4°Cで10分間インキュベートします。注:CD16/CD32染色は、フローサイトメトリーなどのアプリケーションの前に、ミクログリアなどのFcR含有細胞への抗体の非特異的結合を最小限に抑えるための前処理です。 1 mLのFACSバッファーをサンプルに加え、300 × g で5分間遠心分離します。上清を吸引し、100 μLの染色用マスターミックス-I(1x FACS Bufferに1/100 anti-CD11b/ anti-CD45 + 1/200 anti-Ly6C/ anti-Ly6G)を加えます。暗所でサンプルを4°Cで20分間インキュベートします。 1 mLのFACSバッファーをサンプルに加え、300 × g で5分間遠心分離します。 ペレットを250 μLの固定緩衝液に再懸濁します。4°Cで25分間インキュベートします。 1x permeabilization(PERM)Buffer 2 mLを添加し、300 × g を5分間遠心分離します。 上清を捨て、100 μLのvGLUT1またはアイソタイプコントロール染色液を加えます。~5秒間ボルテックスし、サンプルを4°Cで50分間インキュベートします。 1x PERM Buffer 2 mLを加え、300 × g を5分間遠心分離します。上清を捨て、2 mLのFACSバッファーをサンプルに加えます。 300 × g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。細胞を250μLのFACSバッファーに再懸濁し、サンプルを40μmのストレーナフィルターに通します。 フローサイトメトリーを使用して、単一/生存/CD11b ++/CD45+ ミクログリアからのvGLUT1蛍光強度を解析します。各実験のネガティブコントロールとして脾臓マクロファージを使用します。脾細胞を分離するには、70 μmのストレーナーフィルターで細かく刻んだ脾臓組織を2回穏やかに圧縮します。フィルターを40 mLのDPBSですすぎ、懸濁液を50 mLのコニカルチューブに集めます。 350 × g を10分間遠心分離し、得られたペレットを赤血球溶解バッファーの1 mL溶液に再懸濁します。氷上で10分間インキュベートします。 インキュベーション後、10 mLのDPBSをサンプルに加え、350 × g で10分間遠心分離します。 ステップ1.11と1.17で説明した染色ステップに進みます。注:ゲーティング戦略は、脾臓マクロファージをCD11b ++/ CD45++/生細胞集団として定義するために、補足図S2で提供されています。 ゲート戦略 (図 1)プライマリゲート:前方散乱領域(FSC-A)[x軸]と側方散乱領域(SSC-A)[y軸]を調整して、ゲート領域にミクログリア集団を含め、細胞の破片を除外します。 前方散布図領域(FSC-A)[x軸]と前方散布図高さ(FSC-H)[y軸]を調整して、ダブレットを除外します。シングレットは、このドット プロットでは対角線として表示されます。 CD11b-PECy7 [y軸]とCD45-APC [x軸]を調整し、CD11bの表面レベルが高く、CD45が中程度の集団をミクログリアとしてゲートします。 FITC[y-axis]ネガティブゲートの死細胞を除外します。オプション:FITC陰性ゲートでLy6CおよびLy6G-FITCに陽性の細胞も除外して、CNS関連マクロファージを解析から除外します。注:生細胞とは対照的に、膜が損なわれた死細胞は、固定可能な生存率色素が細胞質に入ることを可能にし、タンパク質標識の量を増加させる18。したがって、死細胞は、定義されたゲートに含まれる生細胞よりも明るくなります。 CD45-APC [x軸]とvGLUT1-PE [y軸]を調整します。脾臓サンプルで陽性イベントが検出されない閾値ゲートを超える母集団(内部生物学的陰性コントロール、 図1E)は、サンプル中のvGLUT1陽性画分と見なされます。 2. ミクログリアによる粗シナプトソームの in vitro 飲み込みの検出 粗シナプトソーム調製物とpHrodo Red標識注:次の手順はすべて氷上で行う必要があります。手順 1.1 から 1.2 に従います。 氷冷した神経細胞培地1mLを入れたシャーレに脳を移し、海馬を慎重に解剖します。ペトリ皿は常に氷の上に置いてください。次のステップでミクログリアの分離に海馬を使用します。 