Hier stellen wir zwei Protokolle zur Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von vGLUT1-positiven Synapsen und pHRodo Red markierten rohen Synaptosomen mittels Durchflusszytometrie vor.
Mikroglia spielen eine zentrale Rolle bei der synaptischen Verfeinerung im Gehirn. Die Analyse der Mikroglia-Verschlingung von Synapsen ist für das Verständnis dieses Prozesses unerlässlich; Die derzeit verfügbaren Methoden zur Identifizierung des Mikroglia-Engulfments von Synapsen, wie die Immunhistochemie (IHC) und die Bildgebung, sind jedoch aufwändig und zeitintensiv. Um dieser Herausforderung zu begegnen, stellen wir hier in vitro und in vivo* Assays vor, die eine schnelle und hohe Durchsatzquantifizierung des Mikroglia-Engulfments von Synapsen mittels Durchflusszytometrie ermöglichen.
Im in vivo* -Ansatz führten wir eine intrazelluläre vGLUT1-Färbung nach der Isolierung frischer Zellen aus adulten Mausgehirnen durch, um die Verschlingung von vGLUT1+ -Synapsen durch Mikroglia zu quantifizieren. Im in vitro Synaptosomen-Engulfment-Assay verwendeten wir frisch isolierte Zellen aus dem adulten Mausgehirn, um den Engulfment von pHrodo Red markierten Synaptosomen durch Mikroglia zu quantifizieren. Zusammen bieten diese Protokolle einen zeiteffizienten Ansatz zur Quantifizierung des Mikroglia-Engulfments von Synapsen und stellen vielversprechende Alternativen zu arbeitsintensiven bildanalysebasierten Methoden dar. Durch die Rationalisierung der Analyse können diese Assays zu einem besseren Verständnis der Rolle von Mikroglia bei der synaptischen Verfeinerung in verschiedenen Krankheitsmodellen beitragen.
Mikroglia sind die residenten Immunzellen des Zentralnervensystems (ZNS)1. Sie scannen ständig ihre Mikroumgebung und sorgen für Überwachung 1,2. Darüber hinaus interagieren sie häufig mit Synapsen und vermitteln eine Feinabstimmung der synaptischen Aktivität3. So haben sie sich zu einem wichtigen Akteur im Prozess der synaptischen Verfeinerung entwickelt.
Die Rolle der Mikroglia bei der synaptischen Verfeinerung durch die Verschlingung von Synapsen wurde von verschiedenen Forschungsgruppengezeigt 3,4,5,6,7. Störungen in diesem Prozess können zur Pathologie von neurologischen Entwicklungsstörungen und neurodegenerativen Erkrankungen wie Schizophrenie und Alzheimer beitragen8. Eine aberrante synaptische Verfeinerung durch Mikroglia wurde bereits in verschiedenen Mausmodellen neurologischer Erkrankungen nachgewiesen 5,9,10. Daher ist die Identifizierung unterschiedlicher Mechanismen, die dem Mikroglia-Engulfment von Synapsen zugrunde liegen, von größter Bedeutung für das Verständnis der Pathophysiologie von neurologischen Entwicklungsstörungen und neurodegenerativen Erkrankungen8.
Die gezielte Engulfmentierung von Synapsen in den Mikroglia birgt ein großes Potenzial, um sowohl in das Fortschreiten der Krankheit einzugreifen als auch Einblicke in die zugrunde liegenden Mechanismen von neurologischen Entwicklungsstörungen und neurodegenerativen Erkrankungen zu gewinnen. Um solche Untersuchungen zu erleichtern, sind schnelle Ansätze mit hohem Durchsatz erforderlich. Aktuelle methodische Ansätze umfassen in vivo-, ex vivo– und in vitro-Assays, die den Nachweis von synaptischem Material innerhalb von Mikroglia ermöglichen. Im Allgemeinen stützt sich der Nachweis des Mikroglia-Engulfments von Synapsen stark auf immunhistochemische (IHC) und mikroskopiebasierte Ansätze 5,6,11, die arbeitsintensiv sind und Einschränkungen bei der Analyse einer großen Anzahl von Mikroglia aufweisen.
