כונן TD: שתל פרמטרי בקוד פתוח לרישומים אלקטרופיזיולוגיים רב-אזוריים בחולדות מתנהגים וישנים
Summary
כאן, אנו מציגים שתל ייחודי הניתן להדפסה בתלת-ממד עבור חולדות, בשם TD Drive, המסוגל להקליט אלקטרודות תיל סימטריות דו-צדדיות, כיום בעד עשרה אזורי מוח מבוזרים בו זמנית.
Abstract
אינטראקציות מורכבות בין אזורים מרובים במוח עומדות בבסיס רוב התפקודים המיוחסים למוח. תהליך הלמידה, כמו גם היווצרות וגיבוש של זיכרונות, הן שתי דוגמאות הנשענות במידה רבה על קישוריות תפקודית ברחבי המוח. בנוסף, חקירת קווי דמיון ו/או הבדלים בחצי האי הולכת יד ביד עם אינטראקציות רב-אזוריות אלה. מחקרים אלקטרופיזיולוגיים המנסים להבהיר עוד יותר את התהליכים המורכבים הללו תלויים אפוא ברישום פעילות מוחית במספר מקומות בו זמנית ולעתים קרובות באופן דו-צדדי. כאן מוצג שתל הניתן להדפסה תלת-ממדית עבור חולדות, בשם TD Drive, המסוגל להקליט אלקטרודות תיל סימטריות דו-צדדיות, כיום בעד עשרה אזורי מוח מבוזרים בו זמנית. עיצוב הקוד הפתוח נוצר תוך שימוש בעקרונות תכנון פרמטריים, המאפשרים למשתמשים פוטנציאליים להתאים בקלות את עיצוב הכונן לצרכיהם פשוט על ידי התאמת פרמטרים ברמה גבוהה, כגון קואורדינטות קדמיות-אחוריות ובינוניות של מיקומי אלקטרודות ההקלטה. עיצוב השתל אומת ב-n = 20 חולדות עם ברדס ליסטר שביצעו משימות שונות. השתל התאים להקלטות שינה קשורות והקלטות שדה פתוח (Object Exploration) וכן הקלטה אלחוטית במבוך גדול באמצעות שתי מערכות הקלטה מסחריות שונות ובמות ראש. לפיכך, מוצג כאן הוא עיצוב והרכבה הניתנים להתאמה של שתל אלקטרופיזיולוגי חדש, המאפשרים הכנה מהירה והשתלה.
Introduction
האופי הרב-אזורי של אינטראקציות מוחיות במהלך ערות ושינה מקשה על מחקר ממצה של התהליכים הפיזיולוגיים המתמשכים. בעוד גישות כגון MRI תפקודי (fMRI) ואולטרסאונד תפקודי (fUS) מאפשרות דגימה של פעילות המוח ממוחות שלמים 1,2, הן מנצלות צימוד נוירו-וסקולרי כדי להסיק פעילות מוחית מפעילות המודינמית, ומגבילות את הרזולוציה הטמפורלית שלהם2. בנוסף, fMRI דורש מיקום של נושא המחקר בסורק MRI, ואוסר על ניסויים עם בעלי חיים הנעים בחופשיות. הדמיה אופטית של דינמיקת סידן באמצעות הדמיה בודדת או מולטיפוטון מאפשרת הקלטות ספציפיות לסוג התא של מאות תאי עצב בו זמנית3. עם זאת, מיקרוסקופים המותקנים על הראש כגון המיניסקופ3, המאפשרים תנועה חופשית, מוגבלים בדרך כלל להדמיית אזורים שטחיים בקליפת המוח במוחות שלמים4. בעוד שקוטר שדה הראייה שלהם על קליפת המוח יכול להיות בסדר גודל של 1 מ”מ, דרישות השטח של מיקרוסקופים אלה המותקנים על הראש יכולות להקשות על מיקוד בכמה אזורים, במיוחד סמוכים. לכן, כדי ללכוד דינמיקה מוחית רב-אזורית בערות ובשינה בצורה מדויקת, אלקטרופיזיולוגיה חוץ-תאית, המתועדת באמצעות אלקטרודות המושתלות באזורי העניין במוח, היא אחת השיטות המועדפות בשל הרזולוציה הטמפורלית הגבוהה והדיוק המרחבישלה 5. בנוסף, היא מאפשרת אפיון של דינמיקת שינה בבעלי חיים התואמת לניתוחים המתקבלים מ- EEG אנושי, ומגדילה את הערך התרגומי של שיטה זו6.
