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Biology

Génération de coupes de tissu pancréatique humain pour étudier la physiologie endocrinienne et exocrine du pancréas

Published: March 15, 2024
doi:
10.3791/66468
, ,
1Department of Diabetes Immunology,Arthur Riggs Diabetes and Metabolism Research Institute

Summary

Ce protocole décrit comment générer des coupes de pancréas humain à partir de donneurs d’organes décédés afin d’étudier la fonction cellulaire dans des conditions quasi physiologiques. Cette approche novatrice permet d’étudier les îlots normaux et structurellement endommagés et l’interaction complexe entre les compartiments endocriniens et exocrines.

Abstract

Il est crucial d’étudier le pancréas humain pour comprendre les mécanismes physiopathologiques associés au diabète de type 1 (DT1) et 2 (DT2) ainsi que la physiologie et l’interaction endocriniennes et exocrines du pancréas. L’étude des îlots pancréatiques isolés a permis d’apprendre beaucoup, mais cela empêche d’examiner leur fonction et leurs interactions dans le contexte de l’ensemble du tissu. Les coupes de pancréas offrent une occasion unique d’explorer la physiologie des îlots normaux, enflammés et structurellement endommagés dans leur environnement d’origine, ce qui permet d’étudier les interactions entre les compartiments endocriniens et exocrines afin de mieux étudier la dynamique complexe du tissu pancréatique. Ainsi, l’adoption de la plate-forme de tranche de pancréas vivant représente une avancée significative dans le domaine. Ce protocole décrit comment générer des coupes de tissus vivants à partir de donneurs d’organes décédés par enrobage de tissus dans l’agarose et le tranchage de vibratomes, ainsi que leur utilisation pour évaluer les lectures fonctionnelles telles que la sécrétion dynamique et l’imagerie de cellules vivantes.

Introduction

Les études sur la physiologie des îlots sont fondamentales pour comprendre la pathogenèse du diabète et développer de nouvelles approches thérapeutiques. Jusqu’à présent, la recherche s’est appuyée sur des îlots isolés, ce qui expose les îlots à des contraintes mécaniques et enzymatiques, provoquant probablement des changements dans la physiologie cellulaire ; De plus, il n’est pas possible d’évaluer la fonction des îlots dans le contexte de leur environnement tissulaire naturel, qui est probablement affecté par les cellules exocrines et vasculaires, entre autres1. Lorsque l’on étudie le pancréas de donneurs atteints de DT1, il y a le défi que leurs îlots sont difficiles à isoler et peuvent se fragmenter pendant l’isolement, ce qui pourrait produire un effet de sélection sur les îlots qui peuvent ne pas représenter la population in vivo2. De plus, les îlots seront séparés de leur environnement complexe et de leurs connexions cellulaires, en particulier des cellules immunitaires infiltrantes que l’on trouve dans les îlots enflammés et qui sont plus abondantes à la périphérie des îlots. Ainsi, bien que les îlots isolés soient un outil fondamental dans la recherche sur le diabète, il y a des limites. En réponse, nous introduisons un protocole révolutionnaire pour générer des coupes de pancréas vivantes, offrant une solution à ces défis.

