Summary

TD Drive: un impianto parametrico open-source per registrazioni elettrofisiologiche multi-area in ratti comportamentali e addormentati

Published: April 26, 2024
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Summary

Qui, presentiamo un impianto unico e stampabile in 3D per ratti, chiamato TD Drive, in grado di registrare elettrodi a filo bilaterali simmetrici, attualmente in un massimo di dieci aree cerebrali distribuite contemporaneamente.

Abstract

Interazioni intricate tra più aree cerebrali sono alla base della maggior parte delle funzioni attribuite al cervello. Il processo di apprendimento, così come la formazione e il consolidamento dei ricordi, sono due esempi che si basano fortemente sulla connettività funzionale in tutto il cervello. Inoltre, lo studio delle somiglianze e/o delle differenze emisferiche va di pari passo con queste interazioni multi-area. Gli studi elettrofisiologici che cercano di chiarire ulteriormente questi processi complessi dipendono quindi dalla registrazione dell’attività cerebrale in più luoghi contemporaneamente e spesso in modo bilaterale. Qui viene presentato un impianto stampabile in 3D per ratti, chiamato TD Drive, in grado di registrare elettrodi a filo bilaterali simmetrici, attualmente in un massimo di dieci aree cerebrali distribuite contemporaneamente. Il design open-source è stato creato utilizzando i principi della progettazione parametrica, consentendo ai potenziali utenti di adattare facilmente il design dell’azionamento alle proprie esigenze semplicemente regolando parametri di alto livello, come le coordinate antero-posteriori e mediolaterali delle posizioni degli elettrodi di registrazione. Il design dell’impianto è stato convalidato in n = 20 ratti incappucciati Lister che hanno svolto compiti diversi. L’impianto era compatibile con le registrazioni del sonno legate e le registrazioni in campo aperto (Object Exploration), nonché con la registrazione wireless in un grande labirinto utilizzando due diversi sistemi di registrazione commerciali e headstage. Pertanto, qui viene presentata la progettazione e l’assemblaggio adattabili di un nuovo impianto elettrofisiologico, che facilita la preparazione e l’impianto rapidi.

Introduction

La natura multi-area delle interazioni cerebrali durante la veglia e il sonno rende difficile studiare in modo esaustivo i processi fisiologici in corso. Mentre approcci come la risonanza magnetica funzionale (fMRI) e l’ecografia funzionale (fUS) consentono il campionamento dell’attività cerebrale da cervelli interi 1,2, sfruttano l’accoppiamento neurovascolare per dedurre l’attività cerebrale dall’attività emodinamica, limitando la loro risoluzione temporale2. Inoltre, la fMRI richiede il posizionamento del soggetto della ricerca in uno scanner MRI, vietando esperimenti con animali che si muovono liberamente. L’imaging ottico della dinamica del calcio con imaging a singolo o multifotone consente registrazioni specifiche per tipo di cellula di centinaia di neuroni contemporaneamente3. Tuttavia, i microscopi montati sulla testa come il Miniscope3, che consentono un comportamento di movimento libero, sono solitamente limitati all’imaging di aree corticali superficiali in cervelli intatti4. Mentre il diametro del loro campo visivo sulla corteccia può essere dell’ordine di 1 mm, i requisiti di spazio di questi microscopi montati sulla testa possono rendere difficile il targeting di diverse aree, in particolare adiacenti. Pertanto, per catturare accuratamente le dinamiche cerebrali multi-area nella veglia e nel sonno, l’elettrofisiologia extracellulare, registrata con elettrodi impiantati nelle aree cerebrali di interesse, è uno dei metodi di scelta grazie alla sua elevata risoluzione temporale e precisione spaziale5. Inoltre, consente la caratterizzazione della dinamica del sonno negli animali compatibile con le analisi ottenute dall’EEG umano, aumentando il valore traslazionale di questo metodo6.

