עכבר יילודים בידוד מח עצם והכנת מקרופאגים שמקורם במח עצם
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לא אנזימטית ופשוטה לבידוד תאי מח עצם של עכבר יילודים בני 7-9 ימים ויצירת מקרופאגים ממוינים באמצעות סופרנאטנט של תאי L929 כמקור לגורם מגרה מושבת גרנולוציטים (M-CSF). המקרופאגים שמקורם במח עצם נותחו עוד יותר עבור אנטיגנים פני השטח F4/80, CD206, CD11b וכשירות תפקודית.
Abstract
טכניקות שונות לבידוד מח עצם מעכברים בוגרים כבר מבוססות היטב. עם זאת, בידוד מח עצם מעכברים ילודים הוא מאתגר וגוזל זמן, אך עבור דגמים מסוימים, הוא רלוונטי והכרחי מבחינה תרגומית. פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה ופשוטה להכנת תאי מח עצם מגורים בני 7-9 ימים. תאים אלה יכולים להיות מבודדים עוד יותר או להתמיין לסוגי תאים ספציפיים בעלי עניין. מקרופאגים הם תאי חיסון חיוניים שממלאים תפקיד מרכזי בדלקת ובזיהום. במהלך ההתפתחות, מקרופאגים בילודים תורמים באופן משמעותי לעיצוב מחדש של רקמות. יתר על כן, הפנוטיפ והתפקודים של מקרופאגים בילודים שונים מאלה של עמיתיהם הבוגרים. פרוטוקול זה מתאר גם את ההתמיינות של מקרופאגים בילודים מתאי מח עצם מבודדים בנוכחות תווך מותנה L929. סמני פני השטח של מקרופאגים יילודים מובחנים הוערכו באמצעות אנליזה ציטומטרית של זרימה. כדי להדגים פונקציונליות, היעילות הפאגוציטית נבדקה גם באמצעות Escherichia coli מצומד לצבע הרגיש ל- pH.
Introduction
מח עצם מקיף אוכלוסיות תאי גזע המטופויטיות ומזנכימליות המתחדשות מעצמן וניתן להתמיין לשושלות תאים שונות. תאי גזע המטופויטיים במח העצם מולידים שושלות מיאלואידיות ולימפואידיות1. תאי גזע מזנכימליים מייצרים אוסטאובלסטים (עצם), אדיפוציטים (שומן) או כונדרוציטים (סחוס)2. לתאים אלה יישומים רבים בתחום הביולוגיה של התא והנדסת רקמות, כולל ריפוי גנטי 3,4. תאי אב הנמצאים במח העצם מתמיינים לסוגי תאים ספציפיים בנוכחות גורמי גדילה ספציפיים לשושלת. Erythropoietin מקדם את התפשטות של תאי אב אריתרואידים, גורם מגרה מושבת גרנולוציטים (G-CSF) מגרה את הצמיחה של מושבות נויטרופילים, ו thrombopoietin מסדיר את הייצור של טסיות כמו כמה דוגמאות של גורמי גדילה ספציפיים לשושלת5. אנטיגן פני השטח של התא המסומן FACS ומיון תאים המופעלים מגנטית (MACS) הן שיטות מבוססות היטב לבידוד וטיהור של סוגי תאים ספציפיים שמקורם במח עצם6.
למרות שמחקרי יילודים מתקדמים לקראת מציאת הגורמים למוות יילודים וטיפול בסיבוכים במהלך לידות מוקדמות, פיתוח טיפולי ישיר נותר צורך רפואי שלא נענה. סמית ודיוויס הצהירו, “ילדים חולים נשארים יתומים טיפוליים”7. ישנם מספר אתגרים, כגון דגימות קטנות, השפעות לכל החיים של התוצאה, ובעיות אתיות בקבלת הסכמה במחקרים קליניים של יילודים8. לפיכך, יש ביקוש גבוה למודלים של מחקר in vivo ו – in vitro ספציפיים ליילודים כדי להשיג רלוונטיות תרגומית. בגלל הדמיון בין רמות אנטומיות ורקמות, תקופות הריון קצרות וגודל המלטה, מכרסמים הם מערכת המודל הנחקרת ביותר של יונקים.
במאמר זה אנו מתארים הליך מפורט, אפשרי ביותר וניתן לשחזור לבידוד מח עצם מגורי עכברים בני 7-9 ימים ויכולתם להתמיין למקרופאגים. עם זאת, ניתן להשיג מגוון של שושלות תאים באמצעות שימוש באותות התמיינות ברורים. אנו גם מדגימים נוכחות של סמנים על פני השטח של התא ואת הנוכחות של פעילות פגוציטית במבחנה הצפויה עבור מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMDM).
