العزلة النووية من خلايا الدم المشتقة من المختبر المحفوظة بالتبريد
Summary
وصفنا بروتوكولا لاستخراج نوى عالية الجودة من أنواع الخلايا الجذعية اللحمية / البطانية وخلايا الدم المشتقة من الخلايا الجذعية المحفوظة بالتبريد لدعم تحليلات تسلسل الجيل التالي من النواة الواحدة. يعد إنتاج نوى سليمة عالية الجودة أمرا ضروريا لتجارب multiomics ولكن يمكن أن يكون عائقا أمام الدخول إلى الميدان لبعض المختبرات.
Abstract
تعد النماذج القائمة على الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) منصات ممتازة لفهم نمو الدم ، وخلايا الدم المشتقة من iPSC لها فائدة متعدية ككواشف اختبار سريرية وعلاجات خلوية قابلة للنقل. إن ظهور وتوسيع تحليل multiomics ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة (snRNAseq) ومقايسة تسلسل الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة Transposase (snATACseq) ، يوفر إمكانية إحداث ثورة في فهمنا لتطور الخلايا. وهذا يشمل علم الأحياء التنموي باستخدام نماذج المكونة للدم في المختبر . ومع ذلك ، قد يكون من الصعب تقنيا عزل النوى السليمة عن الخلايا المزروعة أو الأولية. غالبا ما تتطلب أنواع الخلايا المختلفة استعدادات نووية مخصصة اعتمادا على صلابة الخلايا ومحتواها. يمكن أن تحد هذه الصعوبات الفنية من جودة البيانات وتعمل كحاجز أمام الباحثين المهتمين بمتابعة دراسات multiomics. غالبا ما يكون حفظ العينات بالتبريد ضروريا بسبب القيود المفروضة على جمع الخلايا و / أو معالجتها ، ويمكن أن تشكل العينات المجمدة تحديات تقنية إضافية للعزل النووي السليم. في هذه المخطوطة ، نقدم طريقة مفصلة لعزل النوى عالية الجودة من الخلايا المشتقة من iPSC في مراحل مختلفة من تطور المكونة للدم في المختبر لاستخدامها في سير عمل multiomics أحادي النواة. لقد ركزنا تطوير الطريقة على عزل النوى من الخلايا اللحمية / البطانية الملتصقة المشتقة من iPSC والخلايا السلفية المكونة للدم غير الملتصقة ، حيث تمثل هذه أنواعا مختلفة جدا من الخلايا فيما يتعلق بالهوية الهيكلية والخلوية. وقد حدت خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها الموصوفة من التكتل النووي والحطام، مما سمح باستعادة النوى بكميات ونوعية كافيتين للتحليلات النهائية. يمكن تكييف طرق مماثلة لعزل النوى عن أنواع الخلايا الأخرى المحفوظة بالتبريد.
Introduction
تكون الدم هو نظام تنموي جيد التوصيف نسبيا ، لكن عدم القدرة على تلخيص تكوين خلايا الدم في المختبر يدل على فهم غير مكتمل للعوامل ذات الصلة. يمكن أن تساعد نماذج تكون الدم القائمة على الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) في توضيح العوامل التنموية الرئيسية والبيولوجيا ذات الصلة. يقدم نظام iPSC أيضا نموذجا ممتازا لدراسة اضطرابات الدم ، وقد تم تطوير خلايا الدم القائمة على iPSC لإنتاج الكواشف ذات الصلة متعدية وعلاجية1،2،3،4. تم استخدام دراسات الخلية الواحدة على نطاق واسع للتحقيق في علم الأحياء التنموي القائم على iPSC ، بما في ذلك أنواع الخلايا التي يتم إنتاجها أثناء تكون الدم5. بالمقارنة مع تسلسل الحمض النووي الريبي السائب ، والذي لا يمكنه استنتاج العلاقات بين المجموعات السكانية الفرعيةللخلايا 6 ، تسمح طرائق الخلية الواحدة بتقييم عدم تجانس الخلية ويمكن أن تسهل تحديد وتوصيف تطور الخلية 6,7.
يتطلب تكوين الخلايا المكونة للدم من iPSCs تمايزا متسلسلا من خلال الخط البدائي والأدوم المتوسط والحالات البطانية لتشكيل خلايا بطانية دموية. الخلايا البطانية الدموية هي سلائف مباشرة للخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم8. هذه الأنواع من الخلايا لها خصائص مورفولوجية وخلوية مختلفة بشكل ملحوظ. هناك فهم محدود للمشهد اللاجيني والديناميكيات التنموية لنماذج الخلايا المكونة للدم المشتقة من المختبر ، على الرغم من أن هذه معرفة أساسية لإطلاق العنان للإمكانات العلاجية الكاملة لنظام iPSC. في كثير من الحالات ، تسمح طرق تحليل الخلية المفردة فقط بتحديد مجموعات الخلايا ، وأنشطة النسخ ، والمناظر الطبيعية للكروماتين ، والآليات التنظيمية التي تحكم التطور بين مستحضرات الخلايا غير المتجانسة.
