Aislamiento de médula ósea de ratón neonatal y preparación de macrófagos derivados de la médula ósea
Summary
Este protocolo describe un método sencillo y no enzimático para aislar células de médula ósea de ratón neonatal de 7-9 días de edad y generar macrófagos diferenciados utilizando un sobrenadante de células L929 como fuente de factor estimulante de colonias de granulocitos (M-CSF). Los macrófagos derivados de la médula ósea se analizaron más a fondo para determinar los antígenos de superficie F4/80, CD206, CD11b y la competencia funcional.
Abstract
Varias técnicas para aislar la médula ósea de ratones adultos han sido bien establecidas. Sin embargo, aislar la médula ósea de ratones neonatos es un desafío y requiere mucho tiempo, pero para algunos modelos, es traslacionalmente relevante y necesario. Este protocolo describe un método eficiente y sencillo para preparar células de médula ósea de cachorros de 7 a 9 días de edad. Estas células se pueden aislar o diferenciar aún más en tipos específicos de células de interés. Los macrófagos son células inmunitarias cruciales que desempeñan un papel importante en la inflamación y la infección. Durante el desarrollo, los macrófagos neonatales contribuyen significativamente a la remodelación de los tejidos. Además, el fenotipo y las funciones de los macrófagos neonatales difieren de los de sus homólogos adultos. Este protocolo también describe la diferenciación de los macrófagos neonatales de las células aisladas de la médula ósea en presencia de medio condicionado con L929. Los marcadores de superficie para macrófagos neonatales diferenciados se evaluaron mediante análisis de citometría de flujo. Para demostrar la funcionalidad, también se probó la eficiencia fagocítica utilizando Escherichia coli conjugada con colorante sensible al pH.
Introduction
La médula ósea encierra poblaciones de células madre hematopoyéticas y mesenquimales que son autorrenovables y se pueden diferenciar en varios linajes celulares. Las células madre hematopoyéticas de la médula ósea dan lugar a linajes mieloides y linfoides1. Las células madre mesenquimales producen osteoblastos (hueso), adipocitos (grasa) o condrocitos (cartílago)2. Estas células tienen múltiples aplicaciones en el campo de la biología celular y la ingeniería de tejidos, incluida la terapia génica 3,4. Las células progenitoras presentes en la médula ósea se diferencian en tipos celulares específicos en presencia de factores de crecimiento específicos del linaje. La eritropoyetina promueve la proliferación de células progenitoras eritroides, el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) estimula el crecimiento de colonias de neutrófilos y la trombopoyetina regula la producción de plaquetas, como algunos ejemplos de factores de crecimiento específicos del linaje5. El FACS marcado con antígeno de superficie celular y la clasificación celular activada magnéticamente (MACS) son métodos bien establecidos para el aislamiento y la purificación de los tipos específicos de células derivadas de la médula ósea6.
Aunque los estudios neonatales están avanzando hacia la búsqueda de las causas de las muertes neonatales y el tratamiento de las complicaciones durante los partos prematuros, el desarrollo terapéutico directo sigue siendo una necesidad médica insatisfecha. Smith y Davis afirmaron: “Los pacientes pediátricos siguen siendo huérfanos terapéuticos”7. Existen varios desafíos, como muestras pequeñas, efectos de por vida del resultado y cuestiones éticas en la obtención del consentimiento en los estudios clínicos de neonatos8. Por lo tanto, existe una gran demanda de modelos de estudio in vivo e in vitro específicos para neonatos para lograr relevancia traslacional. Debido a las similitudes entre los niveles anatómicos y tisulares, los períodos de gestación cortos y el tamaño de las camadas, los roedores son el sistema modelo de mamíferos más estudiado.
Aquí, describimos un procedimiento detallado, altamente factible y reproducible para aislar médula ósea de crías de ratón de 7-9 días de edad y su capacidad para diferenciarse en macrófagos. Sin embargo, se podría lograr una variedad de linajes celulares con el uso de señales de diferenciación distintas. También demostramos la presencia de marcadores de superficie celular y la presencia de actividad fagocítica in vitro esperada para los macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM).
Protocol
Representative Results
Discussion
La investigación con modelos de ratones neonatos puede presentar una serie de desafíos. Los neonatos tienen un sistema inmunológico en desarrollo que es único en comparación con los adultos8. Como tal, no se debe asumir que los datos generados a partir de modelos animales adultos se aplican a los recién nacidos, y varios trabajos publicados han articulado bien esta idea18,19. Por lo tanto, se necesitan modelos neonatales específicos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud [R01 AI163333] para CMR. Reconocemos el apoyo financiero adicional brindado a la Instalación Central de Citometría de Flujo y Célula Única de la Universidad de Virginia Occidental mediante las siguientes subvenciones: WV CTSI grant GM104942, Tumor Microenvironment CoBRE grant GM121322 y NIH grant OD016165.
Materials
| 40 µm strainer | Greiner | 542040 | Cell culture |
| 96 well round (U) bottom plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | Cell culture |
| Anti-mouse CD11b-BV786 | BD Biosciences | 740861 | FACS analysis |
| Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488 | BD Biosciences | 141709 | FACS analysis |
| Anti-mouse F4/80-PE | BD Biosciences | 565410 | FACS analysis |
| Countess3 | Thermo Scientific | TSI-C3ACC | Automated cell counter |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Cell culture |
| DMSO | VWR | WN182 | Cell culture |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | Cell culture |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | Infection |
| EVOS FL | Invitrogen | 12-563-649 | Cell Imaging System |
| FBS | Avantor | 76419-584 | Cell culture |
| FluoroBright BMDM | Thermo fisher Scientific | A1896701 | Dye free culture media |
| Glutamine | Cytiva | SH30034.01 | Cell culture |
| HEPES | Cytiva | SH30237.01 | Cell culture |
| L-929 | ATCC | Differentiation | |
| LSRFortessa | Becton Dickinson | Flowcytometer | |
| Lysotracker red DND 99 | Invitrogen | L7528 | Fluorescent dye |
| MEM | Corning | 15-010-CV | Cell culture |
| Penicillin /streptomycin | Hyclone | SV30010 | Cell culture |
| pHrodo green STP ester | Invitrogen | P35369 | Fluorescent dye |
| T75 flask | Cell star | 658170 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300120 | Cell culture |
| Zeiss 710 | Zeiss | P20GM103434 | Confocal |
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