בניית רשתות מטבוליות מחוץ לשיווי משקל בשלפוחיות בגודל ננו ומיקרומטר
Summary
אנו מציגים פרוטוקול להרכבה מחדש של חלבוני ממברנה ועטיפת אנזימים ורכיבים מסיסים אחרים במים בשלפוחיות שומנים בגודל תת-מיקרומטר ומיקרומטר.
Abstract
אנו מציגים שיטה לשלב בשלפוחיות רשתות חלבונים מורכבות, המערבות חלבוני ממברנה אינטגרליים, אנזימים וחיישנים מבוססי פלואורסצנטיות, תוך שימוש ברכיבים מטוהרים. שיטה זו רלוונטית לתכנון ובנייה של ביוריאקטורים ולחקר רשתות תגובה מטבולית מורכבות מחוץ לשיווי משקל. אנו מתחילים בבנייה מחדש של חלבוני ממברנה (מרובים) לשלפוחיות חד-למלריות גדולות (LUVs) על פי פרוטוקול שפותח בעבר. לאחר מכן אנו עוטפים תערובת של אנזימים מטוהרים, מטבוליטים וחיישנים מבוססי פלואורסצנטיות (חלבונים פלואורסצנטיים או צבעים) באמצעות הקפאה-הפשרה-אקסטרוזיה ומסירים רכיבים שאינם משולבים באמצעות צנטריפוגה ו/או כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. ביצועי הרשתות המטבוליות נמדדים בזמן אמת על ידי ניטור יחס ATP/ADP, ריכוז מטבוליטים, pH פנימי או פרמטרים אחרים על ידי קריאת פלואורסצנטיות. ניתן להמיר את השלפוחיות המכילות חלבון ממברנה בקוטר 100-400 ננומטר לשלפוחיות ענקיות (GUV), באמצעות הליכים קיימים אך מותאמים. הגישה מאפשרת הכללת רכיבים מסיסים (אנזימים, מטבוליטים, חיישנים) בשלפוחיות בגודל מיקרומטרי, ובכך להגדיל את נפח הביוריאקטורים בסדרי גודל. הרשת המטבולית המכילה GUV לכודים בהתקנים מיקרופלואידים לניתוח במיקרוסקופ אופטי.
Introduction
תחום הביולוגיה הסינתטית מלמטה למעלה מתמקד בבניית תאים (מינימליים) 1,2 וביוריאקטורים מטבוליים למטרות ביוטכנולוגיות 3,4 או ביו-רפואיות 5,6,7,8. בניית תאים סינתטיים מספקת פלטפורמה ייחודית המאפשרת לחוקרים לחקור חלבונים (ממברנה) בתנאים מוגדרים היטב המחקים את אלה של סביבות טבעיות, ומאפשרת גילוי תכונות מתפתחות ופונקציות ביוכימיות נסתרות של חלבונים ורשתות תגובה9. כצעד ביניים לקראת תא סינתטי המתפקד באופן אוטונומי, מפותחים מודולים הלוכדים תכונות חיוניות של תאים חיים כגון שימור אנרגיה מטבולית, סינתזת חלבונים ושומנים, והומאוסטזיס. מודולים כאלה לא רק לשפר את ההבנה שלנו של החיים, אלא גם יש יישומים פוטנציאליים בתחומי רפואה8 וביוטכנולוגיה10.
חלבונים טרנסממברנליים נמצאים בלב כמעט כל רשת מטבולית מכיוון שהם מעבירים מולקולות לתוך התא או החוצה ממנו, מאותתים ומגיבים לאיכות הסביבה, וממלאים תפקידים ביוסינתטיים רבים. לפיכך, הנדסה של מודולים מטבוליים בתאים סינתטיים דורשת ברוב המקרים הרכבה מחדש של חלבוני ממברנה אינטגרליים ו / או היקפיים לתוך דו-שכבה קרום המורכבת מליפידים ספציפיים ושלמות גבוהה (חדירות נמוכה). הטיפול בחלבוני ממברנה אלה מאתגר ודורש ידע ספציפי ומיומנויות ניסוייות.