脳の残りの部分(小脳と嗅球を除く)を1 mLのシナプスタンパク質抽出試薬で満たされたDounceホモジナイザーに移し、緩い乳棒を使用して組織を約~30回のストライクで穏やかに解離します。抽出試薬10 mLあたり1錠のプロテアーゼ阻害剤を補充し、製造元の指示に従ってシナプトソームを分離します。.注:SynPER19などのシナプスタンパク質抽出試薬は、生物学的に活性なシナプス前およびシナプス後タンパク質を含むシナプトソームを調製するために使用されます。 粗シナプトソームペレットを500μLの0.1 M Na2CO3 溶液に溶解します。シナプトソームサンプルを10 μLの0.2 mM pHrodo Redで染色します。粗シナプトソームサンプルを室温(24-25°C)で1.5時間、穏やかに攪拌しながらインキュベートします。 1 mLの冷たくしたDPBSをサンプルに加え、全速力(20,815 × g)で1分間遠心分離し、上清を吸引します。 ステップ2.1.5を合計7回繰り返して、結合していない過剰なpHrodo Redをサンプルから取り除きます。 最後の遠心分離後、標準的なBCAアッセイを実施して、サンプルのタンパク質濃度を定量します。 オプション:液体窒素を使用して、5% DMSOでDPBS中のシナプトソームサンプルを急速凍結し、-80°Cで3週間保存します。 チューブをアルミホイルで覆い、光の露出を最小限に抑えます。 In vitro 新たに単離された成体ミクログリアを用いた粗シナプトソーム包み込みアッセイaCSFを調製し、95%O2:5%CO2 で30分間平衡化します。注:手順2.2.2-2.2.4については、パパインベースの消化液の調製について製造元の指示に従ってください。. パパインキットの バイアル2 に4mLのaCSFを加えます。バイアルを37°Cのウォーターバスに~10分間置き、パパイン溶液が透明になるまで待ちます。 パパインキットの バイアル3 に400 μLのaCSFを加えます。ゆっくりとピペッティングして~10回穏やかに混合します。 バイアル3からバイアル2に200μLを添加します(ステップ2.2.3で再構築)。バイアル3の残りの部分を保存します。 ステップ2.1.2で解剖した海馬を取り、メスを使用して解剖した海馬をミンチにします。 細かく刻んだ海馬を、ステップ2.2.5で調製した2mLの酵素溶液で満たされた組織解離チューブに移します。チューブを組織解離器にセットし、プログラムを実行します: 37C_ABDK_01 (~30分かかります)。 サンプルを37°Cのウォーターバスに~20分間入れ、1mLのピペットを使用して5分ごとに混合物を漉動し、気泡を作らないようにします。注:このプロセスは、組織が完全に解離し、効率的な解離を確保するために完全に均質に見えるまで続ける必要があります。以下のすべての遠心分離ステップは、特に指定がない限り、4 °Cで実行されます。 曇った細胞懸濁液を新しい15 mLチューブに慎重に取り出し、300 × g で5分間遠心分離します。 この5分間で、サンプルごとに次の洗浄ミックス(5 mL)を調製します。パパインキットに含まれている500μLの再溶解アルブミン-オボムコイド阻害剤溶液を4.5mLのaCSFに加えます。ステップ2.2.5のバイアル3の残りの溶液を洗浄ミックスに加えます。 ステップ2.2.8の上清を捨て、すぐに細胞ペレットを洗浄ミックス溶液に再懸濁します。 サンプルを70 μmフィルターに通し、新しい5 mLマイクロ遠心チューブに通します。サンプルを300 × g で5分間遠心分離します。 ステップ1.7-1.9で前述したPercollグラジエント遠心分離ステップに進みます。 MACS染色バッファーにゆっくりとピペッティングして、細胞を慎重に再懸濁します。サンプルを4°Cで15分間インキュベートします。 各サンプルに1 mLのMACSバッファーを加え、300 × g で8分間遠心分離します。 細胞を500 μLのMACSバッファーに再懸濁します。 ポジティブセレクションカラムをマグネティックセパレーターに配置します。カラムを3 mLのMACS Bufferですすいで平衡化します。 500 μLの細胞懸濁液を穏やかに混合し、カラムに塗布します。カラムを3 mLのMACS Bufferで3回洗浄します。 マグネティックセパレーターからカラムを取り外し、15 mL のコニカルチューブに置きます。5 mLのMACSバッファーをカラムに加え、すぐにプランパーを使用して細胞を洗い流します。