Aislamiento nuclear de células sanguíneas criopreservadas in vitro

La hematopoyesis es un sistema de desarrollo relativamente bien caracterizado, pero la incapacidad de recapitular la formación de células sanguíneas in vitro demuestra una comprensión incompleta de los factores relacionados. Los modelos de hematopoyesis basados en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) pueden ayudar a dilucidar los factores clave del desarrollo y la biología relacionada. El sistema iPSC también ofrece un excelente modelo para estudiar los trastornos sanguíneos, y se han desarrollado células sanguíneas basadas en iPSC para producir reactivos relevantes desde el punto de vista traslacional y terapéutico 1,2,3,4. Los estudios de células individuales se han utilizado ampliamente para investigar la biología del desarrollo basada en iPSC, incluidos los tipos de células que se producen durante la hematopoyesis⁵. En comparación con la secuenciación masiva de ARN, que no puede inferir relaciones entre subpoblaciones celulares⁶, las modalidades de una sola célula permiten evaluar la heterogeneidad celular y pueden facilitar la identificación y caracterización del desarrollo celular ^6,7.

La formación de células hematopoyéticas a partir de iPSC requiere una diferenciación secuencial a través de estados primitivos de raya, mesodermo y endotelial para formar células endoteliales hemogénicas. Las células endoteliales hemogénicas son precursoras directas de las células madre y progenitoras hematopoyéticas⁸. Estos tipos de células tienen propiedades morfológicas y celulares notablemente diferentes. Existe una comprensión limitada del panorama epigenético y la dinámica del desarrollo de los modelos de células hematopoyéticas derivadas in vitro, aunque este es un conocimiento esencial para desbloquear todo el potencial terapéutico del sistema iPSC. En muchos casos, solo las modalidades de análisis de células individuales permiten la identificación de poblaciones celulares, actividades transcripcionales, paisajes de cromatina y mecanismos reguladores que gobiernan el desarrollo entre preparaciones celulares heterogéneas.

Dos metodologías, la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNAseq) y la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNAseq), pueden revelar información transcripcional a nivel de célula individual⁹. Un factor principal que dicta la validez y fiabilidad de los datos es la necesidad intransigente de muestras que cumplan con estrictos criterios de calidad. Estos incluyen requisitos precisos para la densidad celular/nuclear, viabilidad óptima y aglomeración mínima. La preparación de núcleos individuales puede ser un desafío técnico. Puede haber desafíos adicionales asociados con el uso de células previamente criopreservadas.

Observamos cuatro limitaciones potenciales importantes para los enfoques estándar de scRNAseq. En primer lugar, los protocolos estándar para generar suspensiones celulares a menudo hacen referencia a preparaciones a partir de células o tejidos frescos, en lugar de los recuperados después de la criopreservación¹⁰. Esto puede reducir la utilidad de recursos potencialmente valiosos. En segundo lugar, la eficiencia de disociación de diversos tipos de células es variable. Por ejemplo, muchos tipos de células inmunitarias se disocian con relativa facilidad. Por el contrario, las células estromalas, los fibroblastos y las células endoteliales, que normalmente están incrustadas en la matriz extracelular y la membrana basal, tienen propiedades celulares únicas que pueden complicar el aislamiento de los núcleos^11,12. Estas propiedades pueden requerir protocolos de disociación agresivos, lo que puede poner en peligro la integridad estructural de las poblaciones celulares más delicadas. En tercer lugar, algunas células (por ejemplo, los megacariocitos) pueden superar los 100 μm de diámetro y plantean dificultades para varias plataformas comerciales unicelulares existentes¹³. Además, el manejo inadecuado puede provocar daño celular y respuestas de estrés durante los pasos iniciales del aislamiento celular, involucrando hidrólisis enzimática y disociación mecánica, lo que puede afectar los perfiles de expresión génica^11,14.

Por estas y otras razones, un enfoque de un solo núcleo puede ser una alternativa preferible a los métodos de una sola célula¹⁵. Dada la estabilidad superior de la membrana nuclear en comparación con la membrana celular, la envoltura nuclear puede permanecer intacta incluso después de la criopreservación de tejidos¹⁶. Esto puede facilitar la extracción nuclear y mejorar la diversidad de tipos de muestras adecuados para las modalidades de secuenciación de próxima generación. En segundo lugar, los núcleos exhiben una mayor resistencia a las perturbaciones mecánicas y tienden a manifestar menos cambios transcripcionales durante la disociación¹⁴. Por lo tanto, los núcleos pueden proporcionar una mayor estabilidad del ARN y perfiles transcripcionales más reproducibles. Una tercera ventaja notable de los métodos de núcleo único es la falta de restricciones de tamaño celular y la aplicabilidad para células más grandes, como cardiomiocitos o megacariocitos¹². En cuarto lugar, los núcleos sirven como sustratos adecuados para los análisis multiómicos, que ofrecen una visión ampliada del análisis integrado de la expresión génica, las regiones de cromatina accesibles y otros parámetros¹⁷, lo que permite una comprensión más profunda de la heterogeneidad, el desarrollo y los estados funcionales de las células¹⁸.

Al perfilar las iPSC durante el desarrollo hematopoyético, los enfoques multiómicos pueden ayudar a definir los procesos de desarrollo en modelos de enfermedades normales o patológicas. Las comparaciones de células derivadas de iPSC con células o tejidos primarios también pueden proporcionar una evaluación de la fidelidad del modelo de iPSC a la biología in vivo , lo que facilita la mejora del modelo de iPSC y el descubrimiento de nuevas poblaciones celulares y factores que impulsan la formación de sangre.

Aunque muchos grupos han navegado con éxito el aislamiento nuclear y el análisis de secuenciación de próxima generación resultante, el aislamiento de núcleos de alta calidad sigue siendo una barrera para algunos laboratorios interesados en realizar análisis basados en un solo núcleo. Este manuscrito detalla un protocolo para aislar núcleos de calidad de células derivadas de iPSC previamente criopreservadas. Nos hemos centrado en las células estromalas/endoteliales adherentes y en las células progenitoras hematopoyéticas no adherentes, ya que representan tipos de células muy diferentes en cuanto a estructura y contenido que exigen modificaciones y resolución de problemas a medida para aumentar la recuperación de núcleos de alta calidad susceptibles de secuenciación de próxima generación u otros experimentos.