内分泌および外分泌膵臓生理学を研究するためのヒト膵臓組織スライスの生成

男女の組織ドナーからのヒト膵臓切片は、フロリダ大学の糖尿病を伴う膵臓臓器ドナーのネットワーク(nPOD)組織バンクを介して取得されました。識別子のない死亡者の臓器組織は、臓器提供に関する法律および規制に従って非ヒト被験者研究であると判断され、フロリダ大学治験審査委員会(IRB;IRB no. 392-2008)、同意の必要性を放棄した。このプロジェクトに特に使用されたnPOD組織は、フロリダ大学IRB(IRB20140093)によって非ヒトとして承認されました。 注:スライス技術とその応用(周融血やカルシウムイメージングなど)に全く慣れていない読者は、ヒトサンプルを扱う前に、マウスまたはラットのスライス3,28を使用して実践的な経験を積み、基本的なスキルを身に付けることをお勧めします。 1.事前準備 注:これらの準備は、組織が到着する前に実行する必要があります。 125 mM NaCl、5.9 mM KCl、2.56 mM CaCl2、1 mM MgCl2、25 mM HEPES、0.1% BSA、2 mM L-アラニン、L-アルギニン、およびL-グルタミンを混合してHEPES緩衝液を調製します。pHを7.4に調整し、フィルター滅菌します。 グルコースやその他の刺激をバッファーに添加して、ペリフュージョン実験用の溶液を調製します。ベースライン緩衝液に5.5 mMグルコースを加えます。このバッファーは、スライス手順、スライス収集、およびペリフュージョン調製に使用されます。 ベースラインバッファーにアプロチニン(10 μg/mL)を添加して、スライス回収用のディッシュを少なくとも 2 皿調製します。 BSAおよびアミノ酸を含まないHEPES緩衝液(125 mM NaCl、5.9 mM KCl、2.56 mM CaCl2、1 mM MgCl2、25 mM HEPES)に3.8%低融点アガロース溶液を調製し、37°Cに保ちます。 新しいブレードをホルダーに入れて、ビブラトームを組み立てます。必要に応じて、ブレードの角度を15°に設定します(Leica VT1200Sを使用している場合)。必要に応じて、ビブラトームを調整します。 ペリフュージョンマシンの電源を入れ、チャンバー数とプログラムプロトコルを選択します。 必要なすべての溶液をペリフュージョンマシンに入れ、システムをプライミングし、溶液を加熱し続けます。マシンは、プロトコルに使用される各ソリューションの必要な量を計算します。 2. 組織処理 注:スライスは受領後すぐに生成する必要があります。遅れると、手順が困難になり、組織の劣化につながる可能性があります。 実体顕微鏡下でベースラインバッファーを入れた皿に膵臓組織を置きます(図1A)。結合組織、線維組織、脂肪組織を鉗子やハサミでやさしく取り除きます。 ハサミやメスなどを用いて、組織を約0.5cm3(図1B)の複数の小片に切断します。乾いた膵臓片をティッシュペーパーで拭き取ります。 4個を35mmのペトリ皿に移し、すべての破片が完全に沈むまで皿にアガロース溶液を入れます。アガロースが完全に固まるまで待ちます。 アガロースから慎重に切り取ります。皿の端に沿ってメスを走らせてアガロースを取り除き、組織ブロックを慎重に分離します。破片がアガロースの薄い層で囲まれていることを確認してください。 3.スライス ビブラトームの金属板に組織片を逆さまに置いて接着します。 プレートをトレイに取り付け、ベースラインバッファー(ベースライングルコース5.5 mMを含むHEPES)をトレイに充填します。 ビブラトームを120μmの自動スライスにセットし、開始位置と終了位置を調整します。 ブレードを組織のすぐ上に動かし、低速(0.1 mm / s)と0.8mmの振幅でスライスを開始します。組織が許せば、速度を上げることができます(図1C)。 湾曲した鉗子または小さなブラシを使用してスライスを収集します。アプロチニンを含むベースラインバッファーにスライスを蓄積します(図1D)。 スライスをアプロチニンを含むベースラインバッファーで少なくとも1時間休ませます。スライスを低速オービタルシェーカーに置き、切断手順によって放出された酵素を洗い流します。 4.生死アッセイ 注:これは、手順後に組織スライスの実行可能性を示すオプションのアッセイです。ただし、一度染色したスライスは再利用できません。 ベースラインバッファーで満たされたウェルに1つのスライスを移します。 