Summary

Улучшение карт плотности за счет удаления большинства частиц в окончательных стеках криогенной электронной микроскопии с помощью одной частицы

Published: May 10, 2024
doi:

Summary

Усовершенствованный метод отбора частиц для крио-ЭМ, а именно CryoSieve, улучшает разрешение карты плотности за счет удаления большинства частиц в конечных стопках, что продемонстрировано его применением на реальном наборе данных.

Abstract

За последнее десятилетие достижения в области технологии и методологии в области криогенной электронной микроскопии (крио-ЭМ) анализа одиночных частиц (СПА) значительно улучшили наши возможности по структурному исследованию биологических макромолекул с высоким разрешением. Этот прогресс открыл новую эру молекулярных знаний, заменив рентгеновскую кристаллографию в качестве доминирующего метода и дав ответы на давние вопросы биологии. Поскольку крио-ЭМ не зависит от кристаллизации, которая является существенным ограничением рентгеновской кристаллографии, она захватывает частицы различного качества. Следовательно, выбор частиц имеет решающее значение, так как качество выбранных частиц напрямую влияет на разрешение восстановленной карты плотности. Инновационный итеративный подход к выбору частиц, получивший название CryoSieve, значительно улучшает качество восстановленных карт плотности за счет эффективного уменьшения количества частиц в конечном стеке. Экспериментальные данные показывают, что этот метод может удалить большинство частиц в конечных стопках, что приводит к заметному улучшению качества карт плотности. В этой статье подробно описан рабочий процесс этого подхода и продемонстрировано его применение на реальном наборе данных.

Introduction

Криогенная электронная микроскопия (крио-ЭМ) — анализ отдельных частиц (SPA) — стал доминирующим методом определения трехмерных карт плотности биологических макромолекул с высоким разрешением. Благодаря ряду технологических инноваций 1,2,3,4,5,6, получивших название «революцияразрешения 7», крио-ЭМ обладает способностью определять структуры биологических макромолекул с разрешением до атомов с беспрецедентной скоростью. Этот прорыв знаменует собой начало новой эры в молекулярном понимании, обогнав рентгеновскую кристаллографию в качестве преобладающего метода и ответив на давние биологические вопросы.

Cryo-EM SPA отличается от рентгеновской кристаллографии тем, что не требует кристаллизации биологических макромолекул. Вместо этого раствор, содержащий целевые биологические макромолекулы, быстро замораживается в стекловидном льду. Затем его визуализируют с помощью электронного луча для получения серии микрофотографий, минуя необходимостькристаллизации. Впоследствии алгоритмы отбора частиц используются для извлечения отдельных исходных частиц из этих микроизображений 4,9,10,11,12. Поскольку крио-ЭМ не зависит от кристаллизации, естественно, что извлеченные частицы преимущественно повреждены или находятся в нежелательных конформационных состояниях, что требует нескольких раундов отбора частиц для получения карты плотности с высоким разрешением. Таким образом, при обработке изображений cryo-EM SPA выбор частиц имеет решающее значение для получения карт плотности с высоким разрешением13.

В крио-ЭМ СПА стандартные методы отбора частиц включают двумерную (2D) и трехмерную (3D) классификацию14. Двухмерная классификация классифицирует частицы по заранее определенному числу групп, что дает среднее изображение и предполагаемое 2D-разрешение для каждого класса. Затем исследователи могут визуально осмотреть эти классы, удаляя частицы из групп с более низким разрешением, чтобы использовать оставшиеся в реконструкциях, направленных на достижение более высокого разрешения. После того, как с помощью алгоритмов уточнения будут установлены положения частиц, исследователи приступят к 3D-классификации, кластеризуя частицы в несколько классов. Это позволяет визуально контролировать восстановленную карту плотности для каждого класса, что позволяет исключить нежелательные частицы, например, из нежелательных конформаций. После нескольких раундов классификации получается окончательный пакет, состоящий из частиц относительно высокого качества. Эти конечные стеки играют важную роль в создании карт плотности атомного или околоатомного разрешения.