Classicamente, gli studi che registrano l’attività cerebrale con elettrodi extracellulari hanno impiegato singoli elettrodi a filo o fasci di elettrodi, come i tetrodi7. Sonde all’avanguardia come la sonda Neuropixels8 consentono di mirare a più aree contemporaneamente, dato che sono allineate su un asse che consente di impiantare la sonda lungo quell’asse senza danneggiare l’animale. Tuttavia, le registrazioni simultanee accurate di più aree spazialmente separate rimangono ancora impegnative, con i metodi esistenti che sono costosi o richiedono molto tempo.

Negli ultimi anni, i metodi di produzione additiva come la stereolitografia sono diventati ampiamente disponibili. Ciò ha permesso ai ricercatori di sviluppare nuovi impianti di elettrodi adattabili alle loro esigenze sperimentali9, ad esempio un targeting semplificato e ripetibile di più aree cerebrali. Spesso, questi progetti di impianti sono anche condivisi con la comunità accademica come hardware open source, consentendo ad altri ricercatori di adattarli ai propri scopi. Il grado di adattabilità di specifici impianti varia sia in base a come l’impianto è progettato sia a come è condiviso. La modellazione parametrica10 è un approccio popolare nella progettazione assistita da computer, in cui diversi componenti del progetto sono collegati da parametri interdipendenti e da una storia di progettazione definita. L’implementazione di un approccio parametrico per la progettazione degli impianti ne aumenta la riutilizzabilità e l’adattabilità10, poiché la modifica dei singoli parametri aggiorna automaticamente i progetti completi senza la necessità di una complessa rimodellazione del progetto. Una necessità consequenziale è che il progetto stesso sia condiviso in un formato modificabile che preservi le relazioni parametriche e la cronologia del progetto. I formati di file che rappresentano solo primitive geometriche, come STL o STEP, rendono impossibili le successive modifiche parametriche dei modelli pubblicati.

Mentre gli iperdrive tetrodici 11,12,13 consentono registrazioni da dozzine di tetrodi, il loro assemblaggio e il loro impianto richiedono molto tempo e la loro qualità dipende in gran parte dall’abilità e dall’esperienza del singolo ricercatore. Inoltre, di solito combinano i tubi guida che dirigono gli elettrodi di registrazione verso la loro posizione target in uno o due fasci più grandi, limitando così il numero e la diffusione delle aree che possono essere mirate in modo efficiente.

Altri impianti14,15 espongono l’intero cranio e consentono il posizionamento libero di più microazionamenti individuali che trasportano gli elettrodi di registrazione. Sebbene il posizionamento di microdrive indipendenti16 durante l’intervento massimizzi la flessibilità, aumenta il tempo di intervento e può rendere difficile il targeting di più aree adiacenti a causa dei requisiti di spazio dei singoli microdrive. Inoltre, sebbene gli impianti siano open source, vengono pubblicati solo come file STL, rendendo difficile la modifica.

Un esempio di azionamento con una filosofia parametrica più intrinseca è il RatHat17. Fornendo uno stencil chirurgico che copre l’intera superficie dorsale del cranio, consente di mirare con precisione a più bersagli cerebrali senza l’uso di una cornice stereotassica durante l’intervento chirurgico. Sono disponibili diverse varianti di impianto per cannule, optrodi o tetrodi. Tuttavia, sebbene l’unità sia gratuita per scopi accademici, non è pubblicata in modo open source, creando un ostacolo per i ricercatori nella valutazione e nell’utilizzo dell’impianto.

