Summary

Nano ve Mikrometre Boyutlu Veziküllerde Denge Dışı Metabolik Ağların İnşası

Published: April 12, 2024
doi:

Summary

Membran proteinlerinin yeniden yapılandırılması ve enzimlerin ve diğer suda çözünür bileşenlerin mikrometre altı ve mikrometre boyutundaki lipid veziküllerinde kapsüllenmesi için bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Saflaştırılmış bileşenler kullanarak entegre membran proteinleri, enzimler ve floresan bazlı sensörleri içeren karmaşık protein ağlarını veziküllere dahil etmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, biyoreaktörlerin tasarımı ve inşası ve karmaşık denge dışı metabolik reaksiyon ağlarının incelenmesi ile ilgilidir. Daha önce geliştirilmiş bir protokole göre (çoklu) membran proteinlerini büyük unilameller veziküllere (LUV’ler) yeniden yapılandırarak başlıyoruz. Daha sonra saflaştırılmış enzimler, metabolitler ve floresan bazlı sensörlerin (floresan proteinler veya boyalar) bir karışımını donma-çözülme-ekstrüzyon yoluyla kapsüllüyoruz ve dahil edilmemiş bileşenleri santrifüjleme ve/veya boyut dışlama kromatografisi ile çıkarıyoruz. Metabolik ağların performansı, floresan okuması ile ATP/ADP oranı, metabolit konsantrasyonu, dahili pH veya diğer parametreler izlenerek gerçek zamanlı olarak ölçülür. 100-400 nm çapındaki membran proteini içeren veziküllerimiz, mevcut ancak optimize edilmiş prosedürler kullanılarak dev-unilamellar veziküllere (GUV’ler) dönüştürülebilir. Yaklaşım, çözünür bileşenlerin (enzimler, metabolitler, sensörler) mikrometre boyutundaki veziküllere dahil edilmesini sağlar, böylece biyoreaktörlerin hacmini büyüklük sırasına göre yükseltir. GUV’leri içeren metabolik ağ, optik mikroskopi ile analiz edilmek üzere mikroakışkan cihazlarda tutulur.

Introduction

Aşağıdan yukarıya sentetik biyoloji alanı, biyoteknolojik 3,4 veya biyomedikal amaçlar 5,6,7,8 için (minimal) hücreler 1,2 ve metabolik biyoreaktörler oluşturmaya odaklanır. Sentetik hücrelerin inşası, araştırmacıların, doğal ortamların proteinlerini taklit eden iyi tanımlanmış koşullarda proteinleri (zar) incelemelerine olanak tanıyan, proteinlerin ve reaksiyon ağlarının ortaya çıkan özelliklerinin ve gizli biyokimyasal işlevlerinin keşfedilmesini sağlayan benzersiz bir platform sağlar9. Otonom olarak işleyen bir sentetik hücreye doğru bir ara adım olarak, canlı hücrelerin metabolik enerji korunumu, protein ve lipid sentezi ve homeostaz gibi temel özelliklerini yakalayan modüller geliştirilmiştir. Bu tür modüller sadece yaşam anlayışımızı geliştirmekle kalmaz, aynı zamanda tıp8 ve biyoteknoloji10 alanlarında da potansiyel uygulamalara sahiptir.

Transmembran proteinler, molekülleri hücrenin içine veya dışına taşıdıkları, sinyal verdikleri ve çevrenin kalitesine yanıt verdikleri ve çok sayıda biyosentetik rol oynadıkları için hemen hemen her metabolik ağın merkezinde yer alır. Bu nedenle, sentetik hücrelerdeki metabolik modüllerin mühendisliği, çoğu durumda integral ve/veya periferik membran proteinlerinin, spesifik lipitlerden ve yüksek bütünlükten (düşük geçirgenlik) oluşan bir membran çift tabakasına yeniden yapılandırılmasını gerektirir. Bu zar proteinlerinin kullanımı zordur ve özel bilgi ve deneysel beceriler gerektirir.

Fosfolipid veziküller içindeki zar proteinlerini yeniden oluşturmak için, çoğunlukla spesifik bir proteinin fonksiyon11,12, regülasyon13, kinetik özellikler14,15, lipid bağımlılığı15,16 ve/veya stabilite17’yi incelemek amacıyla çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemler, deterjanla çözündürülmüş proteininlipitlerin 18 varlığında sulu ortama hızlı bir şekilde seyreltilmesini, deterjanla çözündürülmüş proteinin deterjanla destabilize edilmiş lipid vezikülleri ile inkübe edilmesiyle deterjanların uzaklaştırılmasını ve deterjan(lar)ın polistiren boncuklar19 üzerine emilmesini veya deterjanların diyaliz veya boyut dışlama kromatografisi20 ile uzaklaştırılmasını içerir. Organik çözücüler, örneğin yağ-su interfazlarının21 oluşumu yoluyla lipid vezikülleri oluşturmak için kullanılmıştır, ancak integral membran proteinlerinin çoğu, bu tür çözücülere maruz kaldıklarında inaktive edilir.