מספר שיטות פותחו כדי לשחזר חלבוני ממברנה בתוך שלפוחיות פוספוליפידים, לרוב במטרה לחקור את הפונקציה11,12, תקנה13, תכונות קינטיות14,15, תלות שומנים15,16, ו / או יציבות17 של חלבון מסוים. שיטות אלה כוללות דילול מהיר של חלבון המסיס בדטרגנטים למצע מימי בנוכחות ליפידים18, סילוק דטרגנטים על ידי דגירה של חלבון מסיס בדטרגנטים עם בועיות שומנים מעורערות דטרגנטים וספיגת הדטרגנטים על חרוזי פוליסטירן19, או הסרת דטרגנטים על ידי דיאליזה או כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל20. ממיסים אורגניים שימשו ליצירת בועיות שומנים, למשל, באמצעות היווצרות שלבי שמן-מים21, אך רוב חלבוני הממברנה האינטגרלית מושבתים כאשר הם נחשפים לממיסים כאלה.
במעבדה שלנו, אנו בעיקר משחזרים חלבוני ממברנה בשיטת ספיגת חומרי ניקוי ליצירת שלפוחיות חד-למלריות גדולות (LUVs)19. שיטה זו מאפשרת הרכבה מחדש של חלבוני ממברנה מרובים ואת האנקפסולציה בלומן השלפוחית של אנזימים, מטבוליטים ובדיקות22,23. ניתן להמיר את ה-LUV המכילים חלבון ממברנה לשלפוחיות ענקיות-חד-לאומיות (GUVs) עם/בלי אנקפסולציה של רכיבים מסיסים במים, באמצעות אלקטרופורמציה24 או נפיחות25 בסיוע ג’ל ותנאים ספציפיים לשמירה על שלמות חלבוני הממברנה26.
מאמר זה מציג פרוטוקול להרכבה מחדש ב-LUV של רשת מטבולית מחוץ לשיווי משקל המחדשת ATP באמצעות פירוק L-ארגינין ל-L-אורניתין27. היווצרות ATP קשורה לייצור גליצרול-3-פוספט (G3P), אבן בניין חשובה לסינתזה של פוספוליפידים22,28. המסלול המטבולי מורכב משני חלבוני ממברנה אינטגרליים, ארגינין/אורניתין (ArcD) ואנטיפורטר G3P/Pi (GlpT). נוסף על כך, שלושה אנזימים מסיסים (ArcA, ArcB, ArcC) נדרשים למחזור ATP, ו-GlpK משמש להמרת גליצרול לגליצרול 3-פוספט, באמצעות ATP מפירוק L-ארגינין, ראו איור 1 לסקירה סכמטית של המסלול. פרוטוקול זה מייצג נקודת התחלה טובה לבנייה עתידית של רשתות תגובה מורכבות עוד יותר – לסינתזה של שומנים או חלבונים או לחלוקת תאים. הרכב השומנים של השלפוחיות תומך בפעילות של מגוון רחב של חלבוני ממברנה אינטגרליים והותאם להובלת מולקולות מגוונות לתוך או מחוץ לשלפוחיות 27,29,30.
איור 1: סקירה כללית של המסלול לייצור ATP ולסינתזה והפרשה של גליצרול 3-פוספט. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
בקיצור, חלבוני ממברנה מטוהרים (מסיסים בדודציל-β-D-מלטוזיד, DDM) מתווספים לבועיות שומנים מוכנות מראש שהתערערו עם טריטון X-100, המאפשר החדרת החלבונים לממברנה. מולקולות הדטרגנט מוסרות לאחר מכן (לאט) על ידי תוספת של חרוזי פוליסטירן פעילים, וכתוצאה מכך נוצרות פרוטאוליפוזומים אטומים היטב. לאחר מכן ניתן להוסיף רכיבים מסיסים לשלפוחיות ולעטוף אותם באמצעות מחזורי הקפאה-הפשרה, אשר לוכדים את המולקולות בתהליך של איחוי ממברנה. השלפוחיות המתקבלות הטרוגניות מאוד ורבות מהן מולטילמלריות. לאחר מכן הם מושחלים דרך מסנן פוליקרבונט עם גודל נקבוביות של 400, 200 או 100 ננומטר, אשר מניב שלפוחיות בגודל אחיד יותר; ככל שהנקבוביות קטנות יותר, כך השלפוחיות הומוגניות וחד-לאומיות יותר, אך במחיר של נפח פנימי קטן יותר. חלבונים שאינם מאוגדים ומולקולות קטנות מוסרים מהתמיסה החיצונית על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. ניתן להמיר את ה-proteoLUVs לבועיות בגודל מיקרומטר על ידי נפיחות בעזרת ג’ל, ו-proteoGUV אלה נאספים ונלכדים בשבב מיקרופלואידי לצורך אפיון מיקרוסקופי ומניפולציה. איור 2 מציג סקירה סכמטית של הפרוטוקול המלא.