サンプルを300 × g で10分間遠心分離します。 この期間中に、DPBS中に20mLの40Sを調製します。サンプルあたり1 mLのDMEMを37°Cまでウォーターバスで予温します。 最終細胞ペレットを予熱したDMEM1 mLに溶解します。24ウェルプレートのウェルあたり500 μLの予熱済みDMEMに約150,000〜200,000個の細胞を播種します。対照として、1〜2個の追加のウェルに同数の細胞を播種します。光学顕微鏡を使用して、すべてのウェル内の細胞のコンフルエンシーを確認します。注:標的脳領域が海馬または比較的小さな脳領域である場合、サンプル(n)ごとに5匹のマウスをプールして、~150,000のミクログリアを分離できます。全脳の場合、n個あたり1匹のマウスで、両方の単離プロトコルを使用して同数の細胞を得るのに十分です。あるいは、~40,000個の細胞を最終容量100 μLの96ウェルプレートに播種して、エンガルフメントアッセイを開始することもできます。これにより、分析される細胞の数が減りますが、nあたりに使用されるマウスの数も減少します。DMEMにおけるFCSの欠乏によるタンパク質欠乏は、食作用を引き起こします。 プレートをインキュベーター内で1〜2時間インキュベートします(37°Cおよび5%CO2)。注:このステップは、機能的巻き込みアッセイの開始前に、単離手順のストレスを受けやすい影響から細胞が回復することを目的としています。 各ウェルから250 μLの培地を非常にゆっくりと取り出し、各ウェルに250 μLの新鮮な予熱DMEMを加え、上部に3 μgのpHRodo Red標識シナプトソームを加えます。光学顕微鏡を使用して、すべてのウェルの細胞の密度を確認します。ネガティブコントロールウェルの場合、細胞を播種した追加のウェルに同量の非標識シナプトソームを追加します。 テストウェルの場合、ウェル1に細胞のみが含まれていることを確認してください。ウェル2には、細胞+非標識シナプトソームが含まれています。well-3には細胞+ 3μgのpHrodo Redが含まれています。ウェル4にはDMEM + 3 μgのpHrodo Redが含まれています。 インキュベーター内で細胞をシナプトソームと2時間インキュベートします(37°Cおよび5%CO2)。 培地を取り出し、冷たいDPBSでウェルを洗います。ウェルあたり200 μLのトリプシン/EDTA溶液を添加して、細胞を35秒間剥離します。 1ウェルあたり1 mLの40% FBSをDPBSに添加し、ストレーナーを介して細胞を5 mLポリプロピレンチューブに移します。このプロセス中は、プレートとチューブの両方を氷の上に置いて、細胞の剥離を促進します。 500 μLの氷冷DPBSを使用して各ウェルを2回洗浄します。収集したサンプルを500 × g で5分間遠心分離します。 100 μLのFACSバッファーに1/200 CD16/CD32を含有する染色溶液に細胞を再懸濁し、氷上で10分間インキュベートします。 インキュベーション後、CD11bとCD45をそれぞれ1/100の最終濃度で染色液に加えます。暗所でサンプルを4°Cで20分間インキュベートします。 サンプルを1 mLのFACSバッファーで洗浄し、300 × g で10分間遠心分離します。 ペレットを250 μLのFACSバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーを使用して少なくとも合計100,000のイベントを記録します。CD11b++/CD45+ ミクログリア由来の pHrodo Red 蛍光強度を解析します。 ゲート戦略 (図 2C)プライマリゲートの調整:前方散乱領域(FSC-A)[x軸]および側方散乱領域(SSC-A)[x軸]を使用して、ゲート領域にミクログリア集団を含め、細胞の破片を除外します。 前方散布図領域(FSC-A)[x軸]と前方散布図高さ(FSC-H)[y軸]を調整して、ダブレットを除外します。シングレットは、このドット プロットでは対角線として表示されます。 CD11b-PECy7 [y軸]とCD45-APC [x軸]を調整し、表層レベルの高いCD11bと中程度のCD45を持つ集団をミクログリアとしてゲートします。 この集団からpHrodo-PEの蛍光強度の中央値を計算します。非標識シナプトソームでインキュベートした細胞をネガティブコントロールと同じものを使用してください。