Чжу и ее коллеги продемонстрировали, что дальнейший отбор частиц может быть проведен на этих конечных стеках15. CryoSieve15, инновационный итеративный метод отбора частиц, может быть применен для повышения качества итоговой карты плотности за счет значительного уменьшения количества частиц. В то время как в настоящее время в этой области используются другие критерии сортировки частиц и программное обеспечение, такие как метод нормализованной взаимной корреляции (NCC)16, подход17 на основе углового графа (AGC) и классификация невыравнивания5, было показано, что этот метод превосходит эти алгоритмы с точки зрения эффективности.

В этом исследовании мы представляем подробное руководство по всему процессу. В качестве примера мы применили этот новый метод к набору данных тримера гемагглютинина гриппа (запись EMPIAR: 10097)18, который включает 130 000 частиц в своем окончательном стеке. Наша процедура успешно отбросила около 73,8% частиц из конечного стека этого набора данных, улучшив разрешение восстановленной карты плотности с 4,11 Å до 3,62 Å. В дополнение к тримеру гемагглютинина гриппа, результаты нескольких наборов данных представлены в более ранней публикации15, демонстрируя разнообразие разрешений и молекулярных масс биомолекул.

Protocol

1. Монтаж Проверка и настройка среды GPU-ускоренияОткройте терминал и введите команду: nvidia-smi. Убедитесь, что команда успешно отображает всю информацию о картах графического процессора и версии CUDA выше 10.2. Выполните команду: conda -V, чтобы проверить, установлена ли Conda (дополнительный рисунок 1). Настройка виртуальной средыВведите следующую команду, чтобы настроить виртуальную среду, заменив CRYOSIEVE_ENV на желаемое имя среды: conda create -n CRYOSIEVE_ENV python=3.8 cudatoolkit=10.2 cupy=10.0 pytorch=1.10 -c pytorch -c conda-forge. Подождите несколько минут, пока среда не будет успешно настроена (дополнительный рисунок 2).ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи могут изменять имя среды по мере необходимости. Предоставленная команда специфична для CUDA 10.2. Если требуется другая версия CUDA, измените номер версии для cudatoolkit. Установите CryoSieveАктивируйте окружение, выполнив команду: conda activate CRYOSIEVE_ENV. Установите программное обеспечение, выполнив: pip install cryosieve или conda install -c mxhulab cryosieve (Дополнительный рисунок 3). Введите cryosieve -h и убедитесь, что справочная информация отображается правильно (дополнительный рисунок 4). 2. Просеивание частиц Получение данныхЗагрузите окончательный набор данных EMPIAR-10097 с сайта EMPIAR (см. Таблицу материалов). Загрузите файл звезды, файл маски (mask.mrc) и исходную модель (для шага повторной оценки; initial.mrc) с Github (см. Таблицу материалов). Поместите все эти файлы в одну папку (дополнительный рисунок 5).ПРИМЕЧАНИЕ: Репозиторий в https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos использует Git Large File Storage (Git LFS). Установка Git LFS необходима для клонирования всего репозитория. Кроме того, вы можете получить доступ к файлу по ссылке GitHub и нажать кнопку «Загрузить необработанный файл », чтобы загрузить отдельный файл. Процесс просеивания частицОткройте терминал и используйте команду: cd FILEPATH для перехода к папке, в которой находится набор данных. Активируйте среду Conda с помощью: conda activate CRYOSIEVE_ENV. Введите следующую команду, чтобы начать наш эксперимент по просеиванию частиц: cryosieve –reconstruct_software relion_reconstruct –postprocess_software relion_postprocess –i T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star –o output/ –mask mask.mrc –angpix 1.3099979 –num_iters 10 –frequency_start 40 –frequency_end 3 –retention_ratio 0.8 –sym C3 –num_gpus 1 –balance (Дополнительный рисунок 5). Во время выполнения терминал будет отображать журналы вывода для каждой итерации.ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные инструкции по каждому варианту можно найти в Дополнительном файле 1. Время обработки и минимальные требования к исполнению подробно описаны в Дополнительном файле 2. T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star был усовершенствован CryoSPARC с помощью T40_HA_130K-Equalized_run-data.star (загружен с EMPIAR) для смягчения эффектов, вызванных достижениями в методах оценки ориентации. 3. Поиск оптимальной итерации Проверка разрешенийИспользуйте команду: grep “+ FINAL RESOLUTION:” output/_postprocess*.txt для вывода результатов разрешения для 10 итераций просеивания (Рисунок 1). Поскольку стек частиц, отфильтрованный в7-й итерации, имеет самое высокое разрешение при наименьшем количестве частиц, он, скорее всего, обеспечит оптимальный результат.Примечание: Чтобы избежать непреднамеренной передачи информации от отброшенных к сохраненным частицам15 и убедиться в том, что стек частиц после 7-й итерации действительно является оптимальным, пользователи должны выполнить шаг повторной оценки для близлежащих итераций. В этом протоколе проверке подвергаются итерации 4, 5, 6, 7 и 8. Импорт просеянных частицОткройте веб-интерфейс CryoSPARC и выполните следующие действия: Войдите в рабочее пространство и нажмите на кнопку «Конструктор » в правом верхнем углу панели. На панели выберите и нажмите на опцию «Импорт стека частиц ». В разделе “Параметры” панели “Импорт стека частиц” укажите метапуть к частицам в виде файла _iter{n}.star, расположенного в выходной папке готовых результатов, и путь к данным частиц в папку, где хранится файл mrcs. Нажмите кнопку «Задание в очередь », затем нажмите кнопку «В очередь », чтобы начать процесс. Используйте тот же способ для импорта оставшихся итераций, которые требуют повторной оценки (дополнительный рисунок 6A). Импорт исходной моделиНажмите на кнопку «Конструктор » в правом верхнем углу панели. На панели выберите и нажмите на опцию «Импорт 3D-объемов ». Укажите путь к данным Volume в качестве файла initial.mrc. Нажмите кнопку Queue Job , затем нажмите кнопку Queue , чтобы запустить процесс (дополнительный рисунок 6B).ПРИМЕЧАНИЕ: Исходная модель также может быть создана с помощью реконструкции ab initio (Дополнительный файл 3). Однородная доработка (задание сборки)Нажмите на кнопку «Конструктор » в правом верхнем углу панели. На панели выберите и нажмите на опцию «Однородное уточнение ».ПРИМЕЧАНИЕ: Также применяется неравномерная доработка. Гомогенное рафинирование (импорт частиц)В главной панели слева откройте задание на импорт стека частиц5-й итерации (или нужной итерации). Перетащите импортированный модуль частиц с правой стороны главной панели и поместите его в раздел «Стопки частиц» в Конструкторе справа. Закройте задание «Импорт стека частиц», нажав на красный крестик в правом верхнем углу главной панели. Откройте задание на импорт 3D объемов. Перетащите импортированный модуль объемов с правой стороны главной панели и поместите его в раздел «Начальный объем» конструктора справа. Однородная доработка (Изменение параметров)В разделе Параметры (Parameters) найдите опцию Симметрия (Symmetry) и установите ее на C3 (C3). Найдите опцию Force re-do GS split и отключите ее. Нажмите кнопку «Задание в очереди », затем нажмите кнопку «Очередь », чтобы начать однородное уточнение. Выполните однородное уточнение для остальных итераций с использованием того же метода (дополнительный рисунок 6C-D).ПРИМЕЧАНИЕ: Опция Force re-do GS split имеет решающее значение. Отключение этой опции гарантирует, что CryoSPARC сохранит золотой стандарт разделения, заданный звездным файлом, избегая переобучения. Подробное обоснование отключения Force Re-do GS Split можно найти в дополнительном файле 4. Подождите, пока все задания не завершат выполнение, чтобы получить результаты. На основании полученных результатов подтверждается, что стек частиц, отфильтрованный на6-й итерации, является фактическим оптимальным результатом.ПРИМЕЧАНИЕ: Это нормально, если полученные результаты имеют незначительные случайные отклонения от результатов, представленных в этом протоколе. Эти отклонения не влияют на общий вывод.