Laboratuvarımızda, büyük unilameller veziküller (LUV’ler) oluşturmak için çoğunlukla membran proteinlerini deterjan emme yöntemiyle yeniden sulandırıyoruz19. Bu yöntem, çoklu zar proteinlerinin birlikte sulandırılmasına ve enzimlerin, metabolitlerin ve probların vezikül lümeninde kapsüllenmesine izin verir22,23. Membran proteini içeren LUV’ler, elektroformasyon24 veya jel destekli şişme25 ve membran proteinlerinin26 bütünlüğünü korumak için özel koşullar kullanılarak, suda çözünür bileşenlerin kapsüllenmesi ile / kapsüllenmemesi ile dev unilamellar veziküllere (GUV’ler) dönüştürülebilir.

Bu makale, L-arginin’in L-ornitin27’ye parçalanması yoluyla ATP’yi yeniden üreten denge dışı bir metabolik ağın LUV’lerinde sulandırılması için bir protokol sunmaktadır. ATP oluşumu, fosfolipid sentezi için önemli bir yapı taşı olan gliserol-3-fosfat (G3P) üretimi ile birleştirilir22,28. Metabolik yol, bir arginin/ornitin (ArcD) ve bir G3P/Pi antiporter (GlpT) olmak üzere iki integral membran proteininden oluşur. Ek olarak, ATP’nin geri dönüşümü için üç çözünür enzim (ArcA, ArcB, ArcC) gereklidir ve GlpK, L-arginin’in parçalanmasından elde edilen ATP’yi kullanarak gliserolü gliserol 3-fosfata dönüştürmek için kullanılır, yolun şematik bir genel bakışı için Şekil 1’e bakın. Bu protokol, lipitlerin veya proteinlerin sentezi veya hücrelerin bölünmesi için daha da karmaşık reaksiyon ağlarının gelecekteki inşası için iyi bir başlangıç noktasını temsil eder. Veziküllerin lipid bileşimi, çok çeşitli integral membran proteinlerinin aktivitesini destekler ve çeşitli moleküllerin veziküllerin içine veya dışına taşınması için optimize edilmiştir 27,29,30.

Figure 1
Şekil 1: ATP üretimi ve gliserol 3-fosfat sentezi ve atılımı için yola genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Kısacası, saflaştırılmış zar proteinleri (dodesil-β-D-maltosit, DDM içinde çözündürülmüş), proteinlerin zara yerleştirilmesine izin veren Triton X-100 ile destabilize edilmiş önceden oluşturulmuş lipid veziküllerine eklenir. Deterjan molekülleri daha sonra (yavaşça) aktive edilmiş polistiren boncukların eklenmesiyle uzaklaştırılır ve bu da iyi kapatılmış proteolipozomların oluşumuna neden olur. Çözünür bileşenler daha sonra veziküllere eklenebilir ve molekülleri membran füzyonu sürecinde yakalayan donma-çözülme döngüleri yoluyla kapsüllenebilir. Elde edilen veziküller oldukça heterojendir ve çoğu çok lamelli boyalıdır. Daha sonra, daha düzgün boyutta veziküller veren 400, 200 veya 100 nm gözenek boyutuna sahip bir polikarbonat filtreden ekstrüde edilirler; Gözenek boyutu ne kadar küçükse, veziküller o kadar homojen ve tek tiptir, ancak daha küçük bir iç hacim pahasına. Dahil edilmemiş proteinler ve küçük moleküller, boyut dışlama kromatografisi ile harici çözeltiden uzaklaştırılır. ProteoLUV’lar, jel destekli şişme ile mikrometre boyutunda veziküllere dönüştürülebilir ve bu proteoGUV’lar daha sonra toplanır ve mikroskobik karakterizasyon ve manipülasyon için bir mikroakışkan çip içinde tutulur. Şekil 2 , tam protokolün şematik bir genel bakışını göstermektedir.