Le développement et l’adoption récents de techniques de tranchage du tissu pancréatique sont considérés comme une percée pour notre capacité à explorer la biologie et les fonctions complexes du pancréas. Cette innovation a ouvert de nouvelles voies pour l’étude dynamique de la physiologie des îlots et des interactions entre les cellules endocriniennes, exocrines, neurales, vasculaires et immunitaires dans leur contexte anatomique naturel. Contrairement aux approches conventionnelles, ce cadre in vitro préserve une grande partie de la cytoarchitecture de l’organe, ce qui permet une approximation plus proche de sa biologie native. Initialement développée chez la souris par Speier et Rupnik en 20033, cette méthode a démontré son utilité pour évaluer l’imagerie calcique, l’électrophysiologie et la sécrétion hormonale pour la signalisation intra- et intercellulaire 4,5,6,7,8,9. La plate-forme de coupe de pancréas a ensuite été appliquée à l’étude du tissu pancréatique humain obtenu par biopsie chirurgicale 4,10,11,12. Notre groupe a démontré la faisabilité d’obtenir et d’utiliser des tranches de pancréas provenant de donneurs d’organes cadavériques grâce à l’activité du Réseau des donneurs d’organes pancréatiques atteints de diabète (nPOD)13. nPOD fournit des tissus pancréatiques aux chercheurs approuvés qui mènent des recherches sur le diabète de type 1 humain, et depuis l’adoption de la plate-forme de tranches de pancréas, nPOD génère et distribue régulièrement des tranches de pancréas vivantes 14,15,16,17. Depuis la mise en œuvre de la plateforme de coupes de pancréas en 2020, nPOD a distribué avec succès des tranches de tissus de 43 donneurs (dont 12 donneurs atteints de DT1) à de nombreux chercheurs. À l’aide de ces tranches, les chercheurs ont effectué des recherches révolutionnaires sur des aspects critiques de la fonction des îlots et ont exploré l’interaction entre les îlots et le système vasculaire, le système nerveux et les cellules immunitaires dans le contexte du DT1 13,18,19,20,21,22,23,24 . De nombreuses études ont mis en évidence les limites des approches traditionnelles et souligné l’importance des techniques capables de capturer l’interaction dynamique au sein du pancréas 25,26,27. L’adaptabilité des techniques de tranchage du pancréas de souris au pancréas humain, associée à leur intégration dans des programmes tels que le Réseau des donneurs d’organes pancréatiques atteints de diabète (nPOD), illustre la reconnaissance croissante du potentiel de la méthode à débloquer des informations précieuses sur des maladies telles que le diabète de type 1.