איור 2: סקירה כללית של פרוטוקול להרכבה מחדש של חלבוני ממברנה ועטיפת אנזימים ורכיבים מסיסים במים בשלפוחיות שומנים בגודל תת-מיקרומטר (LUV) ומיקרומטר (GUV). לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
פרוטוקולי ההרכבה מחדש והאנקפסולציה עובדים היטב והפונקציונליות של החלבונים נשמרת, אך הפרוטיאו-לובים והפרוטאוגו-גובים הם הטרוגניים בגודלם. גישות מיקרופלואידיות31,32 מאפשרות היווצרות שלפוחיות בגודל מיקרומטרי שהן הומוגניות יותר בגודלן, אך הרכבה מחדש פונקציונלית של חלבוני ממברנה אינה אפשרית בדרך כלל מכיוון שממס שיורי בדו-שכבה משבית את החלבונים. גודלם של הפרוטאולובים נע בין 100 ל-400 ננומטר, ובריכוזים נמוכים של אנזימים, האנקפסולציה עלולה להוביל לבועיות עם מסלולים מטבוליים לא שלמים (השפעות סטוכסטיות; ראו איור 3). LUVs אידיאליים לבניית מודולים מטבוליים ספציפיים, כפי שמוצג כאן לייצור ATP ואבני בניין כמו G3P. proteoLUVs כאלה יכולים להיות עטופים באופן פוטנציאלי ב- GUV ולשמש כתאים דמויי אברונים עבור שלפוחיות המאכסן.
איור 3: מספר המולקולות לשלפוחית בקוטר של 100, 200 או 400 ננומטר. (A) כאשר החלבונים העטוף (אנזימים, גשושיות) נמצאים בטווח של 1-10 מיקרומטר. (B) הבנייה מחדש נעשית ב-1 עד 1,000, 1 עד 10,000, ו-1 עד 100,000 חלבוני ממברנה לכל ליפיד (mol/mol). אנו יוצאים מנקודת הנחה שהמולקולות עטופות בריכוזים שצוינו ומשולבות בממברנה ביחסי חלבון-שומנים אלה. עבור אנזימים מסוימים, ראינו כי הם נקשרים לממברנות, אשר יכול להגדיל את הריכוז לכאורה שלהם שלפוחיות. קיצור: LPR = יחס שומנים-חלבונים אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מציגים פרוטוקול לסינתזה של חלבון (ממברנה) המכיל שלפוחיות שומנים בגודל תת-מיקרומטרי (proteoLUVs), והמרה של proteoLUVs לשלפוחיות ענקיות-חד-לאומיות (proteoGUVs). הפרוטוקול צריך להיות ישים להרכבה מחדש של חלבוני ממברנה אחרים 13,19,30,40 ולאנקפסולציה של רשתות מטבוליות אחרות מלבד מסלולי פירוק L-ארגינין וסינתזה ש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לאדיטיה אייר על שיבוט הגן pBAD-PercevalHR ולגיאה שורמן-וולטרס על הסיוע בייצור וטיהור חלבונים. המחקר מומן על ידי תוכנית הכבידה של NWO “בניית תא סינתטי” (BaSyC).
