Neonatale beenmergisolatie bij muizen en bereiding van van beenmerg afgeleide macrofagen
Summary
Dit protocol beschrijft een niet-enzymatische en eenvoudige methode voor het isoleren van 7-9 dagen oude neonatale beenmergcellen van muizen en het genereren van gedifferentieerde macrofagen met behulp van een supernatans van L929-cellen als bron van granulocytkoloniestimulerende factor (M-CSF). De van beenmerg afgeleide macrofagen werden verder geanalyseerd op oppervlakteantigenen F4/80, CD206, CD11b en functionele competentie.
Abstract
Verschillende technieken voor het isoleren van beenmerg van volwassen muizen zijn goed ingeburgerd. Het isoleren van beenmerg van neonatale muizen is echter uitdagend en tijdrovend, maar voor sommige modellen is het translationeel relevant en noodzakelijk. Dit protocol beschrijft een efficiënte en ongecompliceerde methode voor het bereiden van beenmergcellen van pups van 7-9 dagen oud. Deze cellen kunnen vervolgens verder worden geïsoleerd of gedifferentieerd tot specifieke celtypen die van belang zijn. Macrofagen zijn cruciale immuuncellen die een belangrijke rol spelen bij ontstekingen en infecties. Tijdens de ontwikkeling dragen neonatale macrofagen aanzienlijk bij aan de hermodellering van weefsel. Bovendien verschillen het fenotype en de functies van neonatale macrofagen van die van hun volwassen tegenhangers. Dit protocol schetst ook de differentiatie van neonatale macrofagen van de geïsoleerde beenmergcellen in aanwezigheid van L929-geconditioneerd medium. Oppervlaktemarkers voor gedifferentieerde neonatale macrofagen werden beoordeeld met behulp van flowcytometrische analyse. Om de functionaliteit aan te tonen, werd de fagocytische efficiëntie ook getest met behulp van pH-gevoelige kleurstofgeconjugeerde Escherichia coli.
Introduction
Beenmerg omsluit zowel hematopoëtische als mesenchymale stamcelpopulaties die zichzelf hernieuwbaar zijn en kunnen worden gedifferentieerd in verschillende cellijnen. Hematopoëtische stamcellen in het beenmerg geven aanleiding tot myeloïde en lymfoïde lijnen1. Mesenchymale stamcellen produceren osteoblasten (bot), adipocyten (vet) of chondrocyten (kraakbeen)2. Deze cellen hebben meerdere toepassingen op het gebied van celbiologie en weefselmanipulatie, waaronder gentherapie 3,4. Voorlopercellen die in het beenmerg aanwezig zijn, differentiëren tot specifieke celtypen in aanwezigheid van afstammingsspecifieke groeifactoren. Erytropoëtine bevordert de proliferatie van erytroïde voorlopercellen, granulocytkoloniestimulerende factor (G-CSF) stimuleert de groei van neutrofielenkolonies en trombopoëtine reguleert de productie van bloedplaatjes als enkele voorbeelden van afstammingsspecifieke groeifactoren5. Celoppervlakteantigeen gelabeld FACS en magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) zijn gevestigde methoden voor isolatie en zuivering van de specifieke van beenmerg afgeleide celtypen6.
Hoewel neonatale studies vooruitgang boeken in de richting van het vinden van de oorzaken van neonatale sterfgevallen en het aanpakken van de complicaties tijdens vroeggeboorten, blijft directe therapeutische ontwikkeling een onvervulde medische behoefte. Smith en Davis verklaarden: “Pediatrische patiënten blijven therapeutische weeskinderen”7. Er zijn verschillende uitdagingen, zoals kleine steekproeven, levenslange effecten van de uitkomst en ethische kwesties bij het verkrijgen van toestemming in klinische onderzoeken naar pasgeborenen8. Daarom is er een grote vraag naar in vivo en in vitro onderzoeksmodellen die specifiek zijn voor pasgeborenen om translationele relevantie te bereiken. Vanwege de overeenkomsten tussen anatomische en weefselniveaus, korte zwangerschapsperioden en worpgroottes, zijn knaagdieren het meest bestudeerde zoogdiermodelsysteem.
Hier beschrijven we een gedetailleerde, zeer haalbare en reproduceerbare procedure voor het isoleren van beenmerg van 7-9 dagen oude muizenpups en hun vermogen om te differentiëren in macrofagen. Een verscheidenheid aan cellijnen kan echter worden bereikt met behulp van verschillende differentiatiesignalen. We tonen ook de aanwezigheid aan van merkers op het celoppervlak en de aanwezigheid van in vitro fagocytische activiteit die wordt verwacht voor van beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM’s).