Protocol

Des coupes pancréatiques humaines provenant de donneurs de tissus des deux sexes ont été obtenues par l’intermédiaire de la banque de tissus Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) de l’Université de Floride. Les tissus d’organes de personnes décédées sans identificateurs ont été déterminés comme étant des sujets de recherche non humains conformément aux lois et règlements sur le don d’organes et classés comme sujets non humains par le Conseil d’examen institutionnel de l’Université de Floride (IRB ; CISR n° 392-2008), renonçant à la nécessité d’obtenir le consentement. Les tissus nPOD spécifiquement utilisés pour ce projet ont été approuvés comme non humains par l’IRB de l’Université de Floride (IRB20140093). REMARQUE : Pour les lecteurs qui ne connaissent pas la technique de la tranche et ses applications, telles que la périfusion et l’imagerie calcique, il peut être judicieux d’acquérir une expérience pratique et de développer des compétences de base en utilisant des tranches de souris ou de rat 3,28 avant de travailler avec des échantillons humains. 1. Préparatifs REMARQUE : Ces préparations doivent être effectuées avant l’arrivée des tissus. Préparez le tampon HEPES en mélangeant 125 mM de NaCl, 5,9 mM de KCl, 2,56 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 25 mM d’HEPES, 0,1 % de BSA, 2 mM de L-alanine, de L-arginine et de L-glutamine. Ajustez le pH à 7,4 et filtrez la stérilisation. Ajoutez du glucose et/ou d’autres stimuli au tampon pour préparer des solutions pour l’expérience de périfusion. Pour le tampon de base, ajoutez 5,5 mM de glucose. Ce tampon sera utilisé pour les procédures de tranchage, la collecte des tranches et les préparations de périfusion. Préparez au moins deux plats pour le prélèvement des tranches en ajoutant de l’aprotinine (10 μg/mL) au tampon de base. Préparez une solution d’agarose à bas point de fusion à 3,8 % dans un tampon HEPES sans BSA ni acides aminés (125 mM de NaCl, 5,9 mM de KCl, 2,56 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 25 mM de HEPES) et maintenez-la à 37 °C. Assemblez le vibratome, en plaçant une lame fraîche dans le support. Le cas échéant, réglez l’angle de la lame sur 15° (si vous utilisez Leica VT1200S). Le cas échéant, calibrez le vibratome. Allumez la machine de périfusion, sélectionnez le nombre de chambres et programmez le protocole. Placez toutes les solutions nécessaires dans l’appareil de périfusion, amorcez le système et maintenez les solutions chauffées. La machine calcule les volumes nécessaires de chaque solution utilisée pour le protocole. 2. Traitement des tissus REMARQUE : Les tranches doivent être générées immédiatement après leur réception. Tout retard peut entraîner des difficultés dans la procédure et entraîner une dégradation des tissus. Placez le tissu pancréatique dans une boîte avec un tampon de base sous un stéréomicroscope (Figure 1A). Retirez délicatement les tissus conjonctifs, fibreux et adipeux à l’aide de pinces et de ciseaux. Coupez le tissu en plusieurs petits morceaux d’environ 0,5cm3 (figure 1B) à l’aide de ciseaux ou d’un scalpel. Épongez les morceaux de pancréas secs sur du papier de soie. Transférez 4 morceaux dans une boîte de Pétri de 35 mm et remplissez le plat de solution d’agarose jusqu’à ce que tous les morceaux soient complètement immergés. Laisser l’agarose se solidifier complètement. Découpez soigneusement des morceaux dans l’agarose. Passez le scalpel le long du bord du plat pour retirer l’agarose et séparez soigneusement les blocs de tissus. Assurez-vous que les morceaux sont entourés d’une fine couche d’agarose. 3. Tranchage Collez des morceaux de tissu sur la plaque métallique du vibratome en les plaçant à l’envers. Montez la plaque dans le plateau et remplissez le plateau avec un tampon de base (HEPES contenant 5,5 mM de glucose de base). Réglez le vibratome sur le tranchage automatisé à 120 μm et ajustez la position de début et de fin. Déplacez la lame brièvement au-dessus du tissu et commencez à trancher à basse vitesse (0,1 mm/s) et amplitude à 0,8 mm. La vitesse peut être augmentée si les tissus le permettent (figure 1C). Prélevez les tranches à l’aide d’une pince incurvée ou d’une petite brosse. Accumulez des tranches dans le tampon de base contenant de l’aprotinine (Figure 1D). Laisser reposer les tranches pendant au moins 1 h dans un tampon de base avec de l’aprotinine. Placez les tranches sur un agitateur orbital lent pour permettre le rinçage des enzymes libérées par la procédure de coupe. 