Angesichts dieser technischen Einschränkungen ist die Erforschung alternativer Methoden unerlässlich. Um dies zu überwinden, haben wir einen auf Durchflusszytometrie basierenden Ansatz optimiert, der eine effiziente, unvoreingenommene und hochdurchsatzbasierte Analyse des Mikroglia-Engulfments von Synapsen ermöglicht. Wir haben den Hippocampus aufgrund seines hohen Grades an synaptischem Umbau und Plastizität als Hauptregion von Interesse gewählt12, aber das Protokoll kann an verschiedene Hirnregionen angepasst werden. Während die Durchflusszytometrie bereits in früheren Studien zum Nachweis des Mikroglia-Engulfments der Synapsen 13,14,15 eingesetzt wurde, stellen wir hier eine Schritt-für-Schritt-Methodik unter Verwendung eines derzeit kommerziell erhältlichen, Fluorophor-konjugierten vGLUT1-Antikörpers zur Verfügung. Darüber hinaus bieten wir einen ergänzenden in vitro Ansatz für das Hochdurchsatz-Screening des mikroglialen Engulfments von synaptischem Material unter Verwendung von rohen Synaptosomen an.
Die synaptische Verfeinerung durch Mikroglia-Synapsen-Interaktion ist ein faszinierendes Forschungsgebiet innerhalb der Neuroimmunologie, das vielversprechende Einblicke in die Rolle von Mikroglia bei neurodegenerativen und neurologischen Entwicklungsstörungen bietet. Im Jahr 2011; Paolicelli et al. lieferten Hinweise auf das Vorhandensein von synaptischem Material in Mikroglia und gaben Aufschluss darüber, wie sie am Prozess des synaptischen Engulfments beteiligt sind4. Eine weitere faszinierende Studie verwendete Zeitraffer-Bildgebung und ein ex vivo organotypisches Hirnschnittkulturmodell und berichtete, dass Mikroglia an einem phagozytären Prozess teilnehmen, der als Trogozytose bekannt ist, bei dem sie präsynaptische Strukturen und nicht die gesamte synaptische Struktur verschlingen23. Eine sehr aktuelle Veröffentlichung mit einem neuen transgenen Mausmodell, das die Messung der Phagozytose in intaktem Gewebe ermöglicht, zeigte die Beschneidung durch Bergmann-Gliazellen in vivo nach motorischem Lernen24. Somit gibt es genügend Hinweise auf die Beteiligung von Gliazellen am synaptischen Engulfment, einschließlich der Mikroglia. Das Ausmaß, in dem diese Mikrogliafunktion den dynamischen und selektiven Prozess der synaptischen Beschneidung beeinflusst, erfordert jedoch weitere Nachweise.
Nichtsdestotrotz dient die Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von Synapsen als wertvoller Indikator und bietet einen teilweisen Einblick in die komplexe Dynamik von Mikroglia-Synapsen-Interaktionen, insbesondere der synaptischen Verfeinerung. Eine umfassende Übersichtsarbeit hat die aktuellen Protokolle zur Untersuchung des Mikroglia-Engulfments von Synapsen zusammengefasst25. Wir möchten betonen, dass unsere Protokolle auf der Grundlage bestehender Protokolle optimiert sind, die bereits im Einsatz sind. Die in dieser Studie vorgestellten Methoden ermöglichen eine schnelle und hohe Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von Synapsen in verschiedenen präparierten Hirnregionen. Je nach Hirnregion ist für beide Methoden eine Analyse von mindestens 10.000 Mikrogliazellen in maximal zwei Tagen möglich, was sie für die parallele Testung mehrerer Mausmodelle wertvoll macht.
Wir erkennen an, dass die Quantifizierung von vGLUT1+ -Mikroglia sowohl in vivo als auch kurzfristiges ex vivo Engulfment bis zum Fixierungsschritt umfasst. Daher schlagen wir vor, dass unser Assay eine schnelle und zuverlässige Möglichkeit zur Quantifizierung von synaptischem Material in Mikroglia darstellt, als ersten Schritt vor der In-vivo-Validierung mit Ansätzen wie IHC.
Ein weiterer Nachteil der durchflusszytometrischen Analyse ist die eingeschränkte Verfügbarkeit von Antikörpern für synaptische Marker, insbesondere für inhibitorische Synapsen. Es ist schwierig, kommerziell verfügbare, direkt konjugierte Antikörper zu finden, die ein helles Signal für diese Marker zeigen. Angesichts der umfangreichen Optimierungszeit, die erforderlich ist, um verschiedene Antikörper zu testen, die auf synaptische Marker abzielen, ist es wichtig, die gut optimierten Verfahren für die intrazelluläre Färbung mit verschiedenen Antikörpern mit der wissenschaftlichen Gemeinschaft zu teilen, wie wir es hier mit dieser Studie tun.