フルオレセインジアセテート(FDA、50 μg/mL)を添加し、室温で1分間インキュベートし、光から保護します。 ヨウ化プロピジウム(PI,50 μg/mL)を添加し、室温で1分間インキュベートし、光から保護します。 スライスをPBSで満たされた別のウェルに移し、1分間洗浄します。 スライスをペトリ皿に移すか、イメージング用のカバースリップを使用してスライドガラスに取り付けます(図2A、B)。 5.ペリフュージョン 注:このプロトコルは、組織スライスの動的周灌融合を実行する方法を説明していますが、単離された膵島にも適しています。膵島チャンバーは、機械のユーザーマニュアルに記載されているように、膵島を装填する前に、濾紙とビーズ溶液で準備する必要があります。ただし、膵島とスライスチャンバーは同じ実験で一緒に使用できます。 3つのスライスを選択し、ブラシとメスを使用して実体顕微鏡でアガロースを最小限にトリミングします。 ベースラインバッファー(5.5 mMベースライングルコースを含むHEPES)をスライスチャンバーのグリッドに一滴加え、グリッド上に1つのスライスを静かに置きます。3つのスライスのそれぞれについて繰り返します(図3A)。スライスが非常に小さい場合は、3つ以上のチャンバーを積み重ねて、島の数を増やします。チャンバーごとに複数のスライスを配置しないでください。注:スライスあたりの膵島の数はドナーによって大きく異なり、スライスサイズ(10〜100膵島/スライス)によって異なります。合計3スライスは、インスリンとグルカゴンの両方の分泌を測定するのに十分であることが証明されています。 孤立した膵島の場合、インスリン分泌のためにカラムあたり最低30の膵島を使用します。グルカゴン検出には100個の膵島を使用することをお勧めします。個々のスライスチャンバー部品を上から下に組み立てます。 スライスチャンバーをマシンの流入チューブと流出チューブに接続し、プロトコルを開始します(図3C)。 プロトコル中は、チャンバー加熱ポンプとトレイ冷却ポンプを使用してください。プロトコル中にコレクションプレートを交換し、同日に定量を行う場合は4°Cで保存するか、それまでは-80°Cで保存してください。 プロトコールが完了したら、チャンバーを取り外し、分解し、溶解(無水エタノール中の3%HCl)または固定(4%パラホルムアルデヒド中)のためにスライスを回収します。 水、10%漂白剤、水、空気で洗い流して機械を洗浄します。 市販の検出キットを使用してホルモン分泌を定量化します。注: 図4 は、濃度範囲を推定するための3スライスのインスリンおよびグルカゴン分泌の絶対レベルを示しています。 6. カルシウムイメージング カルシウム染料(例:.、Fluo4-AM、カルブライト)溶液は、製造元の指示に従って調製します。 ベースラインのHEPES緩衝液で色素を希釈し、アプロチニン(10 μg/mL)を加えます。 1つのスライスを移し、室温でオービタルシェーカーで30〜60分間インキュベートし、光から保護します。 インキュベーション時間中に、ペリフュージョンシリンジを充填し、チューブをプライミングして、スライスイメージングセットアップを準備します(図5A、B)。 すべての機器を接続し、ヒーターのスイッチを入れて、ポンプの流れを始動します。インフロー加熱とプラットフォームヒーターの両方を使用し、流量は0.5mL/minを推奨します。 イメージングチャンバーに1つのスライスをそっと置き、ハープを使用して固定します。 低倍率の対物レンズを使用して、イメージング領域を特定します。反射を使用すると、膵島の領域を特定するのに役立ちます(図5C)。 より高い倍率の対物レンズ(20倍や40倍など)に切り替え、実験の設定に従って位置を調整します。注:最適な細胞生存率と膵島の完全性を確保するために、光学セクションは切断面の1〜2セル層下にあることをお勧めします。 zスタックまたはタイルスキャン位置を設定します。撮影間隔と録画時間を設定します。ここでは、個々の細胞の識別を可能にするために、少なくとも256×256の解像度を使用し、5〜10秒のイメージング間隔および30〜60μmのzスタック範囲(該当する場合)を、平面間(1つの細胞層)の間隔で30〜60μmとした。詳細なイメージング設定については、 図6 を参照してください。注意: イメージングパラメータを設定して、最高の解像度と最大面積を取得しますが、サンプルの漂白は避けてください。 イメージングを開始し、実験に応じて溶液の流入を切り替えます。完了したら、スライスを収集し、免疫組織化学のためにそれらを修正します。