Figure 2
Şekil 2: Mikrometre altı (LUV’ler) ve mikrometre boyutundaki (GUV’ler) lipid veziküllerinde membran proteinlerinin yeniden yapılandırılması ve enzimlerin ve suda çözünür bileşenlerin kapsüllenmesi için protokole genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sulandırma ve kapsülleme protokolleri iyi çalışır ve proteinlerin işlevselliği korunur, ancak proteoLUV’lar ve proteoGUV’lar boyut olarak heterojendir. Mikroakışkan yaklaşımlar 31,32, boyut olarak daha homojen olan mikrometre boyutunda veziküllerin oluşumuna izin verir, ancak zar proteinlerinin işlevsel olarak yeniden yapılandırılması genellikle mümkün değildir, çünkü çift tabakadaki artık çözücü proteinleri inaktive eder. ProteoLUV’lerin boyutları 100 ila 400 nm arasında değişir ve düşük enzim konsantrasyonlarında, kapsülleme eksik metabolik yollara sahip veziküllere yol açabilir (stokastik etkiler; bkz. Şekil 3). LUV’ler, ATP ve G3P gibi yapı taşlarının üretimi için burada gösterildiği gibi belirli metabolik modüller oluşturmak için idealdir. Bu tür proteoLUV’lar potansiyel olarak GUV’lerde kapsüllenebilir ve konakçı veziküller için organel benzeri bölmeler olarak hizmet edebilir.

Figure 3
Şekil 3: Çapı 100, 200 veya 400 nm olan vezikül başına molekül sayısı. (A) Kapsüllenmiş proteinler (enzimler, problar) 1-10 μM aralığında olduğunda. (B) Sulandırma, lipid başına 1 ila 1.000, 1 ila 10.000 ve 1 ila 100.000 membran proteini (mol / mol) arasında yapılır. Moleküllerin belirtilen konsantrasyonlarda kapsüllendiği ve bu protein-lipit oranlarında zara dahil edildiği varsayımını yapıyoruz. Bazı enzimler için, zarlara bağlandıklarını gördük, bu da veziküllerdeki görünür konsantrasyonlarını artırabilir. Kısaltma: LPR = Lipid-Protein-Oranı Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protocol

1. Genel hazırlık KimyasalÖnceden oluşturulmuş lipozomlar yapmak için lipitleri (toz halinde) CHCl3 içinde 25 mg / mL’ye çözün.NOT: Taze lipid stoklarının hazırlanması tercih edilir, ancak stok çözeltileri -20 °C’de birkaç hafta saklanabilir. Toz halindeki lipitlerle çalışmak, CHCl3’te zaten çözünmüş olan lipitleri kullanmaktan daha doğrudur. CHCl3 , cam pipetler ve/veya şırıngalar kullanılarak kullanılmalı ve CHCl<su…

Representative Results

Lipozomlarda çözünmüş zar proteinlerinin sulandırılması, önceden oluşturulmuş veziküllerin dengesizleştirilmesini gerektirir. Düşük miktarlarda Triton X-100 ilavesi, başlangıçta veziküllerin şişmesiyle ışık saçılımındaki artışa bağlı olarak 540 nm’de (A540) bir absorbans artışı ile sonuçlanır (Şekil 4). Maksimum A540 değeri, lipozomların deterjanla (Rsat) doyurulduğu noktadır, bundan sonra herhangi bir Trito…

Discussion

Mikrometre altı boyutta lipid veziküller (proteoLUV’ler) içeren (membran) proteinin sentezi ve proteoLUV’lerin dev-unilamellar veziküllere (proteoGUV’lar) dönüştürülmesi için bir protokol sunuyoruz. Protokol, diğer membran proteinlerinin 13,19,30,40 sulandırılması ve burada sunulan L-arginin parçalanması ve gliserol 3-fosfat sentez yolları dışındaki metabolik ağların kapsüllenmesi için uygulanabilir olmalıdır.<sup class="xref"…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, pBAD-PercevalHR geninin klonlanması için Aditya Iyer’e ve protein üretimi ve saflaştırılmasına yardımcı olduğu için Gea Schuurman-Wolters’a teşekkür eder. Araştırma, NWO Yerçekimi programı “Sentetik Bir Hücre İnşa Etmek” (BaSyC) tarafından finanse edildi.

