Выделение ядра из криоконсервированных клеток крови, полученных in vitro

Кроветворение является относительно хорошо охарактеризованной системой развития, но неспособность воспроизводить образование клеток крови in vitro демонстрирует неполное понимание связанных с этим факторов. Модели гемопоэза на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) могут помочь пролить свет на ключевые факторы развития и связанную с ними биологию. Система iPSC также предлагает отличную модель для изучения заболеваний крови, а клетки крови на основе iPSC были разработаны для производства трансляционных и терапевтически значимых реагентов 1,2,3,4. Исследования на отдельных клетках широко использовались для изучения биологии развития на основе ИПСК, включая типы клеток, которые образуются во время кроветворения⁵. По сравнению с объемным секвенированием РНК, которое не может вывести родство между^{субпопуляциями} клеток6, одноклеточные модальности позволяют оценить гетерогенность клеток и могут облегчить идентификацию и характеристику развития^{клеток6,7}.

Образование гемопоэтических клеток из ИПСК требует последовательной дифференцировки через примитивную полосу, мезодерму и эндотелиальные состояния для формирования гемогенных эндотелиальных клеток. Гемогенные эндотелиальные клетки являются прямыми предшественниками гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников⁸. Эти типы клеток имеют удивительно разные морфологические и клеточные свойства. Существует ограниченное понимание эпигенетического ландшафта и динамики развития моделей гемопоэтических клеток, полученных in vitro, хотя это важные знания для раскрытия полного терапевтического потенциала системы iPSC. Во многих случаях только методы анализа отдельных клеток позволяют идентифицировать клеточные популяции, транскрипционную активность, хроматиновые ландшафты и регуляторные механизмы, которые управляют развитием среди гетерогенных клеточных препаратов.

Две методологии, секвенирование РНК одной клетки (scRNAseq) и секвенирование РНК отдельных ядер (snRNAseq), могут выявить транскрипционные идеи^{на уровне отдельных} клеток9. Основным фактором, определяющим достоверность и надежность данных, является бескомпромиссная потребность в образцах, отвечающих строгим критериям качества. К ним относятся точные требования к плотности ячеек/ядер, оптимальной жизнеспособности и минимальному комкованию. Получение одиночных ядер может быть технически сложным. Могут возникнуть дополнительные проблемы, связанные с использованием ранее криоконсервированных клеток.

Мы отмечаем четыре важных потенциальных ограничения для стандартных подходов scRNAseq. Во-первых, стандартные протоколы получения клеточных суспензий часто ссылаются на препараты из свежих клеток или тканей, а не на те, которые были получены^после криоконсервации. Это может снизить полезность потенциально ценных ресурсов. Во-вторых, эффективность диссоциации различных типов клеток варьируется. Например, многие типы иммунных клеток подвергаются диссоциации с относительной легкостью. Напротив, стромальные клетки, фибробласты и эндотелиальные клетки, которые обычно встроены во внеклеточный матрикс и базальную мембрану, обладают уникальными клеточными свойствами, которые могут осложнить выделение ядер^11,12. Эти свойства могут потребовать агрессивных протоколов диссоциации, что может поставить под угрозу структурную целостность более чувствительных клеточных популяций. В-третьих, некоторые клетки (например, мегакариоциты) могут превышать 100 мкм в диаметре и создавать трудности для нескольких существующих коммерческих одноклеточных платформ¹³. Кроме того, неправильное обращение может привести к повреждению клеток и стрессовым реакциям на начальных этапах выделения клеток, включая ферментативный гидролиз и механическую диссоциацию, что может повлиять на профили экспрессии генов^11,14.

По этим и другим причинам одноклеточный подход может быть предпочтительной альтернативой методам с использованием одного^ядра15. Учитывая превосходную стабильность ядерной мембраны по сравнению с клеточной мембраной, ядерная оболочка может оставаться неповрежденной даже после криоконсервации^{тканей16}. Это может облегчить извлечение ядер и увеличить разнообразие типов образцов, пригодных для методов секвенирования следующего поколения. Во-вторых, ядра проявляют повышенную устойчивость к механическим возмущениям и, как правило, проявляют меньше транскрипционных сдвигов во время диссоциации^. Таким образом, ядра могут обеспечить большую стабильность РНК и более воспроизводимые транскрипционные профили. Третьим заслуживающим внимания преимуществом одноядерных методов является отсутствие ограничений по размеру клеток и применимость для более крупных клеток, таких как кардиомиоциты или мегакариоциты12. В-четвертых, ядра служат подходящими субстратами для мультиомных анализов, которые позволяют получить расширенное представление о экспрессии генов, доступных областях хроматина и^{других параметрах}, что позволяет глубже понять гетерогенность, развитие и^{функциональные состояния клеток}.

Профилируя ИПСК во время развития кроветворения, мультиомные подходы могут помочь определить процессы развития в моделях нормальных или патологических заболеваний. Сравнение клеток, полученных из ИПСК, с первичными клетками или тканями также может обеспечить оценку точности модели ИПСК биологии in vivo , способствуя улучшению модели ИПСК и открытию новых клеточных популяций и факторов, способствующих кроветворению.

Несмотря на то, что многие группы успешно справились с выделением ядер и последующим анализом секвенирования нового поколения, выделение высококачественных ядер остается препятствием для некоторых лабораторий, заинтересованных в проведении анализов на основе одного ядра. В данной рукописи подробно описан протокол выделения качественных ядер из ранее криоконсервированных клеток, полученных из iPSC. Мы сосредоточились на адгезивных стромальных/эндотелиальных клетках и неадгезивных клетках-предшественниках, поскольку они представляют собой очень разные типы клеток с точки зрения структуры и содержания, которые требуют индивидуальных модификаций и устранения неполадок для повышения восстановления высококачественных ядер, пригодных для секвенирования следующего поколения или других экспериментов.