In Bezug auf die Datenanalyse in dieser Studie haben wir Isotypkontrollen als technische Negativkontrollen verwendet, um unspezifische Bindungen des vGLUT1-Antikörpers zu berücksichtigen, da sie eine Schätzung für die unspezifische Bindung eines Antikörpers in einer Probe liefern und gleichzeitig durchflusszytometrische Assays optimieren26. Isotypkontrollen wurden jedoch größtenteils für die Detektion des unspezifischen Hintergrundsignals aus den Oberflächenfärbeverfahren optimiert und sind für intrazelluläre Färbekontrollen nicht optimal27,28. Daher sollte man sich nicht darauf verlassen, dass sie bei der intrazellulären Färbung zwischen der negativen und der positiven Population unterscheiden, die Fixierungs- und Permeabilisierungsschritte umfasst, die sich auf den Antigennachweis, die Autofluoreszenz und die Fluorophorhelligkeit auswirken können29. Solche intrazellulären Färbeverfahren erfordern die Verwendung geeigneter biologischer interner Kontrollen, um die positive Zellpopulation zu definieren, die für einen intrazellulären Marker gefärbt wurde29. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass wir ein intrazelluläres Färbeprotokoll verwenden, verwendeten wir eine interne biologische Negativkontrolle (Milzmakrophagen) und definierten die Grenze zwischen der positiven und der negativen Population anhand der Milzmakrophagen, die von denselben Mäusen isoliert wurden. Wir unterschieden die positive Population oberhalb des Gates, an der es keine vGLUT1-positiven Ereignisse gibt, von den Milzmakrophagen, die als biologische Negativkontrolle dienen (Abbildung 1).
Beide Methoden, die in dieser Studie vorgestellt werden, bieten ein großes Potenzial für die erste Analyse des Mikroglia-Engulfments von Synapsen in einer schnellen und hohen Durchsatzweise, indem über 10.000 Zellen aus kleinen Hirnregionen analysiert werden, was mit Standard-Mikroskopietechniken nicht möglich ist. Daher bieten diese Methoden einen signifikanten Vorteil gegenüber arbeits- und zeitintensiven Methoden und bieten darüber hinaus eine umfassendere Analyse des synaptischen Engulfments, indem sie eine Analyse einer größeren Anzahl von Mikroglia ermöglichen. Darüber hinaus ist die in dieser Studie vorgestellte in vitro-Methode besonders nützlich, um den Einfluss verschiedener Behandlungen auf das Mikroglia-Engulfment von Synapsen zu testen. Es ermöglicht die direkte Quantifizierung der Wirkung der Behandlung auf Mikroglia ohne die Störfaktoren, die mit anderen Zelltypen verbunden sind. Darüber hinaus dient es als indirekter Ansatz, um einen möglichen Einfluss der Mikroumgebung oder anderer Zelltypen auf den Prozess des synaptischen Engulfments nachzuweisen. Daher schließen wir, dass diese Methoden, insbesondere wenn sie parallel eingesetzt werden, intuitive und vorteilhafte Alternativen für die Analyse des Mikroglia-Engulfments von synaptischen Materialien bieten.
Die Analyse frisch isolierter Mikroglia mittels FACS-basierter phagozytärer Assays ex vivo kann jedoch einige Nachteile mit sich bringen. Erstens ist es entscheidend, gut optimierte Protokolle zu verwenden, die frisch isolierte Mikroglia aus dem erwachsenen Gehirn erzeugen und gleichzeitig die Ex-vivo-Aktivierung und Stressreaktion von Mikroglia vermeiden. Dissing-Olesen et al. verwendeten transkriptionelle und translationale Inhibitoren, um dieses Problem zu lösen, indem sie ein Gewebedissoziationsverfahren bei 37 °C30 anwandten. Mattei et al. hingegen präsentierten ein kaltes, mechanisches Gewebedissoziationsprotokoll, um die Induktion der ex vivo-Expression von stressassoziierten Genenzu vermeiden 16 , und wir passten dieses Protokoll im ersten Abschnitt an, um eine ex vivo Aktivierung der stressassoziierten Mikroglia-Reaktion vor der intrazellulären vGLUT1-Färbung zu vermeiden. Wir verwendeten ein enzymatisches Gewebedissoziationsprotokoll im zweiten Abschnitt vor dem in vitro Synaptosomen-Engulfment-Assay unter Berücksichtigung der höheren Ausbeute an Mikroglia nach Papain-basierter Gewebedissoziation (Daten nicht gezeigt). Mikroglia verbleiben unter Kulturbedingungen unvermeidlich bei 37 °C, wenn sie mit Synaptosomen inkubiert werden, und eine Inkubation bei 37 °C kann in der Tat Veränderungen in den Mikroglia induzieren, was ein häufiger Nachteil aller In-vitro-Assays und Zellkulturverfahren ist. Daher schlagen wir vor, beide vorgestellten Protokolle parallel zu verwenden, um zu einer breiteren Schlussfolgerung in Bezug auf das Mikroglia-Engulfment von Synapsen zu gelangen.