Materials

Agarose Sigma Aldrich A9414-25g
Amicon cut-off filter Sigma Aldrich Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra 
BioBeads BioRad 152-3920
CHCl3 Macron Fine Chemicals MFCD00000826
D(+)-Glucose Formedium
D(+)-Sucrose Formedium
DDM Glycon D97002 -C
Diethyl Ether Biosolve 52805
DMSO Sigma-Aldrich 276855-100ml
DOPC Avanti 850375P-1g
DOPE Avanti 850725P-1g
DOPG Avanti 840475P-1g
DTT Formedium  DTT005
EtOH J.T.Baker Avantor MFCD00003568
Extruder Avestin Inc LF-1
Fluorimeter Jasco Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol BOOM 51171608
Gravity flow column Bio-Rad 732-1010
Hamilton syringe 100 µL Hamilton 7656-01
Hamilton syringe 1000 µL Hamilton 81320
Handheld LCP dispenser Art Robbins Instruments 620-411-00
Handheld Sonicator Hielscher Ultrasound Technology UP50H
HCl BOOM x76021889.1000
Imidazole Roth X998.4-250g
K2HPO4 Supelco 1.05099.1000
KCl BOOM 76028270.1
KH2PO4 Supelco 1.04873.1000
Kimwipe Kimtech Science 7552
Large Falcon tube centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810 R
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006-100G
Light microscope Leica DM LS2
L-Ornithine Roth T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2 Sigma-Aldrich M2670-1KG
Microfluidic chip Homemade  PDMS based DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP Sigma-Aldrich A2754-1G
NaCl Supelco 1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer Isogen Life Science ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH Supelco 1.06498.1000
Needles for GUVs Henke-Ject 14-14575 27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics Henke-Ject 14-15538 18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose Cytiva 17526802
Nigericin Sigma-Aldrich N7143-5MG
Nutator VWR 83007-210
Osmolality meter Gonotec Salmenkipp Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner Plasma Etch PE-Avenger
Polycarbonate filter Cytiva Whatman Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104 0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube Beckman Coulter 355647
Pyranine Acros Organics H1529-1G
Quartz cuvette (black) Hellma Analytics 108B-10-40
Sephadex G-75 resin  GE Healthcare 17-0050-01
Sonicator Sonics Sonics & Materials INC Sonics vibra cell
Syringe filter Sarstedt Filtropur S plus 0.2 0.2 µm
Syringe pump Harvard Apparatus A-42467
Tabletop centrifuge Eppendorf centrifuge 5418
Teflon spacer Homemade  Teflon based 45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris PanReac AppliChem A1086.1000
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-100 ml
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima Max-E
UV lamp Spectroline ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer Jasco V730 spectrophotometer
Valinomycin Sigma-Aldrich V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope Zeiss AxioObserver
β-Casein Sigma Aldrich C5890-500g