يمكن أن تكشف منهجيتان ، تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNAseq) وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى (snRNAseq) ، عن رؤى نسخية على مستوى الخليةالفردية 9. أحد العوامل الرئيسية التي تملي صحة البيانات وموثوقيتها هو الحاجة التي لا هوادة فيها للعينات التي تلبي معايير الجودة الصارمة. وتشمل هذه المتطلبات الدقيقة للخلية / الكثافة النووية ، والجدوى المثلى ، والحد الأدنى من التكتل. يمكن أن يكون تحضير النوى المفردة أمرا صعبا من الناحية الفنية. يمكن أن تكون هناك تحديات إضافية مرتبطة باستخدام الخلايا المحفوظة مسبقا بالتبريد.
نلاحظ أربعة قيود محتملة مهمة على نهج scRNAseq القياسية. أولا ، غالبا ما تشير البروتوكولات القياسية لتوليد معلقات الخلايا إلى المستحضرات من الخلايا أو الأنسجة الطازجة ، بدلا من تلك التي يتم استردادها بعد الحفظ بالتبريد10. هذا يمكن أن يحد من فائدة الموارد التي يحتمل أن تكون قيمة. ثانيا ، كفاءة التفكك لأنواع الخلايا المختلفة متغيرة. على سبيل المثال ، تخضع العديد من أنواع الخلايا المناعية للتفكك بسهولة نسبية. في المقابل ، فإن الخلايا اللحمية والخلايا الليفية والخلايا البطانية ، والتي عادة ما تكون مضمنة في المصفوفة خارج الخلية والغشاء القاعدي ، لها خصائص خلوية فريدة يمكن أن تعقد عزل النوى11,12. يمكن أن تتطلب هذه الخصائص بروتوكولات تفكك عدوانية ، والتي قد تعرض للخطر السلامة الهيكلية لمجموعات الخلايا الأكثر حساسية. ثالثا ، يمكن لبعض الخلايا (على سبيل المثال ، خلايا النواة) أن يتجاوز قطرها 100 ميكرومتر وتشكل صعوبات للعديد من المنصات التجارية أحادية الخليةالقائمة 13. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي التعامل غير السليم إلى تلف الخلايا واستجابات الإجهاد أثناء الخطوات الأولية لعزل الخلايا ، بما في ذلك التحلل المائي الأنزيمي والتفكك الميكانيكي ، مما قد يؤثر على ملفات تعريف التعبير الجيني11,14.
لهذه الأسباب وغيرها ، قد يكون نهج النواة الواحدة بديلا مفضلا لطرق الخليةالمفردة 15. نظرا للاستقرار الفائق للغشاء النووي مقارنة بغشاء الخلية ، قد يظل الغلاف النووي سليما حتى بعد حفظ الأنسجةبالتبريد 16. ومن شأن ذلك أن ييسر الاستخراج النووي ويعزز تنوع أنواع العينات المناسبة لطرائق تسلسل الجيل التالي. ثانيا ، تظهر النوى مقاومة عالية للاضطرابات الميكانيكية وتميل إلى إظهار تحولات نسخ أقل أثناء التفكك14. لذلك ، يمكن أن توفر النوى استقرارا أكبر للحمض النووي الريبي (RNA) وملفات تعريف نسخ أكثر قابلية للتكرار. الميزة الثالثة الجديرة بالملاحظة لطرق النوى المفردة هي عدم وجود قيود على حجم الخلية وإمكانية التطبيق على الخلايا الأكبر ، مثل خلايا عضلة القلب أو خلايا النواة12. رابعا ، تعمل النوى كركائز مناسبة لتحليلات multiomics ، والتي تقدم رؤى موسعة من التحليل المتكامل للتعبير الجيني ، ومناطق الكروماتين التي يمكن الوصول إليها ، وغيرها من المعلمات17 ، مما يتيح فهما أعمق لعدم تجانس الخلايا وتطورها وحالاتها الوظيفية18.
من خلال التنميط iPSCs أثناء تطور المكونة للدم ، يمكن أن تساعد مناهج multiomics في تحديد العمليات التنموية في نماذج الأمراض العادية أو المرضية. يمكن أن توفر مقارنات الخلايا المشتقة من iPSC بالخلايا أو الأنسجة الأولية أيضا تقييما لإخلاص نموذج iPSC لبيولوجيا الجسم الحي ، مما يسهل تحسين نموذج iPSC واكتشاف مجموعات الخلايا الجديدة والعوامل التي تدفع تكوين الدم.