Darüber hinaus ist es wichtig, die Gating-Strategie zur Selektion von CD11b++/CD45+ -Mikroglia sorgfältig zu definieren, indem das Vorhandensein anderer Immunzellen im Hirnparenchym berücksichtigt wird, die diese Marker ebenfalls exprimieren31. Noch wichtiger ist, dass es bei der Auswahl von Markern, die spezifisch auf Mikroglia abzielen (z. B. TMEM119, P2RY12), wichtig ist zu berücksichtigen, dass sie während pathologischer und entzündlicher Zustände Veränderungen in ihrem Expressionsniveau erfahren können32, und solche Veränderungen sollten vor der Einrichtung des FACS-Gremiums zur Quantifizierung des Mikroglia-Engulfments von Synapsen berücksichtigt werden. Abschließend ist es wichtig zu betonen, dass keine der zuvor diskutierten Methoden, einschließlich der IHC- und mikroskopiebasierten in vivo-Ansätze , allein das aktive und selektive Beschneiden von Synapsen durch Mikroglia erfassen kann. Diese Methoden sind nicht in der Lage, die aktive Beschneidung durch Mikroglia von der passiven Beschneidung von synaptischen Trümmern innerhalb des Hirnparenchyms zu unterscheiden. Daher ist es bei der Auswertung und Diskussion der Daten unerlässlich, klar zwischen diesen unterschiedlichen Konzepten zu unterscheiden.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Regina Piske für die technische Unterstützung bei der Isolierung von Mikroglia und Dr. Caio Andreta Figueiredo für seine Hilfe bei der mikroskopischen Bildaufnahme in der ergänzenden Abbildung S1. Wir danken der FACS-Einrichtung des MDC für die technische Unterstützung. Dieses Manuskript stellt teilweise die repräsentativen Zahlen dar, die im Jahr 2024 beim Brain, Behavior and Immunity Journal eingereicht wurden. Abbildung 1A, Abbildung 2A und ergänzende Abbildung S3A wurden mit Hilfe von BioRender.com erstellt.
1 mL Dounce Homogenizer | Active Motif | Cat# 40401 | |
5 mL Tubes | Eppendorf | Cat# 0030119452 | |
Anti-CD11b | ThermoFisher Scientific | Cat# 25-0112-82 | |
Anti-CD45 | BD | Cat# 559864 | |
Anti-Ly6C | BD | Cat# 553104 | |
Anti-Ly6G | BD | Cat# 551460 | |
BCA Protein Assay Kit | Pierce | Cat# 23227 | |
C-Tubes | Miltenyi Biotech | Cat# 130-096-334 | |
CD11b MicroBeads | Miltenyi Biotech | Cat# 130-093-634 | |
CD16/CD32 Antibody | Thermo Fisher Scientific | Cat#14-0161-82 | |
Cytofix/Cytoperm Kit | BD | Cat# 554714 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat# 41966029 | |
Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | Cat# 14190144 | |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes | Thermo Fisher Scientific | Cat# 08-771-23 | |
fixable viability dye | Thermo Fisher Scientific | Cat# L34969 | |
Hibernate A medium | ThermoFisher | Cat# A1247501 | |
LS-columns | Miltenyi Biotech | Cat# 130-042-401 | |
Papain Dissociation System | Worthington | Cat# LK003150 | |
Percoll | Th.Geyer | Cat# 17-0891-02 | |
Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11339283 | |
pHrodoRed | Thermo Fisher Scientific | Cat# P36600 | |
Protease inhibitor | Roche | Cat# 5892970001 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | Cat# 11814389001 | |
Steritop E-GP Sterile Filtration System | Merck | Cat# SEGPT0038 | |
SynPer Solution | ThermoFisher | Cat# 87793 | |
vGLUT1 Antibody | Miltenyi Biotech | Cat# 130-120-764 |