4. Essai vivant/mort REMARQUE : Il s’agit d’un test facultatif qui montrera la viabilité des coupes de tissu après l’intervention. Cependant, les tranches ne peuvent pas être réutilisées une fois teintes. Transférez une seule tranche dans un puits rempli de tampon de base. Ajouter le diacétate de fluorescéine (FDA, 50 μg/mL), incuber 1 min à température ambiante et protéger de la lumière. Ajouter l’iodure de propidium (PI,50 μg/mL), incuber 1 min à température ambiante et protéger de la lumière. Transférer la tranche dans un autre puits rempli de PBS pour laver pendant 1 min. Transférez les tranches dans une boîte de Pétri ou montez-les sur une lame de verre avec une lamelle pour l’imagerie (Figure 2A,B). 5. Périfusion REMARQUE : Ce protocole décrit comment effectuer une périfusion dynamique pour les coupes de tissus, mais il convient également aux îlots isolés. Les chambres des îlots auront besoin d’être préparées avec du papier filtre et une solution de billes avant de charger les îlots, comme décrit dans le manuel d’utilisation de la machine. Cependant, l’îlot et la chambre de coupe peuvent être utilisés ensemble dans la même expérience. Choisissez 3 tranches et coupez l’agarose au minimum sous un stéréomicroscope à l’aide d’un pinceau et d’un scalpel. Ajoutez une goutte de tampon de base (HEPES contenant 5,5 mM de glucose de base) sur la grille de la chambre de coupe et placez délicatement une tranche sur la grille. Répétez l’opération pour chacune des 3 tranches (Figure 3A). Si les tranches sont très petites, empilez plus de 3 chambres pour augmenter le nombre d’îlots. Ne placez pas plus d’une tranche par chambre.REMARQUE : Le nombre d’îlots par tranche varie considérablement d’un donneur à l’autre et dépend de la taille de la tranche (10 à 100 îlots/tranche). Un total de 3 coupes s’est avéré suffisant pour mesurer à la fois la sécrétion d’insuline et de glucagon. Pour les îlots isolés, utilisez un minimum de 30 îlots par colonne pour la sécrétion d’insuline. Il est recommandé d’utiliser 100 îlots pour la détection du glucagon. Assemblez les pièces individuelles de la chambre de tranche de haut en bas. Connectez la chambre de coupe aux tubes d’entrée et de sortie de la machine et démarrez le protocole (Figure 3C). Utilisez le chauffage de la chambre et la pompe de refroidissement du plateau pendant le protocole. Changer les plaques de collecte pendant le protocole et les conserver à 4 °C si la quantification est effectuée le jour même ou les conserver à -80 °C jusqu’à cette date. Une fois le protocole terminé, retirez les chambres, démontez et prélevez les tranches pour la lyse (3% de HCl dans de l’éthanol absolu) ou la fixation (dans 4% de paraformaldéhyde). Nettoyez la machine en la rinçant à l’eau, à 10% d’eau de Javel, à l’eau et à l’air. Quantifier la sécrétion d’hormones à l’aide de kits de détection disponibles dans le commerce.REMARQUE : La figure 4 montre les niveaux absolus de sécrétion d’insuline et de glucagon de 3 tranches pour estimer les plages de concentration. 6. Imagerie calcique Préparez la solution de colorant calcique (p. ex., Fluo4-AM, Calbryte) selon les instructions du fabricant. Diluer le colorant dans une solution tampon de référence HEPES et ajouter de l’aprotinine (10 μg/mL). Transférez une seule tranche et incubez pendant 30 à 60 minutes sur un agitateur orbital à température ambiante et à l’abri de la lumière. Pendant le temps d’incubation, préparer la configuration d’imagerie des coupes en remplissant les seringues de périfusion et en amorçant les tubes (Figure 5A, B). Connectez tous les appareils, allumez le chauffage et démarrez le débit de la pompe. Recommandé d’utiliser à la fois le chauffage à flux et le chauffage de plate-forme et un débit de 0,5 mL/min. Placez délicatement une seule tranche dans la chambre d’imagerie et fixez-la à l’aide d’une harpe. Utilisez un objectif à faible grossissement pour identifier la zone d’imagerie. L’utilisation de la réflexion permet d’identifier la zone des îlots (Figure 5C). Passez à un objectif à grossissement plus élevé (par exemple, 20x ou 40x) et ajustez la position en fonction de la configuration expérimentale.REMARQUE : Pour assurer une viabilité cellulaire optimale et l’intégrité des îlots, il est recommandé que les sections optiques soient 1 à 2 couches cellulaires sous la surface de coupe. Définissez la position de la pile z et/ou de la numérisation des tuiles. Définissez l’intervalle d’imagerie et la durée d’enregistrement. Ici, une résolution d’au moins 256 x 256 a été utilisée pour permettre la discrimination des cellules individuelles, un intervalle d’imagerie de 5 à 10 s et une plage d’empilement z (le cas échéant) de 30 à 60 μm avec un intervalle de 10 μm entre les plans (une couche cellulaire). Reportez-vous à la Figure 6 pour les paramètres d’imagerie détaillés.REMARQUE : Réglez le paramètre d’imagerie pour obtenir la meilleure résolution et une zone maximale, mais évitez de blanchir l’échantillon. Démarrez l’imagerie et changez l’afflux de solution en fonction de l’expérience. Une fois cela fait, prélevez des tranches et fixez-les pour l’immunohistochimie.