באופן קלאסי, מחקרים המתעדים פעילות מוחית עם אלקטרודות חוץ-תאיות השתמשו באלקטרודות חוט בודדות או בצרורות אלקטרודות, כגון טטרודים7. גשושיות חדישות כגון Neuropixels probe8 מאפשרות להתמקד במספר אזורים בו זמנית, בהתחשב בכך שהם מיושרים על ציר המאפשר להשתיל את הגשושית לאורך ציר זה מבלי לפגוע בחיה. עם זאת, הקלטות סימולטניות מדויקות של אזורים מרובים ומופרדים מרחבית עדיין נותרות מאתגרות, כאשר השיטות הקיימות הן יקרות או גוזלות זמן.
בשנים האחרונות, שיטות ייצור תוספים כגון סטריאוליתוגרפיה הפכו זמינות באופן נרחב. זה איפשר לחוקרים לפתח שתלי אלקטרודות חדשניים שהיו ניתנים להתאמה לדרישות הניסוי שלהם9, למשל, פישוט פשוט יותר שניתן לחזור על עצמו של אזורים מרובים במוח. לעתים קרובות, עיצובי שתלים אלה משותפים גם עם הקהילה האקדמית כחומרת קוד פתוח, המאפשרת לחוקרים אחרים להתאים אותם למטרותיהם. מידת ההסתגלות של שתלים ספציפיים משתנה הן כתוצאה מאופן תכנון השתל והן מאופן השיתוף שלו. מידול פרמטרי10 היא גישה פופולרית בתכנון בעזרת מחשב, שבה רכיבים שונים של העיצוב מקושרים על ידי פרמטרים התלויים זה בזה והיסטוריית תכנון מוגדרת. יישום גישה פרמטרית לתכנון שתלים מגדיל את יכולת השימוש החוזר וההתאמה שלהם10, שכן שינוי פרמטרים בודדים מעדכן אוטומטית את העיצובים המלאים ללא צורך במידול מחדש מורכב של העיצוב. הכרח תוצאתי הוא שהעיצוב עצמו משותף בפורמט ניתן לעריכה המשמר את היחסים הפרמטריים ואת ההיסטוריה של העיצוב. תבניות קובץ המייצגות רק פרימיטיבים גיאומטריים, כגון STL או STEP, הופכות את השינויים הפרמטריים הבאים של מודלים שפורסמו לבלתי אפשריים.
בעוד שהיפר-כוננים טטרודים 11,12,13 מאפשרים הקלטות מעשרות טטרודים, הרכבתם והשתלתם גוזלים זמן, ואיכותם תלויה במידה רבה במיומנות ובניסיון של החוקר הבודד. בנוסף, הם בדרך כלל משלבים את צינורות ההנחיה המכוונים את אלקטרודות ההקלטה למיקום היעד שלהם בצרור אחד או שניים גדולים יותר, ובכך מגבילים את מספר והתפשטות האזורים שניתן לכוון אליהם ביעילות.
שתלים אחרים 14,15 חושפים את הגולגולת המלאה ומאפשרים מיקום חופשי של מיקרו-כוננים נפרדים מרובים הנושאים את אלקטרודות ההקלטה. בעוד המיקום של מיקרו-כוננים עצמאיים16 במהלך זמן הניתוח ממקסם את הגמישות, הוא מאריך את זמן הניתוח ויכול להקשות על מיקוד באזורים סמוכים מרובים בשל דרישות השטח של המיקרו-כוננים הבודדים. בנוסף, בעוד השתלים הם קוד פתוח, הם מתפרסמים רק כקבצי STL, מה שמקשה על השינוי.
דוגמה לכונן עם פילוסופיה פרמטרית מובנית יותר היא RatHat17. על ידי מתן שבלונה כירורגית המכסה את כל פני השטח הגבי של הגולגולת, היא מאפשרת מיקוד מדויק של מטרות מוח מרובות ללא שימוש במסגרת סטריאוטקטית במהלך הניתוח. קיימות וריאציות מרובות של שתלים עבור צינוריות, אופטרודות או טטרודים. עם זאת, בעוד שהכונן חופשי לשימוש למטרות אקדמיות, הוא אינו מפורסם בקוד פתוח, מה שיוצר מכשול לחוקרים להעריך את השתל ולהשתמש בו.
