Summary

Выделение костного мозга мышей у новорожденных и получение макрофагов костного мозга

Published: May 24, 2024
doi:

Summary

Этот протокол описывает неферментативный и простой метод выделения 7-9-дневных клеток костного мозга новорожденных мышей и получения дифференцированных макрофагов с использованием надосадочной жидкости клеток L929 в качестве источника гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (M-CSF). Макрофаги, полученные из костного мозга, были дополнительно проанализированы на поверхностные антигены F4/80, CD206, CD11b и функциональную компетентность.

Abstract

Хорошо известны различные методы выделения костного мозга от взрослых мышей. Тем не менее, выделение костного мозга у неонатальных мышей является сложной и трудоемкой задачей, но для некоторых моделей это является трансляционно актуальным и необходимым. Этот протокол описывает эффективный и простой метод получения клеток костного мозга у 7-9-дневных щенков. Затем эти клетки могут быть дополнительно выделены или дифференцированы в конкретные типы клеток, представляющие интерес. Макрофаги являются важнейшими иммунными клетками, которые играют важную роль в воспалении и инфекции. Во время развития неонатальные макрофаги вносят значительный вклад в ремоделирование тканей. Более того, фенотип и функции неонатальных макрофагов отличаются от таковых у их взрослых собратьев. В этом протоколе также описана дифференцировка неонатальных макрофагов из выделенных клеток костного мозга в присутствии среды, кондиционированной L929. Поверхностные маркеры дифференцированных неонатальных макрофагов оценивали с помощью проточного цитометрического анализа. Для демонстрации функциональности фагоцитарная эффективность также была проверена с использованием pH-чувствительной красителя, конъюгированной с Escherichia coli.

Introduction

Костный мозг включает в себя как гемопоэтические, так и мезенхимальные популяции стволовых клеток, которые являются самовозобновляемыми и могут дифференцироваться в различные клеточные линии. Гемопоэтические стволовые клетки в костном мозге дают начало миелоидным и лимфоидным линиям1. Мезенхимальные стволовые клетки продуцируют остеобласты (кости), адипоциты (жир) или хондроциты (хрящи)2. Эти клетки имеют множество применений в области клеточной биологии и тканевой инженерии, включая генную терапию 3,4. Клетки-предшественники, присутствующие в костном мозге, дифференцируются в определенные типы клеток в присутствии факторов, специфичных для линии. Эритропоэтин способствует пролиферации эритроидных клеток-предшественников, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) стимулирует рост колоний нейтрофилов, а тромбопоэтин регулирует выработку тромбоцитов в качестве нескольких примеров линейно-специфических факторов роста5. FACS, меченный антигеном на клеточной поверхности, и магнитно-активируемая сортировка клеток (MACS) являются хорошо зарекомендовавшими себя методами выделения и очистки специфических типов клеток, полученных из костного мозга6.

Несмотря на то, что неонатальные исследования продвигаются вперед в направлении поиска причин неонатальной смертности и устранения осложнений при преждевременных родах, прямая терапевтическая разработка остается неудовлетворенной медицинской потребностью. Смит и Дэвис утверждали: «Педиатрические пациенты остаются терапевтическими сиротами»7. Существует несколько проблем, таких как небольшие выборки, пожизненные последствия исхода и этические проблемы при получении согласия в клинических исследованиях новорожденных8. Следовательно, существует высокий спрос на модели исследований in vivo и in vitro , специфичные для новорожденных, для достижения трансляционной релевантности. Из-за сходства между анатомическим и тканевым уровнями, коротких периодов беременности и размеров помета, грызуны являются наиболее изученной модельной системой млекопитающих.

В этой статье мы опишем подробную, вполне осуществимую и воспроизводимую процедуру выделения костного мозга у 7-9-дневных детенышей мышей и их способность дифференцироваться в макрофаги. Тем не менее, разнообразие клеточных линий может быть достигнуто с помощью различных сигналов дифференцировки. Мы также демонстрируем наличие маркеров клеточной поверхности и наличие фагоцитарной активности in vitro , ожидаемой для макрофагов, полученных из костного мозга (МПМД).

Protocol

Все процедуры были одобрены Комитетами по уходу за животными и их использованию в учреждении Западной Вирджинии и выполнены в соответствии с рекомендациями Руководства по уходу за лабораторными животными и их использованию Национальным исследовательским советом. Для исследования и?…

Representative Results

Используя метод, описанный в этом исследовании, можно успешно выделить от 25 до 37 миллионов клеток костного мозга из помета из пяти детенышей мышей C57BL/6. Этот метод был проверен при размерах помета от 5 до 7 щенков. Минимальный возраст для изоляции в наших экспериментах составлял 7 дней. В з…

Discussion

Исследования с использованием неонатальных мышиных моделей могут быть сопряжены с рядом проблем. Новорожденные имеют развивающуюся иммунную систему, которая уникальна по сравнению со взрослыми8. Таким образом, данные, полученные на моделях взрослых животных, не должны пр…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения [R01 AI163333] для CMR. Мы выражаем признательность за дополнительную финансовую поддержку, предоставленную Центру проточной цитометрии и ядра одиночных клеток Университета Западной Вирджинии в виде следующих грантов: грант WV CTSI GM104942, грант CoBRE для микроокружения опухолей GM121322 и грант NIH OD016165.

