Isolamento nuclear de células sanguíneas derivadas criopreservadas in vitro

A hematopoiese é um sistema de desenvolvimento relativamente bem caracterizado, mas a incapacidade de recapitular a formação de células sanguíneas in vitro demonstra uma compreensão incompleta dos fatores relacionados. Modelos de hematopoiese baseados em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) podem ajudar a elucidar os principais fatores de desenvolvimento e a biologia relacionada. O sistema iPSC também oferece um excelente modelo para estudar distúrbios sanguíneos, e células sanguíneas baseadas em iPSC foram desenvolvidas para produzir reagentes traducionais e terapeuticamente relevantes 1,2,3,4. Estudos de células únicas têm sido usados extensivamente para investigar a biologia do desenvolvimento baseada em iPSC, incluindo tipos de células que são produzidas durante a hematopoiese⁵. Em comparação com o sequenciamento de RNA em massa, que não pode inferir relações entre subpopulações celulares⁶, as modalidades unicelulares permitem avaliações da heterogeneidade celular e podem facilitar a identificação e caracterização do desenvolvimento celular ^6,7.

A formação de células hematopoiéticas a partir de iPSCs requer diferenciação sequencial através de estados primitivos, mesoderma e endotelial para formar células endoteliais hemogênicas. As células endoteliais hemogênicas são precursoras diretas das células-tronco hematopoiéticas e progenitoras⁸. Esses tipos de células têm propriedades morfológicas e celulares notavelmente diferentes. Há uma compreensão limitada da paisagem epigenética e da dinâmica de desenvolvimento de modelos de células hematopoiéticas derivadas in vitro, embora este seja um conhecimento essencial para desbloquear todo o potencial terapêutico do sistema iPSC. Em muitos casos, apenas as modalidades de análise de células únicas permitem a identificação de populações celulares, atividades transcricionais, paisagens de cromatina e mecanismos regulatórios que governam o desenvolvimento entre preparações celulares heterogêneas.

Duas metodologias, sequenciamento de RNA de célula única (scRNAseq) e sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNAseq), podem revelar insights transcricionais no nível de célula individual⁹. Um fator principal que determina a validade e a confiabilidade dos dados é a necessidade intransigente de amostras que atendam a rigorosos critérios de qualidade. Isso inclui requisitos precisos para densidade celular/nuclear, viabilidade ideal e aglomeração mínima. A preparação de núcleos únicos pode ser tecnicamente desafiadora. Pode haver desafios adicionais associados ao uso de células previamente criopreservadas.

Observamos quatro limitações potenciais importantes para as abordagens scRNAseq padrão. Primeiro, os protocolos padrão para gerar suspensões celulares geralmente fazem referência a preparações de células ou tecidos frescos, em vez daquelas recuperadas após a criopreservação¹⁰. Isso pode reduzir a utilidade de recursos potencialmente valiosos. Em segundo lugar, a eficiência de dissociação de diversos tipos de células é variável. Por exemplo, muitos tipos de células imunes sofrem dissociação com relativa facilidade. Em contraste, células estromais, fibroblastos e células endoteliais, que normalmente estão embutidas na matriz extracelular e na membrana basal, têm propriedades celulares únicas que podem complicar o isolamento dos núcleos^11,12. Essas propriedades podem exigir protocolos de dissociação agressivos, o que pode comprometer a integridade estrutural de populações de células mais delicadas. Em terceiro lugar, algumas células (por exemplo, megacariócitos) podem ultrapassar 100 μm de diâmetro e representar dificuldades para várias plataformas comerciais de célula única existentes¹³. Além disso, o manuseio inadequado pode levar a danos celulares e respostas ao estresse durante as etapas iniciais do isolamento celular, envolvendo hidrólise enzimática e dissociação mecânica, o que pode afetar os perfis de expressão gênica^11,14.

Por essas e outras razões, uma abordagem de núcleo único pode ser uma alternativa preferível aos métodos de célula única¹⁵. Dada a estabilidade superior da membrana nuclear em comparação com a membrana celular, o envelope nuclear pode permanecer intacto mesmo após a criopreservação do tecido¹⁶. Isso pode facilitar a extração nuclear e aumentar a diversidade de tipos de amostras adequados para modalidades de sequenciamento de próxima geração. Em segundo lugar, os núcleos exibem maior resistência a perturbações mecânicas e tendem a manifestar menos mudanças transcricionais durante a dissociação¹⁴. Portanto, os núcleos podem fornecer maior estabilidade do RNA e perfis transcricionais mais reprodutíveis. Uma terceira vantagem digna de nota dos métodos de núcleo único é a falta de restrições de tamanho celular e a aplicabilidade para células maiores, como cardiomiócitos ou megacariócitos¹². Em quarto lugar, os núcleos servem como substratos adequados para análises multiômicas, que oferecem insights expandidos da análise integrada da expressão gênica, regiões de cromatina acessíveis e outros parâmetros¹⁷, permitindo uma compreensão mais profunda da heterogeneidade, desenvolvimento e estados funcionais celulares¹⁸.

Ao traçar o perfil das iPSCs durante o desenvolvimento hematopoiético, as abordagens multiômicas podem ajudar a definir os processos de desenvolvimento em modelos de doenças normais ou patológicas. As comparações de células derivadas de iPSC com células ou tecidos primários também podem fornecer uma avaliação da fidelidade do modelo iPSC à biologia in vivo , facilitando a melhoria do modelo iPSC e a descoberta de novas populações de células e fatores que impulsionam a formação de sangue.

Embora muitos grupos tenham navegado com sucesso no isolamento nuclear e na análise de sequenciamento de próxima geração resultante, o isolamento de núcleos de alta qualidade continua sendo uma barreira para alguns laboratórios interessados em realizar análises baseadas em núcleo único. Este manuscrito detalha um protocolo para isolar núcleos de qualidade de células derivadas de iPSC previamente criopreservadas. Nós nos concentramos em células estromais/endoteliais aderentes e células progenitoras hematopoiéticas não aderentes, pois representam tipos de células muito diferentes em relação à estrutura e conteúdo que exigem modificações personalizadas e solução de problemas para aumentar a recuperação de núcleos de alta qualidade passíveis de sequenciamento de próxima geração ou outros experimentos.