In questo articolo viene presentato il TD Drive (vedi Figura 1), un nuovo impianto stampabile in 3D per la registrazione di elettrodi extracellulari nei ratti. Il TD Drive mira a superare alcuni degli svantaggi delle soluzioni esistenti: consente di colpire più aree cerebrali, riflesse su entrambi gli emisferi, con elettrodi a filo indipendenti contemporaneamente. Grazie al suo design semplice, può essere assemblato in poche ore a un costo relativamente basso da ricercatori meno esperti. Il TD Drive è pubblicato open-source, in formati di file facilmente modificabili per consentire ai ricercatori di adattarlo alle loro esigenze specifiche. L’incorporazione di un approccio di modellazione 3D parametrica fin dall’inizio del processo di progettazione del TD Drive consente di astrarre i parametri necessari: per modificare le posizioni di destinazione, i ricercatori possono semplicemente modificare i parametri che rappresentano le loro coordinate dorso-ventrali e anteroposteriori, senza la necessità di riprogettare l’azionamento da soli. I file per modificare e produrre l’unità TD sono disponibili all’indirizzo https://github.com/3Dneuro/TD_Drive.

Figure 1
Figura 1: Panoramica dell’unità TD . (A) Rendering di un’unità TD con un cappuccio protettivo. (B) Rendering con le parti interne mostrate. L’unità TD è dotata di (a) posizioni di registrazione multiple regolabili parametricamente per fili di elettrodi fissi e mobili, un EIB con (b) un connettore Omnetics ad alta densità compatibile con i comuni sistemi di acquisizione dati cablati e wireless e (c) una mappatura intuitiva dei canali ottimizzata per le registrazioni con sistemi Intan/Open Ephys (vedere la Figura 1 supplementare) e (d) un cappuccio per proteggere l’impianto durante le registrazioni in tethering e quando non è collegato alcun headstage. (C) Uno stencil guida sul fondo del TD Drive facilita il posizionamento delle cannule guida e funge da verifica ridondante delle posizioni degli impianti durante l’intervento chirurgico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il design dell’impianto è stato testato in n = 4, convalidato in n = 8 e confermato in n= 8 ratti incappucciati Lister che hanno svolto compiti diversi. I primi 4 animali sono stati utilizzati per sviluppare l’azionamento e regolare i parametri. Quindi, è stato eseguito un progetto pilota completo con 8 animali (mostrato nei risultati). Una seconda coorte di 8 animali è stata analizzata e inclusa nell’analisi di sopravvivenza dell’impianto. L’impianto era compatibile con le registrazioni del sonno vincolate e le registrazioni in campo aperto (Object Exploration), nonché con la registrazione wireless in un grande labirinto (HexMaze 9 m x 5 m) utilizzando due diversi sistemi di registrazione commerciali e headstage. Le due coorti di 8 sono state registrate con due diversi sistemi di acquisizione: collegato per registrazioni del sonno più lunghe e wireless per registrazioni di esplorazione di labirinti di grandi dimensioni. Possiamo concludere che questo semplice azionamento a filo consente esperimenti di lunga durata con coorti più grandi da parte di ricercatori meno esperti per consentire l’analisi della fase del sonno e l’analisi delle oscillazioni in più aree cerebrali. Ciò è in contrasto con la maggior parte degli impianti di elettrofisiologia fino ad oggi, che, a causa della difficoltà e dell’intensità del tempo, consentono coorti di animali più piccole e di solito richiedono sperimentatori molto esperti. Tuttavia, con questa unità, non è possibile registrare l’attività dei singoli neuroni; pertanto, l’uso è limitato alle indagini sul potenziale di campo locale (LFP) e all’attività di sommatoria.

Protocol

Il presente studio è stato approvato dalla Commissione centrale olandese Dierproeven (CCD) e condotto secondo la legge sugli esperimenti sugli animali (codici protocollo: 2020-0020-006 e 2020-0020-010). Sono stati utilizzati ratti incappucciati maschi di 9-12 settimane all’arrivo. I reagenti e le attrezzature utilizzate nel protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali. Vedere la Figura 1 supplementare e la Figura 2 supplementare…

Representative Results

Utilizzando le istruzioni fornite nel protocollo, il TD Drive potrebbe essere costruito facilmente da più sperimentatori. Dopo lo sviluppo dell’unità (n = 4), è stato eseguito un progetto pilota completo con otto animali. È stato impiantato un ulteriore lotto di otto animali ed è stata eseguita la raccolta dei dati sperimentali. Poiché l’analisi dei dati su questi animali non è stata completata, essi sono stati inclusi nell’analisi di sopravvivenza, ma non in altre analisi (ad ese…

Discussion

In questo articolo viene presentato un impianto adattabile per registrazioni bilaterali e simmetriche di elettrodi a filo multi-area per ratti che si muovono liberamente.

