Этот протокол описывает неферментативный и простой метод выделения 7-9-дневных клеток костного мозга новорожденных мышей и получения дифференцированных макрофагов с использованием надосадочной жидкости клеток L929 в качестве источника гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (M-CSF). Макрофаги, полученные из костного мозга, были дополнительно проанализированы на поверхностные антигены F4/80, CD206, CD11b и функциональную компетентность.
Хорошо известны различные методы выделения костного мозга от взрослых мышей. Тем не менее, выделение костного мозга у неонатальных мышей является сложной и трудоемкой задачей, но для некоторых моделей это является трансляционно актуальным и необходимым. Этот протокол описывает эффективный и простой метод получения клеток костного мозга у 7-9-дневных щенков. Затем эти клетки могут быть дополнительно выделены или дифференцированы в конкретные типы клеток, представляющие интерес. Макрофаги являются важнейшими иммунными клетками, которые играют важную роль в воспалении и инфекции. Во время развития неонатальные макрофаги вносят значительный вклад в ремоделирование тканей. Более того, фенотип и функции неонатальных макрофагов отличаются от таковых у их взрослых собратьев. В этом протоколе также описана дифференцировка неонатальных макрофагов из выделенных клеток костного мозга в присутствии среды, кондиционированной L929. Поверхностные маркеры дифференцированных неонатальных макрофагов оценивали с помощью проточного цитометрического анализа. Для демонстрации функциональности фагоцитарная эффективность также была проверена с использованием pH-чувствительной красителя, конъюгированной с Escherichia coli.
Костный мозг включает в себя как гемопоэтические, так и мезенхимальные популяции стволовых клеток, которые являются самовозобновляемыми и могут дифференцироваться в различные клеточные линии. Гемопоэтические стволовые клетки в костном мозге дают начало миелоидным и лимфоидным линиям1. Мезенхимальные стволовые клетки продуцируют остеобласты (кости), адипоциты (жир) или хондроциты (хрящи)2. Эти клетки имеют множество применений в области клеточной биологии и тканевой инженерии, включая генную терапию 3,4. Клетки-предшественники, присутствующие в костном мозге, дифференцируются в определенные типы клеток в присутствии факторов, специфичных для линии. Эритропоэтин способствует пролиферации эритроидных клеток-предшественников, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) стимулирует рост колоний нейтрофилов, а тромбопоэтин регулирует выработку тромбоцитов в качестве нескольких примеров линейно-специфических факторов роста5. FACS, меченный антигеном на клеточной поверхности, и магнитно-активируемая сортировка клеток (MACS) являются хорошо зарекомендовавшими себя методами выделения и очистки специфических типов клеток, полученных из костного мозга6.
Несмотря на то, что неонатальные исследования продвигаются вперед в направлении поиска причин неонатальной смертности и устранения осложнений при преждевременных родах, прямая терапевтическая разработка остается неудовлетворенной медицинской потребностью. Смит и Дэвис утверждали: «Педиатрические пациенты остаются терапевтическими сиротами»7. Существует несколько проблем, таких как небольшие выборки, пожизненные последствия исхода и этические проблемы при получении согласия в клинических исследованиях новорожденных8. Следовательно, существует высокий спрос на модели исследований in vivo и in vitro , специфичные для новорожденных, для достижения трансляционной релевантности. Из-за сходства между анатомическим и тканевым уровнями, коротких периодов беременности и размеров помета, грызуны являются наиболее изученной модельной системой млекопитающих.
В этой статье мы опишем подробную, вполне осуществимую и воспроизводимую процедуру выделения костного мозга у 7-9-дневных детенышей мышей и их способность дифференцироваться в макрофаги. Тем не менее, разнообразие клеточных линий может быть достигнуто с помощью различных сигналов дифференцировки. Мы также демонстрируем наличие маркеров клеточной поверхности и наличие фагоцитарной активности in vitro , ожидаемой для макрофагов, полученных из костного мозга (МПМД).
Исследования с использованием неонатальных мышиных моделей могут быть сопряжены с рядом проблем. Новорожденные имеют развивающуюся иммунную систему, которая уникальна по сравнению со взрослыми8. Таким образом, данные, полученные на моделях взрослых животных, не должны пр…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения [R01 AI163333] для CMR. Мы выражаем признательность за дополнительную финансовую поддержку, предоставленную Центру проточной цитометрии и ядра одиночных клеток Университета Западной Вирджинии в виде следующих грантов: грант WV CTSI GM104942, грант CoBRE для микроокружения опухолей GM121322 и грант NIH OD016165.
40 µm strainer | Greiner | 542040 | Cell culture |
96 well round (U) bottom plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | Cell culture |
Anti-mouse CD11b-BV786 | BD Biosciences | 740861 | FACS analysis |
Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488 | BD Biosciences | 141709 | FACS analysis |
Anti-mouse F4/80-PE | BD Biosciences | 565410 | FACS analysis |
Countess3 | Thermo Scientific | TSI-C3ACC | Automated cell counter |
DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Cell culture |
DMSO | VWR | WN182 | Cell culture |
DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | Cell culture |
Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | Infection |
EVOS FL | Invitrogen | 12-563-649 | Cell Imaging System |
FBS | Avantor | 76419-584 | Cell culture |
FluoroBright BMDM | Thermo fisher Scientific | A1896701 | Dye free culture media |
Glutamine | Cytiva | SH30034.01 | Cell culture |
HEPES | Cytiva | SH30237.01 | Cell culture |
L-929 | ATCC | Differentiation | |
LSRFortessa | Becton Dickinson | Flowcytometer | |
Lysotracker red DND 99 | Invitrogen | L7528 | Fluorescent dye |
MEM | Corning | 15-010-CV | Cell culture |
Penicillin /streptomycin | Hyclone | SV30010 | Cell culture |
pHrodo green STP ester | Invitrogen | P35369 | Fluorescent dye |
T75 flask | Cell star | 658170 | Cell culture |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300120 | Cell culture |
Zeiss 710 | Zeiss | P20GM103434 | Confocal |