Representative Results

В этом протоколе мы использовали набор данных тримера гемагглютинина гриппа (запись EMPIAR: 10097) в качестве демонстрации эффективности этого процесса. Из-за предпочтительной ориентации образца для получения данных требовался наклон под углом 40°. Белок проявляет симметрию С3 и имеет молекулярную массу 150 кДа. Мы реализовали описанный ранее протокол для обработки конечного стека частиц. Он постепенно удалял 20% частиц в каждой итерации, в результате чего коэффициент удержания составлял 80,0%, 64,0%, 51,2% и так далее. Как показано на рисунках 1 и 2, разрешение удерживаемых частиц первоначально улучшилось, но в конечном итоге уменьшилось. Среди итераций6-я итерация была определена как наиболее оптимальное подмножество, содержащее наименьшее количество частиц, но достигающее наивысшего разрешения. Наш алгоритм успешно идентифицировал подмножество частиц, составляющих только 26,2% от исходного стека, что привело к улучшению разрешения с 4,19 Å до 3,62 Å (переоценено CryoSPARC), как показано на рисунке 2. Кроме того, карты плотности до и после использования CryoSieve были сравнены на рисунке 3. Также показана кривая корреляции оболочки Фурье (FSC) модели-карты и полумапличная кривая FSC восстановленных карт плотности до и после метода (рис. 3A-B). Также сравнивались необработанные карты плотности и полученные карты четкой плотности с нанесенным эквивалентным уровнем контура (рис. 3C). Были сравнены боковые цепи четких карт плотности, что показало улучшение реконструированных карт плотности. Расчетный В-фактор Розенталя-Хендерсона также был принят для критериев качества частиц19. После удаления большинства частиц в окончательной стопке B-фактор Розенталя-Хендерсона вырос с 226,9Å2 до 146,2Å2 (рисунок 3D). Для сравнения также использовались локальное разрешение, локальный B-фактор20 и ResLog21, что указывает на то, что CryoSieve действительно улучшает качество как карт плотности, так и частиц (рис. 4).  Рисунок 1: Разрешения каждой итерации. Решения, о которых было сообщено, выделены красными прямоугольниками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 2: Разрешения каждой итерации. Разрешения, определенные однородными заданиями уточнения, выделены красными прямоугольниками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 3: Карты плотности. (A) Сравнение кривой FSC от модели к карте восстановленных карт плотности до и после использования CryoSite. Ось Y представляет FSC, а ось X — разрешение. Красной пунктирной линией отмечен порог 0,5 для FSC. Вертикальная пунктирная линия иллюстрирует разрешение карт плотности, полученных при пороговом значении 0,5. (B) Полукарты кривой FSC были получены из восстановленных карт плотности до и после использования CryoSieve с помощью CryoSPARC. Ось Y представляет FSC, а ось X — разрешение. (C) Были показаны необработанные карты плотности и четкие карты плотности как для частиц, удерживаемых криоситом, так и для полного набора частиц в конечных стеках. Эквивалентный уровень изолиний 0,65 был применен для карт необработанной плотности. Эквивалентный уровень контура 0,84 был применен для карт с высокой плотностью. Четкие карты плотности были получены непосредственно с помощью CryoSPARC. Карты резкой плотности были автоматически обработаны, сначала взвешенными по FSC (на основе FSC, предоставленных CryoSPARC). Затем В-фактор был заточен с использованием автоматически определенных В-факторов (232,0 Å2 для всех частиц в конечном стеке и 160,8 Å2 для CryoSieve). Боковые цепи на картах острой плотности сравнивались, включая атомные модели для справки. Красными стрелками выделены улучшенные регионы. (D) Расчетный В-фактор Розенталя-Хендерсона был показан как для частиц, удерживаемых криоситом, так и для полного набора частиц в конечных стопках. Ось y представляет количество используемых частиц, а ось x представляет собой величину, обратную квадрату разрешения. Двигаясь сверху вниз, каждая точка представляет собой половину частиц предыдущей. Решения были определены путем доработки. B-факторы были определены с использованием аппроксимации измеренных точек методом наименьших квадратов, как показано кривыми аппроксимации. Расчетные B-факторы Розенталя и Хендерсона указаны в легендах: оранжевым цветом обозначены частицы, удерживаемые CryoSieve, а синим обозначены все частицы в окончательной стопке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 4: Сравнение различных метрик карт плотности. (A) Сравнение карт локального разрешения до и после использования CryoSite, полученного с помощью CryoSPARC. Местное разрешение колеблется от 7 Å (красный) до 3,5 Å (синий). (B) Сравнение карт плотности до и после использования CryoSieve, раскрашенных с помощью локальной карты B-фактора, полученной LocBFactor с использованием диапазона разрешения [20-3.5] Å. (C), Сравнение графиков ResLog до и после использования CryoSieve, полученной CryoSPARC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Дополнительный рисунок 1: Использование команд nvidia-smi и conda -V для проверки предварительных требований. Если предварительные условия выполнены, при вводе команды nvidia-smi отобразится версия драйвера графического процессора, версия CUDA и состояние карт графического процессора. Аналогичным образом, ввод команды conda -V должен корректно отображать установленную версию Conda. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 2: Процесс создания новых сред GPU-ускорения. На экране отображаются выходные данные, сгенерированные командой, использованной для создания среды Conda. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 3: Установка CryoSieve в среду GPU-ускорения. После активации вновь созданной среды Conda, на экране отобразится результат, полученный в результате выполнения команды для установки CryoSieve с помощью Pip. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 4: Справочная информация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 5: Процесс выполнения. После запуска CryoSieve через командную строку на экране отображается информация о запущенном процессе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 6: Конфигурация заданий CryoSPARC. (A) Импортируйте стек частиц. (B) Импорт 3D-объемов. (К-Д) Однородная утонченность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 1: Опции CryoSieve. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 2: Время обработки и минимальные требования для запуска Cryosieve. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 3: Генерация исходной модели с помощью CryoSPARC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 4: Обоснование для отключения разделения GS при повторном выполнении усилия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 5: Варианты cryosieve-csrefine. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 6: Опции cryosieve-csrhbfactor. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Крио-ЭМ является ключевым методом для выяснения структуры биологических молекул. В этом процессе, после сбора данных с помощью микроскопии, важное значение имеет извлечение частиц из микрофотографий, а затем их классификация в несколько этапов для составления окончательного стека. Общей проблемой является преобладание поврежденных или нежелательны конформированных частиц, что подчеркивает необходимость повторного отбора частиц для получения карт плотности с высоким разрешением. Это делает выбор частиц критически важным этапом в крио-ЭМ SPA для получения высококачественных карт плотности. Существующие методы отбора частиц включают алгоритм22 статистической валидации без наклона, подход23 на основе z-оценки и метод24 оценки угловой точности.