La possibilità di regolare facilmente l’impianto modificando i parametri predefiniti è stata una delle motivazioni per la creazione del TD Drive. Pur mirando a massimizzare la flessibilità per i parametri variabili, i vincoli intrinseci nelle relazioni tra di essi impongono necessariamente…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare Angela Gomez Fonseca per l’ispirazione per lo sviluppo dell’unità e tutti gli studenti che hanno condotto esperimenti pilota con gli animali, Milan Bogers, Floor van Ravenswoud ed Eva Severijnen. Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio olandese per la ricerca (NWO; Programma Crossover 17619 “INTENSE”).

Materials

0.5 mm drill bit  McMaster 2951A38
1.27 mm pitch interconnected SIP/DIP socket (Mill-Max) Mouser Electronic 575-003101 For essembling and connection of EEG & GND screws
5 minute epoxy  Bison Commercially available regular off-the-shelf epoxy
cyanoacrylate glue Loctite Super Glue-3 
EEG wire Science Products GmbH 7SS-2T
Electrode wire Science Products GmbH NC7620F
Ethanol LC For standard pre-operative sterilization procedure of drive
Fine forceps (5) FST 91150-20 For wire bundle preperation and handling
Form 3B Formlabs 3D printer used to 3D print the self-printed parts of the TD drive
Gold pins (small) Neuralynx, Inc. 9885 Attachment of electorde wires to EIB board
Ground wire Science Products GmbH SS-3T/A
High-density connector  LabMaker GmbH/Omnetics A79026-001
Lister Hodded rats Charles River Laboratories Crl:LIS we used male rats, 9-12 weeks of age at arrival
M1 brass insert AliExpress Commercially available https://aliexpress.com/item/33047616164.html
M1 tap McMaster 2504A33
M1x16 screw Bossard 1096613
M1x3 stainless steel screws  Screws and More 84213_14985
M2.5×5 polyimide screws Screws and more 7985PA25S_50
mineral oil McMaster 1244K14
Nail polish Etos Commercially available For color coding EEG and GND wires
painter's tape Gamma Commercially available For wire bundle preperation
Pin vise McMaster 8455A16
plotting paper Canson Commercially available For wire bundle preperation
polyimide tubes Amazon / Small Parts TWPT-0159-30-50 AWG, 0.0159" ID, 0.0219" OD, 0.0030" Wall, 30" Length
RHD 32-channel headstage with accelerometer Intan Technologies, LLC C3324 For tethered recordings in the sleepbox
RHD 3-ft (0.9 m) standard SPI cables Intan Technologies, LLC C3203 From commutator to headstage
RHD 6-ft (1.8 m) standard SPI cables Intan Technologies, LLC C3206 From OpenEphys box to commutator
Slip Ring with Flange Adafruit 1196 Commutator: 22 mm diameter, 12 wires
Solder flux  Griffon S-39 50 ml Commercially available For soldering EEG & GND screws
soldering paste Amazon B08CBZ5HC5
stainless steel M2 nut  McMaster 93935A305
Tethered recording setup  OpenEphys Acquasition Board
Wireless recording logger SpikeGadgets miniLogger 32 For wireless recordings in the task
Wireless recording setup SpikeGadgets Main Control Unit (MCU) incl. breakout board and RF transceiver For wireless recordings in the task

References

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Schröder, T., van der Meij, J., van Heumen, P., Samanta, A., Genzel, L. The TD Drive: A Parametric, Open-Source Implant for Multi-Area Electrophysiological Recordings in Behaving and Sleeping Rats. J. Vis. Exp. (206), e66457, doi:10.3791/66457 (2024).

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