Representative Results

Lorsque le protocole est exécuté avec succès, 1 g de tissu pancréatique donne environ 100 à 200 tranches. Par la suite, ces tranches devraient être inspectées au stéréomicroscope afin d’identifier celles qui sont riches en îlots avant de procéder à des évaluations fonctionnelles. La viabilité, déterminée par marquage au diacétate de fluorescéine (FDA) et à l’iodure de propidium (PI), devrait atteindre 80 % à 90 % (figure 2A). La viabilité peut être nettement plus faible à la surface de coupe en raison des dommages causés aux cellules pendant le processus de tranchage. Dans les coupes viables, une sécrétion hormonale dynamique (figure 2B) est observée, entraînant une libération robuste d’insuline lors de l’exposition à un taux élevé de glucose et une dépolarisation membranaire avec du chlorure de potassium (KCl). À l’inverse, lorsqu’il y a des retards pendant la procédure de tranchage ou que la qualité des tissus n’est pas optimale, les résultats diffèrent considérablement. Le nombre de coupes obtenues peut diminuer, et l’évaluation de la viabilité peut indiquer une proportion plus élevée de cellules non viables marquées avec de l’IP (figure 2C). Dans ces cas, l’évaluation fonctionnelle indique une réponse diminuée, voire absente, à l’hyperglycémie et à la dépolarisation membranaire (Figure 2D). Les données des expériences sous-optimales illustrent l’importance d’une exécution précise en temps opportun et de la qualité des tissus, car elles peuvent entraîner une réduction de la viabilité des tissus et une altération de la fonctionnalité. Ces résultats négatifs servent de rappel précieux des facteurs critiques à prendre en compte dans le succès de cette méthode. Les résultats courants de l’imagerie calcique sont visualisés sous la forme d’une carte thermique, comme le montre la figure 5D, ou de traces distinctes pour des cellules individuelles, comme le montre la figure 5E. Il est important de souligner que le colorant marque tous les types de cellules sans distinction, d’où l’importance de stimuli spécifiques pour distinguer les cellules en fonction de leurs réponses. Pour identifier les cellules viables, nous utilisons KCl et trions les cellules en fonction des réponses qui dépassent la réponse de base moyenne de plus de deux erreurs standard. De plus, les coupes peuvent être fixées et colorées, ce qui permet d’identifier les types de cellules. Figure 1 : Traitement et tranchage des tissus. (A) 1 g de tissu pancréatique non traité. (B) Morceaux de pancréas nettoyés prêts pour l’enrobage d’agarose. (C) Procédure de tranchage à l’aide d’un vibratome. (D) Tranches de pancréas humain fraîchement coupées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Données sur la viabilité des tissus et la sécrétion d’insuline. (A) Images représentatives de coupes de tissus viables. Projection de l’intensité maximale de la lumière laser réfléchie (gris, en haut à gauche), PI pour les cellules mortes (rouge, en bas à gauche), FDA pour les cellules vivantes (vert, en bas à droite) et images fusionnées pour les cellules vivantes et mortes (en haut à droite). La ligne pointillée indique un îlot. Barre d’échelle 50 μm. (B) Sécrétion dynamique d’insuline de tranches de tissu pancréatique humain provenant d’un seul donneur non diabétique. La cinétique de l’insuline montre une réponse maximale de première phase après 6 minutes de stimulation élevée du glucose, suivie d’une deuxième phase de plateau. Les données sont normalisées à la sécrétion moyenne de base à 5,5 mM de glucose (indice de stimulation, changement de pli). La sécrétion a été effectuée sur des tranches du même donneur, comme indiqué en (A). (C) Images représentatives pour des coupes de tissus non viables. Projection de l’intensité maximale de la lumière laser réfléchie (gris, en haut à gauche), PI pour les cellules mortes (rouge, en bas à gauche), FDA pour les cellules vivantes (vert, en bas à droite) et images fusionnées pour les cellules vivantes et mortes (en haut à droite). La ligne pointillée indique un îlot. Barre d’échelle 50 μm. (D) Sécrétion dynamique d’insuline de tranches de tissu pancréatique humain provenant d’un seul donneur non diabétique. La cinétique de l’insuline démontre une nette perte de sécrétion d’insuline stimulée par le glucose et une dépolarisation membranaire avec le KCl. Les données sont normalisées à la sécrétion moyenne de base à 5,5 mM de glucose (indice de stimulation, changement de pli). La sécrétion a été effectuée sur des tranches du même donneur comme indiqué en (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Charge tissulaire pour la périfusion dynamique. (A) Chambres de coupe empilées. Les tranches individuelles sont chargées sur une grille métallique, comme indiqué dans l’insert. (B) Chargement d’îlots isolés dans des chambres d’îlots. Chambres de tranches et d’îlots reliées à la machine de périfusion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Sécrétion d’hormones en tranches et îlots isolés. Les données présentées dans les panneaux (A) et (B) proviennent d’un donneur différent de celui des panneaux (C) et (D). (A) Sécrétion hormonale absolue à partir de 3 tranches de tissu pancréatique provenant d’un seul donneur non diabétique. La sécrétion d’insuline est représentée en vert et la sécrétion de glucagon en magenta. (B) Sécrétion hormonale indiquée en (A) normalisée à la teneur totale en hormones (% de la teneur). Le contenu est mesuré à partir des 3 tranches utilisées dans l’expérience. (C) Sécrétion dynamique d’insuline d’îlots isolés (100 îlots) et de tranches de tissu pancréatique (3 tranches) d’un même donneur non diabétique. Les données sont présentées en chiffres absolus (mU/L). (D) Sécrétion d’insuline indiquée en (C) normalisée à la teneur totale en insuline (% du contenu). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Configuration de l’imagerie et résultats attendus. (A) Configuration de l’imagerie fonctionnelle avec un microscope confocal droit et une configuration de périfusion. (B) Chambre d’imagerie reliée à l’entrée et à la sortie. (C) Pile Z d’images confocales d’un îlot dans une tranche de tissu d’un donneur humain sain montrant la lumière réfléchie (en haut) et le signal Fluo4 (en bas). La réflexion permet d’identifier les îlots à l’intérieur de la tranche (ligne pointillée). (D) Carte thermique montrant la dynamique in vitro du Ca2+ des cellules des îlots pancréatiques, exprimée par l’intensité fluorescente de Fluo4 normalisée à l’intensité du signal basal à 5,5 mM de glucose et à la stimulation avec un taux élevé de glucose (16,7 mM). Chaque rangée représente une seule cellule suivie dans le temps sur l’axe des x et sa réponse en variation de l’amplitude (%) de l’intensité fluorescente par rapport à la ligne de base (dF/F) indiquée dans l’échelle de couleurs du bleu (faible intensité) au rouge (haute intensité). (E) Traces représentatives de 4 cellules individuelles montrant une réponse à une glycémie élevée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 6 : Paramètres d’imagerie calcique. Capture d’écran du logiciel des paramètres représentatifs choisis pour effectuer des enregistrements en accéléré de 40 μm (imagerie XYZT). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Nous présentons ici un protocole permettant de générer des coupes de tissu pancréatique viables et leur utilisation pour des lectures fonctionnelles telles que la sécrétion dynamique d’hormones et l’imagerie fonctionnelle. Semblable à l’isolement des îlots humains, le succès de la procédure de coupe est influencé par divers facteurs, notamment les caractéristiques du donneur, le temps d’expédition des tissus et la qualité des tissus25,29. Par conséquent, il est crucial de sélectionner soigneusement des échantillons de tissus pour l’expérience et de réduire au minimum les temps d’ischémie. Dans ce contexte, d’autres sources potentielles de tissus humains que les donneurs cadavériques doivent être soigneusement examinées. L’inclusion de donneurs chirurgicaux offre la possibilité de combiner les données fonctionnelles des coupes avec des informations in vivo pertinentes provenant du même patient, renforçant ainsi la pertinence translationnelle11. Cependant, cette source tissulaire apporte d’autres facteurs car les biopsies proviennent généralement de patients plus âgés subissant une pancréatectomie, principalement en raison d’une tumeur localisée. Notamment, les biopsies du pancréas ne sont pas réalisées dans le cadre du diabète.