Materials

40 µm strainer Greiner 542040 Cell culture
96 well round (U) bottom plate Thermo Scientific 12-565-65 Cell culture
Anti-mouse CD11b-BV786 BD Biosciences 740861 FACS analysis
Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488 BD Biosciences 141709 FACS analysis
Anti-mouse F4/80-PE BD Biosciences 565410 FACS analysis
Countess3 Thermo Scientific TSI-C3ACC Automated cell counter
DMEM Hyclone SH30022.01 Cell culture
DMSO VWR WN182 Cell culture
DPBS, 1x Corning 21-031-CV Cell culture
Escherichia coli O1:K1:H7 ATCC 11775 Infection
EVOS FL  Invitrogen 12-563-649 Cell Imaging System 
FBS Avantor  76419-584 Cell culture
FluoroBright BMDM Thermo fisher Scientific A1896701 Dye free culture media
Glutamine Cytiva SH30034.01 Cell culture
HEPES Cytiva SH30237.01 Cell culture
L-929 ATCC Differentiation
LSRFortessa Becton Dickinson Flowcytometer
Lysotracker red DND 99 Invitrogen L7528 Fluorescent dye
MEM Corning 15-010-CV Cell culture
Penicillin /streptomycin  Hyclone SV30010 Cell culture
pHrodo green STP ester  Invitrogen P35369 Fluorescent dye
T75 flask Cell star 658170 Cell culture
Trypsin-EDTA Gibco 25300120 Cell culture
Zeiss 710  Zeiss P20GM103434 Confocal

References

  1. Lucas, D. Structural organization of the bone marrow and its role in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 28 (1), 36-42 (2021).
  2. Deb, A. How stem cells turn into bone and fat. N Engl J Med. 380 (23), 2268-2270 (2019).
  3. Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: Aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
  4. Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
  5. Kaushansky, K. Lineage-specific hematopoietic growth factors. N Engl J Med. 354 (19), 2034-2045 (2006).
  6. Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. J Orthop Translat. 3 (1), 26-33 (2015).
  7. Smith, A. M., Davis, J. M. Challenges and opportunities to enhance global drug development in neonates. Curr Opin Pediatr. 29 (2), 149-152 (2017).
  8. Lagler, F. B., Hirschfeld, S., Kindblom, J. M. Challenges in clinical trials for children and young people. Arch Dis Child. 106 (4), 321-325 (2021).
  9. Heap, R. E., et al. Proteomics characterization of the L929 cell supernatant and its role in BMDM differentiation. Life Sci Alliance. 4 (6), 202000957 (2021).
  10. Weischenfeldt, J., Bone Porse, B. marrow-derived macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
  11. Goncalves, R., Kaliff Teofilo Murta, G., Aparecidade de Souza, I., Mosser, D. M. Isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice. J Vis Exp. (196), e64566 (2023).
  12. Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: An effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
  13. Springer, T., Galfre, G., Secher, D. S., Milstein, C. Mac-1: A macrophage differentiation antigen identified by monoclonal antibody. Eur J Immunol. 9 (4), 301-306 (1979).
  14. Austyn, J. M., Gordon, S. F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage. Eur J Immunol. 11 (10), 805-815 (1981).
  15. Akbarshahi, H., Menzel, M., Posaric Bauden, M., Rosendahl, A., Andersson, R. Enrichment of murine CD68+ CCR2+ and CD68+ CD206+ lung macrophages in acute pancreatitis-associated acute lung injury. PLoS One. 7 (10), e42654 (2012).
  16. Yao, Y., Xu, X. H., Jin, L. Macrophage polarization in physiological and pathological pregnancy. Front Immunol. 10, 792 (2019).
  17. Lu, L., et al. Differential expression of CD11c defines two types of tissue-resident macrophages with different origins in steady-state salivary glands. Sci Rep. 12 (1), 931 (2022).
  18. Harbeson, D., Ben-Othman, R., Amenyogbe, N., Kollmann, T. R. Outgrowing the immaturity myth: The cost of defending from neonatal infectious disease. Front Immunol. 9, 1077 (2018).
  19. Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: Lessons from immune ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
  20. Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 930358 (2022).
  21. Winterberg, T., et al. Distinct phenotypic features of neonatal murine macrophages). Eur J Immunol. 45 (1), 214-224 (2015).
  22. de Brito Monteiro, L., et al. M-CSF- and L929-derived macrophages present distinct metabolic profiles with similar inflammatory outcomes. Immunobiology. 225 (3), 151935 (2020).

Play Video

Cite This Article
Annamanedi, M., Vance, J. K., Robinson, C. M. Neonatal Mouse Bone Marrow Isolation and Preparation of Bone Marrow-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (207), e66613, doi:10.3791/66613 (2024).

View Video