凍結保存されたIn Vitro由来血液細胞からの核分離
Summary
凍結保存された人工多能性幹細胞由来の間質/内皮および血液細胞タイプから高品質の核を抽出するためのプロトコルについて説明し、単一核の次世代シーケンシング解析をサポートします。高品質で無傷の原子核を作製することは、マルチオミクス実験にとって不可欠ですが、研究室によってはこの分野への参入障壁となることがあります。
Abstract
人工多能性幹細胞(iPSC)ベースのモデルは、血液の発生を理解するための優れたプラットフォームであり、iPS細胞由来の血液細胞は、臨床検査試薬や輸血可能な細胞治療薬としてトランスレーショナル有用性があります。一核RNAシーケンシング(snRNAseq)やトランスポザーゼアクセス可能クロマチンシーケンシングアッセイ(snATACseq)を含むがこれらに限定されないマルチオミクス解析の出現と拡大は、細胞発生の理解に革命をもたらす可能性を提供します。これには、 in vitro 造血モデルを用いた発生生物学が含まれます。しかし、培養細胞や初代細胞から無傷の核を単離することは技術的に困難な場合があります。細胞の種類が異なれば、細胞の硬直性や含有量に応じて、しばしば調整された核調製が必要になります。このような技術的な困難は、データの品質を制限し、マルチオミクス研究に関心のある研究者にとって障壁となる可能性があります。細胞の収集や処理には制限があるため、試料の凍結保存が必要になることが多く、凍結したサンプルは無傷の核分離にさらなる技術的課題をもたらす可能性があります。この論文では、 in vitro 造血のさまざまな段階でiPS細胞由来細胞から高品質の核を単離し、単一核マルチオミクスワークフローで使用するための詳細な方法を提供します。私たちは、iPS細胞由来の接着性間質/内皮細胞と非接着性造血前駆細胞からの核の単離にメソッド開発の焦点を当ててきました。これらは構造的および細胞同一性に関して非常に異なる細胞タイプを表しています。説明したトラブルシューティング手順により、核の凝集とデブリが最小限に抑えられ、下流の分析に十分な量と質で原子核を回収することができました。同様の方法は、他の凍結保存された細胞タイプから核を単離するために適応され得る。
Introduction
造血は比較的よく特徴付けられた発生システムですが、in vitroで血球形成を再現できないことは、関連因子の理解が不完全であることを示しています。人工多能性幹細胞(iPSC)ベースの造血モデルは、主要な発生因子と関連する生物学の解明に役立ちます。また、iPSCシステムは血液疾患の研究にも優れたモデルを提供しており、iPS細胞ベースの血液細胞は、翻訳および治療に関連のある試薬1,2,3,4を産生するために開発されています。シングルセル研究は、造血中に産生される細胞タイプを含む、iPS細胞ベースの発生生物学の研究に広く利用されています5。細胞亜集団間の関係を推測できないバルクRNAシーケンシング6と比較して、シングルセルモダリティは細胞の不均一性の評価を可能にし、細胞発生の同定と特性評価を容易にすることができる6,7。
iPS細胞から造血細胞を形成するには、原始線条、中胚葉、内皮状態を経て逐次分化し、造血性内皮細胞を形成する必要があります。造血性内皮細胞は、造血幹細胞および前駆細胞8の直接の前駆体である。これらの細胞型は、形態学的および細胞的特性が著しく異なります。 in vitro由来の造血細胞モデルのエピジェネティックなランドスケープと発生動態についての理解は限られていますが、これはiPS細胞システムの治療の可能性を最大限に引き出すために不可欠な知識です。多くの場合、細胞集団、転写活性、クロマチンランドスケープ、および不均一性細胞調製物間の発生を支配する調節メカニズムの同定を可能にするのは、シングルセル解析モダリティのみです。
シングルセルRNAシーケンシング(scRNAseq)とシングル核RNAシーケンシング(snRNAseq)の2つの方法論により、個々の細胞レベルでの転写に関する洞察を明らかにすることができます9。データの有効性と信頼性を左右する主な要因は、厳しい品質基準を満たすサンプルに対する妥協のないニーズです。これには、細胞/核密度、最適な生存率、および最小限の凝集に対する正確な要件が含まれます。単一原子核の調製は、技術的に困難な場合があります。以前に凍結保存された細胞の使用には、追加の課題が生じる可能性があります。
標準的なscRNAseqアプローチには、4つの重要な潜在的な制限があることに注目します。まず、細胞懸濁液を生成するための標準的なプロトコルは、凍結保存後に回収されたものではなく、新鮮な細胞または組織からの調製物を参照することがよくあります10。これにより、潜在的に価値のあるリソースの有用性が減少する可能性があります。第二に、多様な細胞タイプの解離効率は変動します。例えば、多くの免疫細胞は比較的容易に解離します。対照的に、間質細胞、線維芽細胞、および内皮細胞は、通常は細胞外マトリックスおよび基底膜に埋め込まれており、核の単離を複雑にする可能性のある独特の細胞特性を持っています11,12。これらの特性は、積極的な解離プロトコルを必要とする可能性があり、より繊細な細胞集団の構造的完全性を危険にさらす可能性があります。第三に、一部の細胞(例えば、巨核球)は直径が100μmを超えることがあり、いくつかの既存の商用シングルセルプラットフォーム13にとって困難をもたらす。さらに、不適切な取り扱いは、細胞単離の初期段階で細胞の損傷やストレス応答を引き起こす可能性があり、これには酵素による加水分解や機械的解離が含まれ、遺伝子発現プロファイルに影響を与える可能性があります11,14。
これらの理由および他の理由から、単一核アプローチは、単一細胞法の好ましい代替手段となり得る15。細胞膜と比較して核膜の優れた安定性を考慮すると、組織凍結保存16後も核膜は無傷のままであり得る。これにより、核抽出が容易になり、次世代のシーケンシングモダリティに適したサンプルタイプの多様性を高めることができます。第二に、核は機械的な摂動に対する抵抗性が高く、解離中の転写シフトが少なく現れる傾向がある14。したがって、核はRNAの安定性を高め、転写プロファイルの再現性を高めることができます。単一核法の3つ目の注目すべき利点は、細胞サイズの制約がないことと、心筋細胞や巨核球などのより大きな細胞に適用できることである12。第四に、核はマルチオミクス解析に適した基質として機能し、遺伝子発現、アクセス可能なクロマチン領域、およびその他のパラメータ17の統合解析からより広範な洞察を提供し、細胞の不均一性、発生、および機能状態18のより深い理解を可能にする。
造血器の発達過程でiPS細胞をプロファイリングすることにより、マルチオミクスのアプローチは、正常または病理疾患モデルにおける発生プロセスを定義するのに役立ちます。また、iPS細胞由来細胞を初代細胞や組織と比較することで、 iPS細胞モデルのin vivo 生物学に対する忠実度を評価することができ、iPS細胞モデルの改善や、血液形成を促進する新規細胞集団や因子の発見を促進することができます。
多くのグループが核の単離とその結果としての次世代シーケンシング解析に成功していますが、単一核ベースの解析に関心のある一部の研究室では、高品質の核の単離が依然として障壁となっています。この原稿では、以前に凍結保存されたiPS細胞由来細胞から高品質の核を単離するためのプロトコルについて詳しく説明しています。私たちは、接着性間質/内皮細胞と非接着性造血前駆細胞に焦点を当ててきましたが、これらは構造と内容に関して非常に異なる細胞タイプを表しており、次世代シーケンシングやその他の実験に適した高品質の核の回収率を高めるためのカスタマイズされた修正とトラブルシューティングが必要です。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコル内の重要なステップ