Lors de l’exécution de la procédure de tranchage proprement dite, le traitement rapide des tissus est essentiel. Les tranches peuvent être conservées pendant plusieurs heures, comme indiqué dans le présent protocole, ou mises en culture pendant de longues périodes, comme décrit par Qadir et al.19. À l’heure actuelle, ce protocole est la seule méthode pour maintenir la viabilité des tranches sur des périodes prolongées, mais les efforts futurs devraient évaluer les changements fonctionnels à travers diverses périodes de culture et établir des comparaisons avec des îlots isolés, provenant du même donneur.

L’étape la plus critique du processus est la préparation minutieuse des tissus avant l’enrobage dans l’agarose. De grands canaux et des tissus fibreux peuvent compliquer le processus de tranchage et potentiellement entraîner la rupture de blocs tissulaires de l’agarose. Si cela se produit et que les pièces restent de taille raisonnable, elles peuvent être retraitées et enrobées pour le tranchage. Le maintien d’une bonne qualité des tissus et d’un traitement minutieux améliore considérablement l’efficacité de la procédure de tranchage et permet d’obtenir le maximum de quantité et de qualité de tranches. Le temps écoulé entre la préparation des tissus et la génération de la tranche ne doit pas dépasser 2 à 3 h, car des intervalles plus longs ont un impact significatif sur la viabilité des tissus.

