Hier presenteren we twee protocollen om microgliale inslokking van vGLUT1-positieve synapsen en pHRodo Red-gelabelde ruwe synaptosomen te kwantificeren met behulp van flowcytometrie.
Microglia spelen een cruciale rol bij synaptische verfijning in de hersenen. Analyse van microgliale inslokking van synapsen is essentieel om dit proces te begrijpen; de momenteel beschikbare methoden voor het identificeren van microgliale overspoeling van synapsen, zoals immunohistochemie (IHC) en beeldvorming, zijn echter arbeidsintensief en tijdrovend. Om deze uitdaging aan te gaan, presenteren we hier in vitro en in vivo* assays die een snelle en high-throughput kwantificering van microgliale inslokking van synapsen mogelijk maken met behulp van flowcytometrie.
In de in vivo* benadering voerden we intracellulaire vGLUT1-kleuring uit na verse celisolatie uit volwassen muizenhersenen om de verzwelging van vGLUT1+- synapsen door microglia te kwantificeren. In de in vitro synaptosoomoverspoelingstest gebruikten we vers geïsoleerde cellen uit de hersenen van volwassen muizen om de overspoeling van pHrodo Red-gelabelde synaptosomen door microglia te kwantificeren. Deze protocollen samen bieden een tijdbesparende benadering voor het kwantificeren van microgliale overspoeling van synapsen en vertegenwoordigen veelbelovende alternatieven voor arbeidsintensieve op beeldanalyse gebaseerde methoden. Door de analyse te stroomlijnen, kunnen deze testen bijdragen aan een beter begrip van de rol van microglia in synaptische verfijning in verschillende ziektemodellen.
Microglia zijn de residente immuuncellen van het centrale zenuwstelsel (CZS)1. Ze scannen voortdurend hun micro-omgeving en zorgen voor bewaking 1,2. Bovendien interageren ze vaak met synapsen en bemiddelen ze een fijnafstemming van de synaptische activiteit3. Ze zijn dus naar voren gekomen als een sleutelspeler in het proces van synaptische verfijning.
De rol van microglia in synaptische verfijning door het opslokken van synapsen is aangetoond door verschillende onderzoeksgroepen 3,4,5,6,7. Verstoringen in dit proces kunnen bijdragen aan de pathologie van neurologische ontwikkelingsstoornissen en neurodegeneratieve aandoeningen zoals schizofrenie en de ziekte van Alzheimer8. Afwijkende synaptische verfijning door microglia is al gedetecteerd in verschillende muizenmodellen van neurologische aandoeningen 5,9,10. Daarom is de identificatie van verschillende mechanismen die ten grondslag liggen aan microgliale inslokking van synapsen van het grootste belang voor het begrijpen van de pathofysiologie van neurologische ontwikkelings- en neurodegeneratieve aandoeningen8.
Het aanpakken van microgliale inslokking van synapsen heeft een groot potentieel voor zowel het ingrijpen in ziekteprogressie als het verkrijgen van inzicht in de onderliggende mechanismen van neurologische ontwikkelings- en neurodegeneratieve aandoeningen. Om dergelijke onderzoeken te vergemakkelijken, is er behoefte aan snelle en high-throughput benaderingen. De huidige methodologische benaderingen omvatten in vivo, ex vivo en in vitro assays die de detectie van synaptisch materiaal binnen microglia mogelijk maken. Over het algemeen is de detectie van microgliale overspoeling van synapsen sterk afhankelijk van immunohistochemie (IHC) en op microscopie gebaseerde benaderingen 5,6,11, die arbeidsintensief zijn en beperkingen vertonen bij het analyseren van een groot aantal microglia.