В этом контексте CryoSieve является ценным инструментом, способным удалять значительное количество посторонних частиц из конечного пакета. Это сокращение не только повышает вычислительную эффективность реконструкции, но и оптимизирует процесс. Он предлагает комплексный набор для выбора частиц, где степень отбрасывания частиц и последующее улучшение разрешения в значительной степени зависят от исходного качества данных и методологий, используемых при их обработке.

В этой рукописи мы представили полный рабочий процесс просеивания частиц с использованием реального набора данных о тримере гемагглютинина гриппа (запись EMPIAR: 10097). Шаги, рассмотренные и рассмотренные здесь, могут быть обобщены как просеивание частиц и повторная оценка позы. Окончательный 3D-реконструированный объем достиг разрешения 3,62 Å, а боковые цепи в альфа-спиралях были более четкими в обработанном объеме по сравнению с опубликованной картой плотности.

CryoSieve — это метод с открытым исходным кодом, который доступен на GitHub (https://github.com/mxhulab/cryosieve). Подробное руководство также можно найти на его главной странице. Пользователи могут установить и использовать его, следуя инструкциям по эксплуатации. Кроме того, предусмотрены два модуля: cryosieve-csrefine и cryosieve-csrhbfactor. Модуль cryosieve-csrefine специально разработан для автоматизации последовательного выполнения различных операций в CryoSPARC (Дополнительный файл 5). Эти операции включают в себя импорт стеков частиц и выполнение заданий ab initio, гомогенной или неравномерной очистки. С другой стороны, модуль cryosieve-csrhbfactor предназначен для автоматизации определения B-фактора Розенталя-Хендерсона за счет использования возможностей cryosieve-csrefine (Дополнительный файл 6).

В настоящее время применение этого метода ограничено единичными сценариями конформации. Следовательно, в тех случаях, когда частицы представляют собой множественные конформации, их возможности ограничены. Пользователям рекомендуется сначала использовать 3D-классификацию для разделения частиц разрозненных конформаций, прежде чем использовать ее для отбора уточненных частиц. Более того, несмотря на то, что метод демонстрирует мастерство в отфильтровывании более 50% частиц из конечного стека, происхождение этих отброшенных частиц и основные причины их незначительного вклада в качество реконструкции остаются неясными. Этот пробел в понимании требует дополнительных исследований для всестороннего рассмотрения и потенциального исправления этого ограничения.