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר המערב מודלים של עכברי יילודים יכול להציב מספר אתגרים. ליילודים יש מערכת חיסונית מתפתחת שהיא ייחודית בהשוואה למבוגרים8. לפיכך, אין להניח שנתונים שנוצרו ממודלים של בעלי חיים בוגרים חלים על תינוקות, וכמה עבודות שפורסמו ביטאו רעיון זה היטב18,19….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות [R01 AI163333] ל- CMR. אנו מכירים בתמיכת מימון נוספת הניתנת ל- West Virginia University Flow Cytometry and Single Cell Core Facility על ידי המענקים הבאים: WV CTSI grant GM104942, Tumor Microenvironment CoBRE grant GM121322 ומענק NIH OD016165.
Materials
| 40 µm strainer | Greiner | 542040 | Cell culture |
| 96 well round (U) bottom plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | Cell culture |
| Anti-mouse CD11b-BV786 | BD Biosciences | 740861 | FACS analysis |
| Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488 | BD Biosciences | 141709 | FACS analysis |
| Anti-mouse F4/80-PE | BD Biosciences | 565410 | FACS analysis |
| Countess3 | Thermo Scientific | TSI-C3ACC | Automated cell counter |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Cell culture |
| DMSO | VWR | WN182 | Cell culture |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | Cell culture |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | Infection |
| EVOS FL | Invitrogen | 12-563-649 | Cell Imaging System |
| FBS | Avantor | 76419-584 | Cell culture |
| FluoroBright BMDM | Thermo fisher Scientific | A1896701 | Dye free culture media |
| Glutamine | Cytiva | SH30034.01 | Cell culture |
| HEPES | Cytiva | SH30237.01 | Cell culture |
| L-929 | ATCC | Differentiation | |
| LSRFortessa | Becton Dickinson | Flowcytometer | |
| Lysotracker red DND 99 | Invitrogen | L7528 | Fluorescent dye |
| MEM | Corning | 15-010-CV | Cell culture |
| Penicillin /streptomycin | Hyclone | SV30010 | Cell culture |
| pHrodo green STP ester | Invitrogen | P35369 | Fluorescent dye |
| T75 flask | Cell star | 658170 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300120 | Cell culture |
| Zeiss 710 | Zeiss | P20GM103434 | Confocal |
References
- Lucas, D. Structural organization of the bone marrow and its role in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 28 (1), 36-42 (2021).
- Deb, A. How stem cells turn into bone and fat. N Engl J Med. 380 (23), 2268-2270 (2019).
- Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: Aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
- Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
- Kaushansky, K. Lineage-specific hematopoietic growth factors. N Engl J Med. 354 (19), 2034-2045 (2006).
- Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. J Orthop Translat. 3 (1), 26-33 (2015).
- Smith, A. M., Davis, J. M. Challenges and opportunities to enhance global drug development in neonates. Curr Opin Pediatr. 29 (2), 149-152 (2017).
- Lagler, F. B., Hirschfeld, S., Kindblom, J. M. Challenges in clinical trials for children and young people. Arch Dis Child. 106 (4), 321-325 (2021).
- Heap, R. E., et al. Proteomics characterization of the L929 cell supernatant and its role in BMDM differentiation. Life Sci Alliance. 4 (6), 202000957 (2021).
- Weischenfeldt, J., Bone Porse, B. marrow-derived macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Goncalves, R., Kaliff Teofilo Murta, G., Aparecidade de Souza, I., Mosser, D. M. Isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice. J Vis Exp. (196), e64566 (2023).
- Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: An effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
- Springer, T., Galfre, G., Secher, D. S., Milstein, C. Mac-1: A macrophage differentiation antigen identified by monoclonal antibody. Eur J Immunol. 9 (4), 301-306 (1979).
- Austyn, J. M., Gordon, S. F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage. Eur J Immunol. 11 (10), 805-815 (1981).
- Akbarshahi, H., Menzel, M., Posaric Bauden, M., Rosendahl, A., Andersson, R. Enrichment of murine CD68+ CCR2+ and CD68+ CD206+ lung macrophages in acute pancreatitis-associated acute lung injury. PLoS One. 7 (10), e42654 (2012).
- Yao, Y., Xu, X. H., Jin, L. Macrophage polarization in physiological and pathological pregnancy. Front Immunol. 10, 792 (2019).
- Lu, L., et al. Differential expression of CD11c defines two types of tissue-resident macrophages with different origins in steady-state salivary glands. Sci Rep. 12 (1), 931 (2022).
- Harbeson, D., Ben-Othman, R., Amenyogbe, N., Kollmann, T. R. Outgrowing the immaturity myth: The cost of defending from neonatal infectious disease. Front Immunol. 9, 1077 (2018).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: Lessons from immune ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
- Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 930358 (2022).
- Winterberg, T., et al. Distinct phenotypic features of neonatal murine macrophages). Eur J Immunol. 45 (1), 214-224 (2015).
- de Brito Monteiro, L., et al. M-CSF- and L929-derived macrophages present distinct metabolic profiles with similar inflammatory outcomes. Immunobiology. 225 (3), 151935 (2020).