Materials
| Agarose | Sigma Aldrich | A9414-25g | |
| Amicon cut-off filter | Sigma Aldrich | Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra | |
| BioBeads | BioRad | 152-3920 | |
| CHCl3 | Macron Fine Chemicals | MFCD00000826 | |
| D(+)-Glucose | Formedium | – | |
| D(+)-Sucrose | Formedium | – | |
| DDM | Glycon | D97002 -C | |
| Diethyl Ether | Biosolve | 52805 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855-100ml | |
| DOPC | Avanti | 850375P-1g | |
| DOPE | Avanti | 850725P-1g | |
| DOPG | Avanti | 840475P-1g | |
| DTT | Formedium | DTT005 | |
| EtOH | J.T.Baker Avantor | MFCD00003568 | |
| Extruder | Avestin Inc | LF-1 | |
| Fluorimeter | Jasco | Spectrofluorometer FP-8300 | |
| Glycerol | BOOM | 51171608 | |
| Gravity flow column | Bio-Rad | 732-1010 | |
| Hamilton syringe 100 µL | Hamilton | 7656-01 | |
| Hamilton syringe 1000 µL | Hamilton | 81320 | |
| Handheld LCP dispenser | Art Robbins Instruments | 620-411-00 | |
| Handheld Sonicator | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | |
| HCl | BOOM | x76021889.1000 | |
| Imidazole | Roth | X998.4-250g | |
| K2HPO4 | Supelco | 1.05099.1000 | |
| KCl | BOOM | 76028270.1 | |
| KH2PO4 | Supelco | 1.04873.1000 | |
| Kimwipe | Kimtech Science | 7552 | |
| Large Falcon tube centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006-100G | |
| Light microscope | Leica | DM LS2 | |
| L-Ornithine | Roth | T204.1 | |
| LSM Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | LSM 710 ConfoCor 3 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-1KG | |
| Microfluidic chip | Homemade | PDMS based | DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J |
| Na-ADP | Sigma-Aldrich | A2754-1G | |
| NaCl | Supelco | 1.06404.1000 | |
| Nanodrop Spectrometer | Isogen Life Science | ND-1000 spectrophotometer NanoDrop | |
| NaOH | Supelco | 1.06498.1000 | |
| Needles for GUVs | Henke-Ject | 14-14575 | 27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm |
| Needles for microfluidics | Henke-Ject | 14-15538 | 18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm |
| Ni2+ Sepharose | Cytiva | 17526802 | |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143-5MG | |
| Nutator | VWR | 83007-210 | |
| Osmolality meter | Gonotec Salmenkipp | Osmomat 3000 basic freezing point osmometer | |
| Plasmacleaner | Plasma Etch | PE-Avenger | |
| Polycarbonate filter | Cytiva Whatman | Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104 | 0.4 µm |
| Polycarbonate ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 355647 | |
| Pyranine | Acros Organics | H1529-1G | |
| Quartz cuvette (black) | Hellma Analytics | 108B-10-40 | |
| Sephadex G-75 resin | GE Healthcare | 17-0050-01 | |
| Sonicator | Sonics Sonics & Materials INC | Sonics vibra cell | |
| Syringe filter | Sarstedt | Filtropur S plus 0.2 | 0.2 µm |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | A-42467 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | centrifuge 5418 | |
| Teflon spacer | Homemade | Teflon based | 45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm |
| Tris | PanReac AppliChem | A1086.1000 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100 ml | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima Max-E | |
| UV lamp | Spectroline | ENB-280C/FE | |
| UV/VIS Spectrometer | Jasco | V730 spectrophotometer | |
| Valinomycin | Sigma-Aldrich | V0627-10MG | |
| Widefield fluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver | |
| β-Casein | Sigma Aldrich | C5890-500g |
References
- Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems. Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).
- Ivanov, I., et al. Bottom-up synthesis of artificial cells: recent highlights and future challenges. Annu Rev Chem Biomol. Eng. 12 (1), 287-308 (2021).
- Clomburg, J. M., Crumbley, A. M., Gonzalez, R. Industrial biomanufacturing: The future of chemical production. Science. 355 (6320), (2017).
- Shi, T., Han, P., You, C., Zhang, Y. -. H. P. J. An in vitro synthetic biology platform for emerging industrial biomanufacturing: Bottom-up pathway design. Synth Syst Biotechnol. 3 (3), 186-195 (2018).
- Wang, A., et al. Liver-target and glucose-responsive polymersomes toward mimicking endogenous insulin secretion with improved hepatic glucose utilization. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910168 (2020).
- Kanter, G., et al. Cell-free production of scFv fusion proteins: an efficient approach for personalized lymphoma vaccines. Blood. 109 (8), 3393-3399 (2007).
- Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53 (1), 92-107 (2013).
- Jain, K. K. Synthetic biology and personalized medicine. Med Princ Pract. 22 (3), 209-219 (2013).
- Schwille, P., Frohn, B. P. Hidden protein functions and what they may teach us. Trends Cell Biol. 32 (2), 102-109 (2022).
- Sachsenmeier, P. Industry 5.0-The relevance and implications of bionics and synthetic biology. Engineering. 2 (2), 225-229 (2016).
- Schmidt, D., Jiang, Q. -. X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444 (7120), 775-779 (2006).
- Godoy-Hernandez, A., et al. Rapid and highly stable membrane reconstitution by LAiR enables the study of physiological integral membrane protein functions. ACS Cent Sci. 9 (3), 494-507 (2023).
- Sikkema, H. R., et al. Gating by ionic strength and safety check by cyclic-di-AMP in the ABC transporter OpuA. Sci Adv. 6 (47), 7697 (2020).