Gezien deze technische beperkingen is het absoluut noodzakelijk om alternatieve methodologieën te verkennen. Om dit te verhelpen, hebben we een op flowcytometrie gebaseerde aanpak geoptimaliseerd, die een efficiënte, onbevooroordeelde en high-throughput analyse van microgliale overspoeling van synapsen mogelijk maakt. We kozen de hippocampus als het belangrijkste interessegebied vanwege de hoge mate van synaptische remodellering en plasticiteit12, maar het protocol kan worden aangepast aan verschillende hersengebieden. Hoewel flowcytometrie al in eerdere studies is gebruikt om microgliale overspoeling van synapsen 13,14,15 te detecteren, bieden we hierin een stapsgewijze methodologie waarbij gebruik wordt gemaakt van een momenteel in de handel verkrijgbaar, fluorofoor-geconjugeerd vGLUT1-antilichaam. Bovendien bieden we een aanvullende in vitro benadering voor high-throughput screening van microgliale inslokking van synaptisch materiaal door gebruik te maken van ruwe synaptosomen.
Synaptische verfijning door interactie tussen microglia en synaps is een intrigerend studiegebied binnen de neuro-immunologie en biedt veelbelovende inzichten in de rol van microglia bij neurodegeneratieve en neurologische ontwikkelingsstoornissen. In 2011; Paolicelli et al. leverden bewijs van de aanwezigheid van synaptisch materiaal in microglia, wat licht werpt op hun betrokkenheid bij het proces van synaptische inslokking4. Een andere intrigerende studie maakte gebruik van time-lapse-beeldvorming en een ex vivo organotypisch hersenplakcultuurmodel en meldde dat microglia zich bezighouden met een fagocytisch proces dat bekend staat als trogocytose, waarbij ze presynaptische structuren overspoelen in plaats van de volledige synaptische structuur23. Een zeer recente publicatie, waarbij gebruik werd gemaakt van een nieuw transgeen muismodel dat het mogelijk maakt om fagocytose in intact weefsel te meten, toonde snoeien door Bergmann-glia in vivo bij motorisch leren24. Er is dus voldoende bewijs dat wijst op de betrokkenheid van gliacellen bij synaptische overspoeling, waaronder microglia. De mate waarin deze microgliale functie het dynamische en selectieve proces van synaptisch snoeien beïnvloedt, vereist echter verder bewijs.
Niettemin dient de kwantificering van microgliale inslokking van synapsen als een waardevolle indicator en geeft gedeeltelijk inzicht in de complexe dynamiek van microglia-synapsinteracties, met name synaptische verfijning. Een uitgebreid overzicht heeft een samenvatting gegeven van de huidige protocollen die worden gebruikt om microglia-overspoeling van synapsen te onderzoeken25. We willen benadrukken dat onze protocollen zijn geoptimaliseerd op basis van bestaande protocollen die al in gebruik zijn. De methoden die in deze studie worden gepresenteerd, zorgen voor een snelle en high-throughput kwantificering van microgliale inslokking van synapsen in verschillende ontlede hersengebieden. Afhankelijk van het hersengebied is voor beide methodologieën een analyse van ten minste 10.000 microgliacellen in maximaal twee dagen mogelijk, waardoor ze waardevol zijn voor het parallel testen van meerdere muismodellen.
We erkennen dat de kwantificering van vGLUT1+ microglia zowel in vivo als op korte termijn ex vivo slokatie omvat tot de fixatiestap. Daarom stellen we voor dat onze test een snelle en betrouwbare manier biedt om synaptisch materiaal in microglia te kwantificeren als een eerste stap voorafgaand aan in vivo validatie met behulp van benaderingen zoals IHC.
Een ander nadeel van de flowcytometrie-analyse is de beperkte beschikbaarheid van antilichamen voor synaptische markers, met name voor remmende synapsen. Het is een uitdaging om in de handel verkrijgbare, direct geconjugeerde antilichamen te vinden die een helder signaal voor deze markers laten zien. Gezien de uitgebreide optimalisatietijd die nodig is om verschillende antilichamen gericht op synaptische markers te testen, is het belangrijk om de goed geoptimaliseerde procedures te delen met de wetenschappelijke gemeenschap voor intracellulaire kleuring met verschillende antilichamen, zoals we hier doen met deze studie.