Protocol
Representative Results
Discussion
Onderzoek met neonatale muismodellen kan een aantal uitdagingen met zich meebrengen. Pasgeborenen hebben een zich ontwikkelend immuunsysteem dat uniek is in vergelijking met volwassenen8. Als zodanig mogen gegevens die zijn gegenereerd uit volwassen diermodellen niet worden verondersteld van toepassing te zijn op pasgeborenen, en verschillende gepubliceerde werken hebben dit idee goed verwoord18,19. Daarom zijn neonatale-specifieke modelle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health [R01 AI163333] aan CMR. We erkennen aanvullende financiële steun die wordt verleend aan de West Virginia University Flow Cytometry and Single Cell Core Facility door de volgende subsidies: WV CTSI-subsidie GM104942, Tumor Microenvironment CoBRE-subsidie GM121322 en NIH-subsidie OD016165.
Materials
| 40 µm strainer | Greiner | 542040 | Cell culture |
| 96 well round (U) bottom plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | Cell culture |
| Anti-mouse CD11b-BV786 | BD Biosciences | 740861 | FACS analysis |
| Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488 | BD Biosciences | 141709 | FACS analysis |
| Anti-mouse F4/80-PE | BD Biosciences | 565410 | FACS analysis |
| Countess3 | Thermo Scientific | TSI-C3ACC | Automated cell counter |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Cell culture |
| DMSO | VWR | WN182 | Cell culture |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | Cell culture |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | Infection |
| EVOS FL | Invitrogen | 12-563-649 | Cell Imaging System |
| FBS | Avantor | 76419-584 | Cell culture |
| FluoroBright BMDM | Thermo fisher Scientific | A1896701 | Dye free culture media |
| Glutamine | Cytiva | SH30034.01 | Cell culture |
| HEPES | Cytiva | SH30237.01 | Cell culture |
| L-929 | ATCC | Differentiation | |
| LSRFortessa | Becton Dickinson | Flowcytometer | |
| Lysotracker red DND 99 | Invitrogen | L7528 | Fluorescent dye |
| MEM | Corning | 15-010-CV | Cell culture |
| Penicillin /streptomycin | Hyclone | SV30010 | Cell culture |
| pHrodo green STP ester | Invitrogen | P35369 | Fluorescent dye |
| T75 flask | Cell star | 658170 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300120 | Cell culture |
| Zeiss 710 | Zeiss | P20GM103434 | Confocal |
References
- Lucas, D. Structural organization of the bone marrow and its role in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 28 (1), 36-42 (2021).
- Deb, A. How stem cells turn into bone and fat. N Engl J Med. 380 (23), 2268-2270 (2019).
- Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: Aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
- Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
- Kaushansky, K. Lineage-specific hematopoietic growth factors. N Engl J Med. 354 (19), 2034-2045 (2006).
- Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. J Orthop Translat. 3 (1), 26-33 (2015).
- Smith, A. M., Davis, J. M. Challenges and opportunities to enhance global drug development in neonates. Curr Opin Pediatr. 29 (2), 149-152 (2017).
- Lagler, F. B., Hirschfeld, S., Kindblom, J. M. Challenges in clinical trials for children and young people. Arch Dis Child. 106 (4), 321-325 (2021).
- Heap, R. E., et al. Proteomics characterization of the L929 cell supernatant and its role in BMDM differentiation. Life Sci Alliance. 4 (6), 202000957 (2021).
- Weischenfeldt, J., Bone Porse, B. marrow-derived macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Goncalves, R., Kaliff Teofilo Murta, G., Aparecidade de Souza, I., Mosser, D. M. Isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice. J Vis Exp. (196), e64566 (2023).
- Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: An effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
- Springer, T., Galfre, G., Secher, D. S., Milstein, C. Mac-1: A macrophage differentiation antigen identified by monoclonal antibody. Eur J Immunol. 9 (4), 301-306 (1979).
- Austyn, J. M., Gordon, S. F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage. Eur J Immunol. 11 (10), 805-815 (1981).
- Akbarshahi, H., Menzel, M., Posaric Bauden, M., Rosendahl, A., Andersson, R. Enrichment of murine CD68+ CCR2+ and CD68+ CD206+ lung macrophages in acute pancreatitis-associated acute lung injury. PLoS One. 7 (10), e42654 (2012).
- Yao, Y., Xu, X. H., Jin, L. Macrophage polarization in physiological and pathological pregnancy. Front Immunol. 10, 792 (2019).
- Lu, L., et al. Differential expression of CD11c defines two types of tissue-resident macrophages with different origins in steady-state salivary glands. Sci Rep. 12 (1), 931 (2022).
- Harbeson, D., Ben-Othman, R., Amenyogbe, N., Kollmann, T. R. Outgrowing the immaturity myth: The cost of defending from neonatal infectious disease. Front Immunol. 9, 1077 (2018).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: Lessons from immune ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
- Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 930358 (2022).
- Winterberg, T., et al. Distinct phenotypic features of neonatal murine macrophages). Eur J Immunol. 45 (1), 214-224 (2015).
- de Brito Monteiro, L., et al. M-CSF- and L929-derived macrophages present distinct metabolic profiles with similar inflammatory outcomes. Immunobiology. 225 (3), 151935 (2020).