على الرغم من أن العديد من المجموعات قد نجحت في اجتياز العزل النووي وما نتج عنه من تحليل تسلسل الجيل التالي ، إلا أن عزل النوى عالية الجودة لا يزال يشكل عائقا أمام بعض المختبرات المهتمة بإجراء التحليلات القائمة على النواة المفردة. تفصل هذه المخطوطة بروتوكولا لعزل النوى عالية الجودة من الخلايا المشتقة من iPSC المحفوظة مسبقا بالتبريد. لقد ركزنا على الخلايا اللحمية / البطانية الملتصقة والخلايا السلفية المكونة للدم غير الملتصقة ، حيث تمثل هذه أنواعا مختلفة جدا من الخلايا فيما يتعلق بالبنية والمحتوى التي تتطلب تعديلات مخصصة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لزيادة استعادة النوى عالية الجودة القابلة للتسلسل من الجيل التالي أو تجارب أخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الحاسمة داخل البروتوكول
يعد عزل النوى عالية الجودة أمرا ضروريا للتنفيذ الناجح لطرائق تسلسل الجيل التالي الحالية القائمة على النواة المفردة ، والتي تتطور بسرعة. واعترافا بالحواجز القائمة أمام المختبرات المهتمة بهذه الأساليب، وخاصة بالنسبة للعينات المحفوظة بالتبريد، …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون جيسون هاتاكياما (10x Genomics) وديانا سلاتر (مركز مستشفى فيلادلفيا للأطفال لعلم الجينوم التطبيقي) على التوجيه والاقتراحات. تم دعم هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (HL156052 إلى CST).
Materials
| Cell Culture Reagents | |||
| Dimethyl sulfoxide solution (DMSO) | Sigma | 673439 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Corning | 21031CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GeminiBio | 100106 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875093 | |
| Cells | |||
| Induced pluripotent stem cells | N/A | N/A | The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility |
| Cell Staining Reagents | |||
| Trypan Blue Solution | Corning | 25900CI | |
| Dead Cell Removal Reagents | |||
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit | StemCell Technologies | 17899 | This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube. |
| Materials | |||
| 10 µl Micropipette | Wards science | 470231606 | |
| 100 µl Micropipette | Wards science | 470231598 | |
| 1000 µl Extended Universal Tip | Oxford Lab Products | OAR-1000XL-SLF | |
| 1000 µl Micropipette | Wards science | 470231602 | |
| 2.0 ml Cryogenic vials | Corning | 431386 | |
| 20 µl Micropipette | Wards science | 470231608 | |
| 200 µl Micropipette | Wards science | 470231600 | |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station | Corning | 4143 | |
| Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station | Corning | 4144 | |
| Counting chamber | CytoSMART | 699910591 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 µm | Bel-Art | H136800040 | |
| Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| NALGENE Cryo 1°C Freezing Container | Nalgene | 51000001 | |
| Nuclei Isolation Reagents | Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer, Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283). | ||
| Dead Cell Removal kit | STEMCELL | 17899 | |
| Digitonin | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma | 646563 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 µm | Bel-Art | H136800040 | |
| MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | 7786303 | |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma | M1028 | |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma | 74385 | |
| Nuclease-Free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| Nuclei Buffer (20X) | 10X Genomics | 2000153 | |
| Protector RNase inhibitor | Sigma | 3335399001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653-250G | |
| Sodium Chloride Solution, 5 M | Sigma | 59222C | |
| Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4 | Sigma | T2194 | |
| Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4) | Sigma | T3252-500G | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Other equipment | |||
| Automated cell counter | CytoSMART | 699910591 | |
| Microscope | Zeiss | Primostar 3 |
References
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- An, H. H., et al. The use of pluripotent stem cells to generate diagnostic tools for transfusion medicine. Blood. 140 (15), 1723-1734 (2022).
- Zeng, J., Tang, S. Y., Toh, L. L., Wang, S. Generation of "Off-the-Shelf" Natural Killer Cells from Peripheral Blood Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rep. 9 (6), 1796-1812 (2017).
- Pavani, G., et al. Modeling primitive and definitive erythropoiesis with induced pluripotent stem cells. Blood Adv. , (2024).
- Chen, X., et al. Integrative epigenomic and transcriptomic analysis reveals the requirement of JUNB for hematopoietic fate induction. Nat Comm. 13 (1), 3131 (2022).
- Yu, X., Abbas-Aghababazadeh, F., Chen, Y. A., Fridley, B. L. Statistical and bioinformatics analysis of data from bulk and single-cell RNA sequencing experiments. Methods Mol Biol. 2194, 143-175 (2021).
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694 (2022).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat med. 26 (5), 792-802 (2020).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).
- Nadelmann, E. R., et al. Isolation of nuclei from mammalian cells and tissues for single-nucleus molecular profiling. Curr Protoc. 1 (5), e132 (2021).
- Del-Aguila, J. L., et al. A single-nuclei RNA sequencing study of Mendelian and sporadic AD in the human brain. Alzheimer’s Res Ther. 11 (1), 71 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS one. 13 (12), e0209648 (2018).
- Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).
- Maciejowski, J., Hatch, E. M. Nuclear membrane rupture and its consequences. Ann Rev Cell Dev Biol. 36, 85-114 (2020).
- Fang, R., et al. Comprehensive analysis of single cell ATAC-seq data with SnapATAC. Nat Comm. 12 (1), 1337 (2021).
- Baysoy, A., Bai, Z., Satija, R., Fan, R. The technological landscape and applications of single-cell multi-omics. Nat Rev. Mol Cell Biol. 24 (10), 695-713 (2023).