- Foucaud, C., Poolman, B. Lactose transport system of Streptococcus thermophilus. Functional reconstitution of the protein and characterization of the kinetic mechanism of transport. J Biol Chem. 267 (31), 22087-22094 (1992).
- Yoneda, J. S., Sebinelli, H. G., Itri, R., Ciancaglini, P. Overview on solubilization and lipid reconstitution of Na,K-ATPase: enzyme kinetic and biophysical characterization. Biophys Rev. 12 (1), 49-64 (2020).
- Simidjiev, I., et al. Self-assembly of large, ordered lamellae from non-bilayer lipids and integral membrane proteins in vitro. Proc Natl Acad Sci. 97 (4), 1473-1476 (2000).
- Harris, N. J., Booth, P. J. Folding and stability of membrane transport proteins in vitro. Biochim Biophys Acta BBA – Biomembr. 1818 (4), 1055-1066 (2012).
- Jackson, M. L., Litman, B. J. Rhodopsin-egg phosphatidylcholine reconstitution by an octyl glucoside dilution procedure. Biochim Biophys Acta BBA – Biomembr. 812 (2), 369-376 (1985).
- Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).
- Rigaud, J. -. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochim Biophys Acta BBA – Bioenerg. 1231 (3), 223-246 (1995).
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc Natl Acad Sci. 75 (9), 4194-4198 (1978).
- . Synthetic Organelles for Energy Conservation and Delivery of Building Blocks for Lipid Biosynthesis Available from: https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1 (2023)
- Lee, K. Y., et al. Photosynthetic artificial organelles sustain and control ATP-dependent reactions in a protocellular system. Nat Biotechnol. 36 (6), 530-535 (2018).
- Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. Methods in Enzymology. , 161-176 (2009).
- Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J. Vis. Exp. (95), e52281 (2015).
- Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 88 (2), 1134-1142 (2005).
- Pols, T., et al. A synthetic metabolic network for physicochemical homeostasis. Nat Commun. 10 (1), 4239 (2019).
- Bailoni, E., Poolman, B. ATP recycling fuels sustainable glycerol 3-phosphate formation in synthetic cells fed by dynamic dialysis. ACS Synth Biol. 11 (7), 2348-2360 (2022).
- Van Der Heide, T. On the osmotic signal and osmosensing mechanism of an ABC transport system for glycine betaine. EMBO J. 20 (24), 7022-7032 (2001).
- Van’T Klooster, J. S., et al. Membrane lipid requirements of the lysine transporter Lyp1 from Saccharomyces cerevisiae. J Mol Biol. 432 (14), 4023-4031 (2020).
- Lou, G., Anderluzzi, G., Woods, S., Roberts, C. W., Perrie, Y. A novel microfluidic-based approach to formulate size-tuneable large unilamellar cationic liposomes: Formulation, cellular uptake and biodistribution investigations. Eur J Pharm Biopharm. 143, 51-60 (2019).
- Weiss, M., et al. Sequential bottom-up assembly of mechanically stabilized synthetic cells by microfluidics. Nat Mater. 17 (1), 89-96 (2018).
- Pols, T., Singh, S., Deelman-Driessen, C., Gaastra, B. F., Poolman, B. Enzymology of the pathway for ATP production by arginine breakdown. FEBS J. 288 (1), 293-309 (2021).
- Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
- Elias, M., et al. Microfluidic characterization of biomimetic membrane mechanics with an on-chip micropipette. Micro Nano Eng. 8, 100064 (2020).
- Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore. Biomicrofluidics. 7 (4), 044105 (2013).
- Cooper, A., Girish, V., Subramaniam, A. B. Osmotic Pressure Enables High-Yield Assembly of Giant Vesicles in Solutions of Physiological Ionic Strengths. Langmuir. 39 (15), 5579-5590 (2023).
- Tantama, M., Martínez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4 (1), 2550 (2013).
- Setyawati, I., et al. In vitro reconstitution of dynamically interacting integral membrane subunits of energy-coupling factor transporters. eLife. 9, e64389 (2020).
- Oropeza-Guzman, E., Ríos-Ramírez, M., Ruiz-Suárez, J. C. Leveraging the coffee ring effect for a defect-free electroformation of giant unilamellar vesicles. Langmuir. 35 (50), 16528-16535 (2019).
- Estes, D. J., Mayer, M. Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 115-123 (2005).