Lors de la périfusion de la tranche, une étape simple mais critique est la coupe précise de la tranche pour assurer un ajustement parfait dans la chambre. Cela permet un bain correct des tissus et un écoulement ininterrompu. Une fois le protocole initié, il est essentiel d’éviter toute manipulation supplémentaire des chambres pour éviter des pics indésirables de libération d’hormones. Un tampon suffisant doit être préparé et le tube doit atteindre le fond de la solution pour éviter l’aspiration d’air et l’assèchement des chambres.

Pour l’imagerie calcique, il est important de choisir soigneusement la zone d’intérêt, en fonction des besoins et de la conception de l’expérience. Il est important de minimiser le photoblanchiment en choisissant des paramètres d’imagerie qui réduisent l’exposition à la lumière ou raccourcissent la durée globale du protocole. Comme pour la sécrétion hormonale dynamique, le maintien d’un bon débit de solution et d’un réglage chauffé est crucial, car les tranches nécessitent des conditions quasi physiologiques pour fonctionner de manière optimale (par exemple, 37 °C).

Les coupes de tissu pancréatique maintiennent efficacement l’intégrité structurelle du pancréas, préservant les connexions cellule-cellule entre ses divers types de cellules. Par conséquent, ils offrent une alternative au travail avec des îlots isolés, facilitant l’exploration simultanée des fonctions endocriniennes et exocrines et leur interaction. Pour évaluer l’interaction des types de cellules individuelles, il est crucial de les distinguer. La coloration a posteriori est une option, mais elle présente des limites en termes de sondes fluorescentes disponibles et le défi de localiser les couches cellulaires exactes. Par conséquent, il est conseillé d’incorporer des stimuli spécifiques aux cellules dans le protocole pour permettre la discrimination cellulaire basée sur les réponses. Pour discriminer entre les types de cellules chez la souris ou les tranches humaines, les stimuli efficaces comprennent l’adrénaline pour les cellules alpha21,30, la ghréline pour les cellules delta31, la céruléine pour les cellules acineuses 5,32, les acides biliaires pour les cellules canalaires33 et la noradrénaline pour les cellules vasculaires22. Des stimuli similaires peuvent être utilisés pour mesurer les réponses sécrétoires. Alors que les études d’imagerie se concentrent sur les cellules individuelles, les études de sécrétion analysent la réponse collective. Par conséquent, il est crucial d’inclure un grand nombre de tranches pour détecter les résultats souhaités. La quantité optimale peut varier selon les types de cellules, trois tranches s’avérant suffisantes pour les cellules endocrines ; Cependant, il est conseillé d’utiliser plus de tranches pour assurer la détectabilité plutôt que de risquer de manquer des informations précieuses.

Comme toute autre méthode, les coupes de tissus ont des limites qui doivent être prises en compte lors de l’interprétation des résultats. L’application d’un stimulus ciblant des types de cellules spécifiques peut entraîner des effets sur d’autres types de cellules dans la tranche, déclenchant potentiellement des boucles de rétroaction. Cependant, il est également important de les étudier et les réponses mesurées peuvent donc être plus représentatives d’une réponse physiologique. Pour le ciblage cellulaire sélectif, des protocoles in vitro traditionnels peuvent être utilisés. Il est important de noter que les cellules acineuses contiennent des enzymes pancréatiques qui peuvent décomposer les protéines et digérer la tranche de tissu, entraînant une dégradation cellulaire en quelques heures. Pour maintenir la viabilité, l’utilisation constante d’inhibiteurs de la trypsine est essentielle lorsque les tranches sont dans un état statique, même si leur application peut interférer avec le transfert réussi des virus utilisés à des fins d’étiquetage.