References

  1. Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems. Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).
  2. Ivanov, I., et al. Bottom-up synthesis of artificial cells: recent highlights and future challenges. Annu Rev Chem Biomol. Eng. 12 (1), 287-308 (2021).
  3. Clomburg, J. M., Crumbley, A. M., Gonzalez, R. Industrial biomanufacturing: The future of chemical production. Science. 355 (6320), (2017).
  4. Shi, T., Han, P., You, C., Zhang, Y. -. H. P. J. An in vitro synthetic biology platform for emerging industrial biomanufacturing: Bottom-up pathway design. Synth Syst Biotechnol. 3 (3), 186-195 (2018).
  5. Wang, A., et al. Liver-target and glucose-responsive polymersomes toward mimicking endogenous insulin secretion with improved hepatic glucose utilization. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910168 (2020).
  6. Kanter, G., et al. Cell-free production of scFv fusion proteins: an efficient approach for personalized lymphoma vaccines. Blood. 109 (8), 3393-3399 (2007).
  7. Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53 (1), 92-107 (2013).
  8. Jain, K. K. Synthetic biology and personalized medicine. Med Princ Pract. 22 (3), 209-219 (2013).
  9. Schwille, P., Frohn, B. P. Hidden protein functions and what they may teach us. Trends Cell Biol. 32 (2), 102-109 (2022).
  10. Sachsenmeier, P. Industry 5.0-The relevance and implications of bionics and synthetic biology. Engineering. 2 (2), 225-229 (2016).
  11. Schmidt, D., Jiang, Q. -. X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444 (7120), 775-779 (2006).
  12. Godoy-Hernandez, A., et al. Rapid and highly stable membrane reconstitution by LAiR enables the study of physiological integral membrane protein functions. ACS Cent Sci. 9 (3), 494-507 (2023).
  13. Sikkema, H. R., et al. Gating by ionic strength and safety check by cyclic-di-AMP in the ABC transporter OpuA. Sci Adv. 6 (47), 7697 (2020).
  14. Foucaud, C., Poolman, B. Lactose transport system of Streptococcus thermophilus. Functional reconstitution of the protein and characterization of the kinetic mechanism of transport. J Biol Chem. 267 (31), 22087-22094 (1992).
  15. Yoneda, J. S., Sebinelli, H. G., Itri, R., Ciancaglini, P. Overview on solubilization and lipid reconstitution of Na,K-ATPase: enzyme kinetic and biophysical characterization. Biophys Rev. 12 (1), 49-64 (2020).
  16. Simidjiev, I., et al. Self-assembly of large, ordered lamellae from non-bilayer lipids and integral membrane proteins in vitro. Proc Natl Acad Sci. 97 (4), 1473-1476 (2000).
  17. Harris, N. J., Booth, P. J. Folding and stability of membrane transport proteins in vitro. Biochim Biophys Acta BBA – Biomembr. 1818 (4), 1055-1066 (2012).
  18. Jackson, M. L., Litman, B. J. Rhodopsin-egg phosphatidylcholine reconstitution by an octyl glucoside dilution procedure. Biochim Biophys Acta BBA – Biomembr. 812 (2), 369-376 (1985).
  19. Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).
  20. Rigaud, J. -. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochim Biophys Acta BBA – Bioenerg. 1231 (3), 223-246 (1995).
  21. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc Natl Acad Sci. 75 (9), 4194-4198 (1978).
  22. . Synthetic Organelles for Energy Conservation and Delivery of Building Blocks for Lipid Biosynthesis Available from: https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1 (2023)
  23. Lee, K. Y., et al. Photosynthetic artificial organelles sustain and control ATP-dependent reactions in a protocellular system. Nat Biotechnol. 36 (6), 530-535 (2018).
  24. Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. Methods in Enzymology. , 161-176 (2009).
  25. Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J. Vis. Exp. (95), e52281 (2015).
  26. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  27. Pols, T., et al. A synthetic metabolic network for physicochemical homeostasis. Nat Commun. 10 (1), 4239 (2019).
  28. Bailoni, E., Poolman, B. ATP recycling fuels sustainable glycerol 3-phosphate formation in synthetic cells fed by dynamic dialysis. ACS Synth Biol. 11 (7), 2348-2360 (2022).
  29. Van Der Heide, T. On the osmotic signal and osmosensing mechanism of an ABC transport system for glycine betaine. EMBO J. 20 (24), 7022-7032 (2001).
  30. Van’T Klooster, J. S., et al. Membrane lipid requirements of the lysine transporter Lyp1 from Saccharomyces cerevisiae. J Mol Biol. 432 (14), 4023-4031 (2020).
  31. Lou, G., Anderluzzi, G., Woods, S., Roberts, C. W., Perrie, Y. A novel microfluidic-based approach to formulate size-tuneable large unilamellar cationic liposomes: Formulation, cellular uptake and biodistribution investigations. Eur J Pharm Biopharm. 143, 51-60 (2019).
  32. Weiss, M., et al. Sequential bottom-up assembly of mechanically stabilized synthetic cells by microfluidics. Nat Mater. 17 (1), 89-96 (2018).
  33. Pols, T., Singh, S., Deelman-Driessen, C., Gaastra, B. F., Poolman, B. Enzymology of the pathway for ATP production by arginine breakdown. FEBS J. 288 (1), 293-309 (2021).
  34. Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
  35. Elias, M., et al. Microfluidic characterization of biomimetic membrane mechanics with an on-chip micropipette. Micro Nano Eng. 8, 100064 (2020).
  36. Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore. Biomicrofluidics. 7 (4), 044105 (2013).
  37. Cooper, A., Girish, V., Subramaniam, A. B. Osmotic Pressure Enables High-Yield Assembly of Giant Vesicles in Solutions of Physiological Ionic Strengths. Langmuir. 39 (15), 5579-5590 (2023).
  38. Tantama, M., Martínez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4 (1), 2550 (2013).
  39. Setyawati, I., et al. In vitro reconstitution of dynamically interacting integral membrane subunits of energy-coupling factor transporters. eLife. 9, e64389 (2020).
  40. Oropeza-Guzman, E., Ríos-Ramírez, M., Ruiz-Suárez, J. C. Leveraging the coffee ring effect for a defect-free electroformation of giant unilamellar vesicles. Langmuir. 35 (50), 16528-16535 (2019).
  41. Estes, D. J., Mayer, M. Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 115-123 (2005).

Play Video

Cite This Article
Coenradij, J., Bailoni, E., Poolman, B. Construction of Out-of-Equilibrium Metabolic Networks in Nano- and Micrometer-Sized Vesicles. J. Vis. Exp. (206), e66627, doi:10.3791/66627 (2024).

View Video