Wat de gegevensanalyse in deze studie betreft, gebruikten we isotypecontroles als technische negatieve controles om rekening te houden met niet-specifieke bindingen van het vGLUT1-antilichaam, aangezien ze een schatting geven voor niet-specifieke binding van een antilichaam in een monster, terwijl ze op flowcytometrie gebaseerde assays optimaliseren26. De isotypecontroles zijn echter meestal geoptimaliseerd om het niet-specifieke achtergrondsignaal van de oppervlaktekleuringsprocedures te detecteren en zijn niet optimaal voor intracellulaire kleuringscontroles27,28. Daarom mag er niet op worden vertrouwd om onderscheid te maken tussen de negatieve en positieve populaties bij het uitvoeren van intracellulaire kleuring, waarbij fixatie- en permeabilisatiestappen nodig zijn die van invloed kunnen zijn op antigeendetectie, autofluorescentie en fluorofoorhelderheid29. Dergelijke intracellulaire kleuringsprocedures vereisen het gebruik van geschikte biologische interne controles om de positieve celpopulatie te definiëren die voor een intracellulaire marker is gekleurd29. Dus, gezien het feit dat we een intracellulair kleuringsprotocol gebruiken, gebruikten we een interne biologische negatieve controle (miltmacrofagen) en definieerden we de grens tussen de positieve en negatieve populaties volgens de miltmacrofagen geïsoleerd uit dezelfde muizen. We maakten een onderscheid tussen de positieve populatie boven de poort, waarbij er geen vGLUT1-positieve gebeurtenissen zijn, en de miltmacrofagen die dienen als de biologische negatieve controle (Figuur 1).
Beide methoden die in deze studie worden gepresenteerd, bieden een groot potentieel voor de eerste analyse van microgliale overspoeling van synapsen op een snelle en high-throughput manier, waarbij meer dan 10.000 cellen uit kleine hersengebieden worden geanalyseerd en dit is niet haalbaar met standaard microscopietechnieken. Daarom bieden deze methoden een aanzienlijk voordeel ten opzichte van arbeids- en tijdrovende methoden en bieden ze verder een uitgebreidere analyse van synaptische overspoeling door een analyse van een groter aantal microglia mogelijk te maken. Bovendien is de in vitro methode die in deze studie wordt gepresenteerd bijzonder nuttig voor het testen van de impact van verschillende behandelingen op de microgliale overspoeling van synapsen. Het maakt directe kwantificering van het effect van de behandeling op microglia mogelijk zonder de verstorende factoren die geassocieerd zijn met andere celtypen. Bovendien dient het als een indirecte benadering om een mogelijk effect van micro-omgeving of andere celtypen op het proces van synaptische overspoeling aan te tonen. Daarom concluderen we dat deze methoden, vooral wanneer ze parallel worden gebruikt, intuïtieve en voordelige alternatieven bieden voor de analyse van microgliale overspoeling van synaptische materialen.
De analyse van vers geïsoleerde microglia door FACS-gebaseerde fagocytische assays ex vivo kan echter enkele nadelen opleveren. Ten eerste is het van cruciaal belang om goed geoptimaliseerde protocollen te gebruiken die vers geïsoleerde microglia uit de volwassen hersenen genereren, terwijl ex vivo activering en stressrespons van microglia worden vermeden. Dissing-Olesen et al. gebruikten het gebruik van transcriptionele en translationele remmers om dit probleem op te lossen door gebruik te maken van een weefseldissociatieprocedure bij 37 oC30. Mattei et al., aan de andere kant, presenteerden een koud, mechanisch weefseldissociatieprotocol om ex vivo expressie van stress-geassocieerde genen16 te voorkomen en we hebben dit protocol in het eerste deel aangepast om ex vivo activering van stress-geassocieerde microglia-respons voorafgaand aan intracellulaire vGLUT1-kleuring te voorkomen. We gebruikten een enzymatisch weefseldissociatieprotocol in de tweede sectie voorafgaand aan de in vitro synaptosoomverzwelgingstest, rekening houdend met de hogere opbrengst van microglia na op papaïne gebaseerde weefseldissociatie (gegevens niet getoond). Microglia blijven onvermijdelijk op 37 °C onder kweekomstandigheden wanneer ze worden geïncubeerd met synaptosomen, en incubatie bij 37 °C kan inderdaad veranderingen in microglia veroorzaken als veel voorkomende nadelen van alle in-vitrotests en celkweekprocedures. Daarom stellen we voor om beide gepresenteerde protocollen parallel te gebruiken om tot een bredere conclusie te komen in termen van microgliale inslokking van synapsen.