Par rapport à l’isolement des îlots, la variabilité du donneur et la qualité des tissus peuvent avoir un impact à la fois sur la quantité et la viabilité des tranches obtenues. Une viabilité insuffisante après le tranchage peut entraîner une courte durée de vie et entraver la capacité de culture des tranches. De plus, le nombre d’îlots pancréatiques peut varier considérablement d’un donneur à l’autre, ce qui rend difficile l’estimation du contenu des îlots avant de mener des expériences. Par conséquent, une sélection minutieuse des critères d’acceptation du donneur et la mise en œuvre de méthodes de normalisation appropriées, telles que le pourcentage de contenu hormonal pour la sécrétion ou le changement de pli par rapport à la ligne de base, sont cruciales. Pour des résultats cohérents, il est conseillé d’évaluer la viabilité des coupes de tissu avant l’expérience. De plus, il est recommandé d’incorporer des stimuli de contrôle pertinents (par exemple, KCl) dans l’expérience. Dans le cas de l’analyse de cellules individuelles, comme l’imagerie, il est possible de pré-trier les cellules en fonction de leur réponse à ces stimulations de contrôle. Malgré les défis mentionnés, les coupes offrent une augmentation précieuse aux méthodes de recherche actuelles.

Le protocole décrit peut être utilisé comme point de départ pour plusieurs applications, et les tranches de pancréas peuvent être manipulées, et les réponses examinées après une variété de stimuli. Nous dirigeons également les lecteurs vers de nombreuses études de recherche utilisant des tranches de pancréas de souris ou d’homme, fournissant des informations précieuses à ceux qui planifient leurs expériences. À l’avenir, il est possible que des thérapies potentielles soient étudiées à l’aide de coupes pancréatiques ou que les mécanismes de la maladie soient modélisés.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été réalisée avec le soutien du Réseau des donneurs d’organes pancréatiques atteints de diabète (nPOD ; RRID :SCR_014641), un projet de recherche collaboratif sur le diabète de type 1 soutenu par FRDJ (nPOD : 5-SRA-2018-557-Q-R) et la Fiducie de bienfaisance Leona M. & Harry B. Helmsley (Grant#2018PG-T1D053, G-2108-04793). Le contenu et les opinions exprimées relèvent de la responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement l’opinion officielle de nPOD. La liste des organismes d’approvisionnement en organes (OPO) qui s’associe au nPOD pour fournir des ressources de recherche est présentée au http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Les auteurs sont reconnaissants envers les donateurs et leurs familles pour leur précieuse contribution. Ce travail a été soutenu par l’American Diabetes Association 4-22-PDFPM (J.K.P.) et le Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust (subvention 2015-PG-T1D-052).

Materials

Alanine Sigma A7627 amino acid
AlexaFluor 488 goat anti-guineapig Invitrogen A11073 secondary antibody
AlexaFluor 546 goat anti-rat Thermo Fisher A11077 secondary antibody
AlexaFluor 647 goat anti-mouse Thermo Fisher A21235 secondary antibody
Aprotinin Sigma A1153 inhibitor
Arginine Sigma A5006 amino acid
Calbryte 520 AM AAT Bioquest 20651 Calcium dye
Fluo4-AM Invitrogen F14201 Calcium dye
Fluorescein diacetat Sigma F7378 viability marker
Glucagon Sigma G2654 primary antibody
Glucagon ELISA (human kit) Mercodia 10-1271-01 ELISA for hormone detection
Glutamine Sigma G3126 amino acid
Insulin Dako A-0546 primary antibody
Insulin ELISA (human) Mercodia 10-1113-01 ELISA for hormone detection
Low melting point agarose Sigma A9414
LSM 900 Zeiss confocal microscope
Pancreas Slice Chamber Biorep Technologies PERI-PSC-001 slice chamber for perifucion
Pancreas Slice Chamber Extender Kit Biorep Technologies PERI-PSC-EXT slice chamber for perifucion
Pancreas Slice Chamber Perforated Plate Biorep Technologies PERI-PSC-PP slice chamber for perifucion
Perifusion system with automated tray handling Biorep Technologies PERI4-02-230-FA
Propidium iodide Life technologies P1304MP dead marker
Semi-automatic vibratome VT1200S Leica 14048142066
Somatostatin Millipore MAB354 primary antibody
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References

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Panzer, J. K., Garcia, P. A., Pugliese, A. Generating Human Pancreatic Tissue Slices to Study Endocrine and Exocrine Pancreas Physiology. J. Vis. Exp. (205), e66468, doi:10.3791/66468 (2024).
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