急速に進化している現在の単一核ベースの次世代シーケンシングモダリティを成功裏に実装するためには、高品質の核を単離することが不可欠です。これらのアプローチ、特に凍結保存された標本に関心のある研究室には既存の障壁があることを認識し、私たちは以前に凍結した細胞に合わせた核分離技術を作成するつもりでした。凍結保存さ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、Jason Hatakeyama氏(10x Genomics)とDiana Slater氏(Children’s Hospital of Philadelphia Center for Applied Genomics)の指導と提案に感謝します。この研究は、国立衛生研究所(HL156052 CST)の支援を受けました。
Materials
| Cell Culture Reagents | |||
| Dimethyl sulfoxide solution (DMSO) | Sigma | 673439 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Corning | 21031CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GeminiBio | 100106 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875093 | |
| Cells | |||
| Induced pluripotent stem cells | N/A | N/A | The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility |
| Cell Staining Reagents | |||
| Trypan Blue Solution | Corning | 25900CI | |
| Dead Cell Removal Reagents | |||
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit | StemCell Technologies | 17899 | This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube. |
| Materials | |||
| 10 µl Micropipette | Wards science | 470231606 | |
| 100 µl Micropipette | Wards science | 470231598 | |
| 1000 µl Extended Universal Tip | Oxford Lab Products | OAR-1000XL-SLF | |
| 1000 µl Micropipette | Wards science | 470231602 | |
| 2.0 ml Cryogenic vials | Corning | 431386 | |
| 20 µl Micropipette | Wards science | 470231608 | |
| 200 µl Micropipette | Wards science | 470231600 | |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station | Corning | 4143 | |
| Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station | Corning | 4144 | |
| Counting chamber | CytoSMART | 699910591 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 µm | Bel-Art | H136800040 | |
| Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| NALGENE Cryo 1°C Freezing Container | Nalgene | 51000001 | |
| Nuclei Isolation Reagents | Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer, Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283). | ||
| Dead Cell Removal kit | STEMCELL | 17899 | |
| Digitonin | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma | 646563 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 µm | Bel-Art | H136800040 | |
| MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | 7786303 | |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma | M1028 | |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma | 74385 | |
| Nuclease-Free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| Nuclei Buffer (20X) | 10X Genomics | 2000153 | |
| Protector RNase inhibitor | Sigma | 3335399001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653-250G | |
| Sodium Chloride Solution, 5 M | Sigma | 59222C | |
| Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4 | Sigma | T2194 | |
| Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4) | Sigma | T3252-500G | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Other equipment | |||
| Automated cell counter | CytoSMART | 699910591 | |
| Microscope | Zeiss | Primostar 3 |
References
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