Bovendien is het belangrijk om de poortstrategie voor het selecteren van CD11b++/CD45+ microglia zorgvuldig te definiëren door rekening te houden met de aanwezigheid van andere immuuncellen in het hersenparenchym die deze markers ook tot expressie brengen31. Wat nog belangrijker is, is dat bij het kiezen van markers die specifiek gericht zijn op microglia (bijv. TMEM119, P2RY12), het belangrijk is om te bedenken dat ze veranderingen in hun expressieniveaus kunnen ondergaan tijdens pathologische en inflammatoire aandoeningen32, en dergelijke veranderingen moeten worden overwogen voordat het FACS-panel wordt opgericht om microgliale overspoeling van synapsen te kwantificeren. Ten slotte is het essentieel om te benadrukken dat geen van de eerder besproken methoden, inclusief de op IHC en microscopie gebaseerde in vivo benaderingen, alleen het actief en selectief snoeien van synapsen door microglia kan vastleggen. Deze methoden zijn niet in staat om het actieve snoeien door microglia te onderscheiden van het passief opruimen van synaptisch puin in het hersenparenchym. Daarom is het bij het evalueren en bespreken van de gegevens absoluut noodzakelijk om een duidelijk onderscheid te maken tussen deze verschillende concepten.
The authors have nothing to disclose.
We danken Regina Piske voor haar technische assistentie bij de isolatie van microglia en Dr. Caio Andreta Figueiredo voor zijn hulp bij het verkrijgen van microscopiebeelden in aanvullende figuur S1. Wij danken de FACS-faciliteit van de MDC voor hun technische ondersteuning. Dit manuscript presenteert gedeeltelijk de representatieve cijfers die in 2024 zijn ingediend bij het Brain, Behavior and Immunity Journal. Figuur 1A, Figuur 2A en Aanvullende Figuur S3A zijn gemaakt met behulp van BioRender.com.
1 mL Dounce Homogenizer | Active Motif | Cat# 40401 | |
5 mL Tubes | Eppendorf | Cat# 0030119452 | |
Anti-CD11b | ThermoFisher Scientific | Cat# 25-0112-82 | |
Anti-CD45 | BD | Cat# 559864 | |
Anti-Ly6C | BD | Cat# 553104 | |
Anti-Ly6G | BD | Cat# 551460 | |
BCA Protein Assay Kit | Pierce | Cat# 23227 | |
C-Tubes | Miltenyi Biotech | Cat# 130-096-334 | |
CD11b MicroBeads | Miltenyi Biotech | Cat# 130-093-634 | |
CD16/CD32 Antibody | Thermo Fisher Scientific | Cat#14-0161-82 | |
Cytofix/Cytoperm Kit | BD | Cat# 554714 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat# 41966029 | |
Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | Cat# 14190144 | |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes | Thermo Fisher Scientific | Cat# 08-771-23 | |
fixable viability dye | Thermo Fisher Scientific | Cat# L34969 | |
Hibernate A medium | ThermoFisher | Cat# A1247501 | |
LS-columns | Miltenyi Biotech | Cat# 130-042-401 | |
Papain Dissociation System | Worthington | Cat# LK003150 | |
Percoll | Th.Geyer | Cat# 17-0891-02 | |
Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11339283 | |
pHrodoRed | Thermo Fisher Scientific | Cat# P36600 | |
Protease inhibitor | Roche | Cat# 5892970001 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | Cat# 11814389001 | |
Steritop E-GP Sterile Filtration System | Merck | Cat# SEGPT0038 | |
SynPer Solution | ThermoFisher | Cat# 87793 | |
vGLUT1 Antibody | Miltenyi Biotech | Cat# 130-120-764 |