Существует три возможных метода сортировки частиц или просеивания частиц. Прежде всего, cisTEM4 может сообщать оценку для каждого отдельного изображения частицы после 3D-уточнения. Пользователи могли сортировать частицы с помощью оценки cisTEM для отбрасывания частиц. Подход17 на основе консистентности углового графа (AGC) также является методом отбрасывания невыровненных частиц. Кроме того, классификация невыравнивания5 является традиционным способом отбрасывания частиц с помощью 3D-классификации. Мы сравнили качество частиц, удерживаемых этими методами, с помощью CryoSieve и обнаружили, что удерживаемые частицы CryoSieve имеют более высокоекачество15. Представленный здесь метод значительно превосходит альтернативные методы и позволяет достичь наименьшего количества частиц при том же разрешении.

Как показано в результате, большинство частиц в конечном стеке крио-ЭМ не участвуют в реконструкции карты плотности. Другими словами, среди всех частиц, собранных в процессе получения изображения, только несколько избранных, а именно самое тонкое подмножество, действительно вносят свой вклад в окончательную реконструкцию. Следовательно, отношение этого конечного подмножества к общему количеству собранных частиц может служить количественной метрикой для оценки качества образца. Чем выше это соотношение, тем лучше качество образца. Несмотря на технические достижения, которые сделали крио-ЭМ более доступной для структурных биологов, подготовка образцов остается основным узким местом в рабочем процессе. Таким образом, ученые и инженеры сосредотачивают свои усилия на решении этой задачи25. При анализе отдельных частиц (SPA) подготовка образцов состоит из двух важнейших этапов: оптимизации образца и подготовки сетки. Первый предполагает очистку образца при сохранении его оптимального биохимического состояния. Последнее включает в себя подготовку образца к анализу в микроскопе, включая химическую или плазменную обработку сетки, осаждение образца и витрификацию. Для решения проблемы макромолекулярной нестабильности было предложено множество методов, но эффективность одного подхода по сравнению с другим зависит от характеристик образца25,26. В настоящее время результаты подготовки сетки в значительной степени зависят от знаний и опыта пользователя, что может сделать процесс трудоемким и сложным27,28. Многочисленные переменные, встречающиеся при подготовке образцов и сеток, создают проблемы при установлении причинно-следственных связей, поскольку исследователи могут оценить образец только на молекулярном уровне с помощью микроскопа. В результате, количественная статистика сравнений различных протоколов подготовки выборки и сетки все еще отсутствует, и необходим системный подход для исследования тенденций и понимания фундаментальных механизмов поведения выборки.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Шэньчжэньской академией исследований и перевода (для M.H.), Центром передовых инноваций в области структурной биологии (для M.H.), Пекинским пограничным исследовательским центром биологической структуры (для M.H.), Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (No.2021YFA1001300) (для C.B.), Национальным фондом естественных наук Китая (No.12271291) (для C.B.), и Национальный фонд естественных наук Китая (No.12071244) (для Z.S.).

Materials

CryoSPARC Structura Biotechnology Inc. Toronto, Canada CryoSPARC (Cryo-EM Single Particle Ab-Initio Reconstruction and Classification) is a state of the art HPC software solution for complete processing of single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) data. CryoSPARC is useful for solving cryo-EM structures of membrane proteins, viruses, complexes, flexible molecules, small particles, phase plate data and negative stain data.
EMPIAR-10097 Dataset https://ftp.ebi.ac.uk/empiar/world_availability/10097/data/Particle-Stack/T40_HA_130K-Equalized-Particle-Stack.mrcs This dataset comprises single-particle cryo-EM data of the Influenza Hemagglutinin trimer, characterized by its highly preferred orientation, collected using a 40-degree tilted collection strategy.
initial.mrc https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097
mask.mrc https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097
RELION 4.0-beta-2 RELION (REgularised LIkelihood OptimisatioN) is an open-source software for cryo-electron microscopy (cryo-EM) data processing, particularly for refining macromolecular structures. Utilizing a Bayesian approach, it excels in separating signal from noise, enabling high-resolution structure determination. RELION supports single-particle analysis, tomography, and sub-tomogram averaging, and has become widely used in structural biology due to its effectiveness and user-friendly interface.
T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097 Metadata file for the final stack of particles from EMPIAR-10097

References

  1. Bai, X. C., Fernandez, I. S., Mcmullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-em particles. elife. 2, 00461 (2013).
  2. Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  3. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-em. Nat Meth. 10 (6), 584-590 (2013).
  4. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. Cis tem, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, e35383 (2018).
  5. Scheres, S. H. Relion: Implementation of a bayesian approach to cryo-em structure determination. J Str Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
  6. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. Cryosparc: Algorithms for rapid unsupervised cryo-em structure determination. Nat Meth. 14 (3), 290-296 (2017).
  7. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  8. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quart Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (1988).
  9. Wagner, T., et al. Sphire-cryolo is a fast and accurate fully automated particle picker for cryo-EM. Comm Biol. 2 (1), 218 (2019).
  10. Bepler, T., et al. Positive-unlabeled convolutional neural networks for particle picking in cryo-electron micrographs. Nat Meth. 16 (11), 1153-1160 (2019).
  11. Wang, F., et al. Deeppicker: A deep learning approach for fully automated particle picking in cryo-em. J Str Biol. 195 (3), 325-336 (2016).
  12. Heimowitz, A., Andén, J., Singer, A. Apple picker: Automatic particle picking, a low-effort cryo-em framework. J Str Biol. 204 (2), 215-227 (2018).
  13. Glaeser, R. M. How good can single-particle cryo-em become? What remains before it approaches its physical limits. Ann Rev Biophys. 48, 45-61 (2019).
  14. Diiorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion. J Vis Exp. (179), e63387 (2022).
  15. Zhu, J., et al. A minority of final stacks yields superior amplitude in single-particle cryo-em. Nat Comm. 14 (1), 7822 (2023).
  16. Zhou, Y., Moscovich, A., Bendory, T., Bartesaghi, A. Unsupervised particle sorting for high-resolution single-particle cryo-em. Inv Probl. 36 (4), 044002 (2020).
  17. Méndez, J., Garduno, E., Carazo, J. M., Sorzano, C. O. S. Identification of incorrectly oriented particles in cryo-em single particle analysis. J Str Biol. 213 (3), 107771 (2021).
  18. Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-em through tilting. Nat Meth. 14 (8), 793-796 (2017).
  19. Rosenthal, P. B., Henderson, R. Optimal determination of particle orientation, absolute hand, and contrast loss in single-particle electron cryomicroscopy. J Mol Biol. 333 (4), 721-745 (2003).
  20. Kaur, S., et al. Local computational methods to improve the interpretability and analysis of cryo-em maps. Nat Comm. 12 (1), 1240 (2021).
  21. Stagg, S. M., Noble, A. J., Spilman, M., Chapman, M. S. Reslog plots as an empirical metric of the quality of cryo-em reconstructions. J Str Biol. 185 (3), 418-426 (2014).
  22. Vargas, J., Otón, J., Marabini, R., Carazo, J. M., Sorzano, C. Particle alignment reliability in single particle electron cryomicroscopy: A general approach. Sci Rep. 6 (1), 21626 (2016).
  23. Vargas, J., et al. Particle quality assessment and sorting for automatic and semiautomatic particle-picking techniques. J Str Biol. 183 (3), 342-353 (2013).
  24. Vargas, J., Melero, R., Gomez-Blanco, J., Carazo, J. -. M., Sorzano, C. O. S. Quantitative analysis of 3d alignment quality: Its impact on soft-validation, particle pruning and homogeneity analysis. Sci Rep. 7 (1), 6307 (2017).
  25. Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing ‘standard’sample preparation for single-particle cryo-em. J Microsc. 276 (1), 39-45 (2019).
  26. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Sec D: Str Biol. 74 (6), 560-571 (2018).
  27. Glaeser, R. M. How good can cryo-em become. Nat Meth. 13 (1), 28-32 (2016).
  28. Kim, L. Y., et al. Benchmarking cryo-em single particle analysis workflow. Front Mol Biosci. 5, 50 (2018).
  29. Weissenberger, G., Henderikx, R. J., Peters, P. J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-em. Nat Meth. 18 (5), 463-471 (2021).

Play Video

Cite This Article
Cai, M., Zhu, J., Zhang, Q., Xu, Y., Shi, Z., Bao, C., Hu, M. Enhancing Density Maps by Removing the Majority of Particles in Single Particle Cryogenic Electron Microscopy Final Stacks. J. Vis. Exp. (207), e66617, doi:10.3791/66617 (2024).

View Video