במאמר זה מוצג TD Drive (ראו איור 1), שתל חדשני הניתן להדפסה בתלת-ממד עבור רישומי אלקטרודות חוץ-תאיות בחולדות. כונן TD נועד להתגבר על כמה מהחסרונות של פתרונות קיימים: הוא מאפשר להתמקד באזורים מרובים במוח, המשתקפים על פני שתי ההמיספרות, עם אלקטרודות חוט עצמאיות בו זמנית. בשל העיצוב הפשוט שלו, ניתן להרכיב אותו תוך מספר שעות בעלות נמוכה יחסית על ידי חוקרים פחות מנוסים. כונן TD מתפרסם בקוד פתוח, בפורמטים של קבצים הניתנים לשינוי בקלות כדי לאפשר לחוקרים להתאים אותו לצרכים הספציפיים שלהם. שילוב גישת מידול תלת-ממדית פרמטרית מתחילת תהליך התכנון של TD Drive מאפשר הפשטה של הפרמטרים הדרושים: כדי לשנות את מיקומי היעד, החוקרים יכולים פשוט לערוך את הפרמטרים המייצגים את הקואורדינטות הגב-ונטרליות והאנטרופוסטריוריות שלהם, ללא צורך בעיצוב מחדש של הכונן בעצמם. ניתן למצוא את הקבצים לשינוי וייצור כונן TD בכתובת https://github.com/3Dneuro/TD_Drive.
איור 1: סקירה כללית של כונן TD. (A) עיבוד של כונן TD עם מכסה מגן. (B) עיבוד עם חלקים פנימיים מוצגים. כונן TD כולל (א) מיקומי הקלטה מרובים הניתנים לכוונון פרמטרי עבור חוטי אלקטרודות קבועים וניתנים להזזה, EIB עם (ב) מחבר Omnetics בצפיפות גבוהה התואם למערכות איסוף נתונים נפוצות, ו-(ג) מיפוי ערוצים אינטואיטיבי הממוטב להקלטות עם מערכות Intan/Open Ephys (ראה איור משלים 1) ו-(d) כובע להגנה על השתל במהלך הקלטות קשורות וכאשר אין במת ראש מחוברת. (C) שבלונה מנחה בתחתית כונן TD מאפשרת את מיקום צינוריות ההנחיה ומשמשת כאימות מיותר של מיקומי השתלים במהלך הניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
תכנון השתל נוסה ב-n = 4, אומת ב-n = 8 ואושר בחולדות עם ברדס ליסטר שביצעו משימות שונות. 4 בעלי החיים הראשונים שימשו לפיתוח הכונן והתאמת הפרמטרים. לאחר מכן, נערך פיילוט מלא עם 8 בעלי חיים (מוצג בתוצאות). קבוצה שנייה של 8 בעלי חיים הופעלה ונכללה בניתוח הישרדות השתלים. השתל התאים להקלטות שינה קשורות והקלטות שדה פתוח (Object Exploration) וכן להקלטה אלחוטית במבוך גדול (HexMaze 9 m x 5 m) באמצעות שתי מערכות הקלטה מסחריות שונות ובמות ראש. שתי הקבוצות של 8 הוקלטו בשתי מערכות רכישה שונות – קשורות להקלטות שינה ארוכות יותר ואלחוט להקלטות חקר מבוכים גדולים. אנו יכולים להסיק כי כונן תיל פשוט זה מאפשר ניסויים ארוכי טווח עם קבוצות גדולות יותר על ידי חוקרים פחות מנוסים כדי לאפשר ניתוח שלב השינה כמו גם ניתוח תנודות באזורים מרובים במוח. זאת בניגוד לרוב השתלים האלקטרופיזיולוגיים עד כה, אשר בשל קושי ועוצמת זמן, מאפשרים קבוצות בעלי חיים קטנות יותר ובדרך כלל זקוקים לנסיינים מנוסים מאוד. עם זאת, עם כונן זה, לא ניתן לרשום פעילות נוירונים בודדים; לפיכך, השימוש מוגבל לחקירות של פוטנציאל שדה מקומי (LFP) ופעילות סיכום.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה מוצג שתל הניתן להתאמה עבור הקלטות אלקטרודות תיל דו-צדדיות וסימטריות מרובות אזורים עבור חולדות הנעות בחופשיות.
היכולת להתאים בקלות את השתל על ידי שינוי פרמטרים מוגדרים מראש הייתה אחד המניעים ליצירת כונן TD. בעוד שהמטרה היא למקסם את הגמישות לשינוי ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לאנג’לה גומז פונסקה על ההשראה לפיתוח הכונן ולכל התלמידים שערכו ניסויי פיילוט עם בעלי החיים, מילאן בוגרס, פלור ואן רייבנסוואד ואווה סבריינן. עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המחקר ההולנדית (NWO; תוכנית קרוסאובר 17619 “אינטנסיבי”).
Materials
| 0.5 mm drill bit | McMaster | 2951A38 | |
| 1.27 mm pitch interconnected SIP/DIP socket (Mill-Max) | Mouser Electronic | 575-003101 | For essembling and connection of EEG & GND screws |
| 5 minute epoxy | Bison | Commercially available | regular off-the-shelf epoxy |
| cyanoacrylate glue | Loctite | Super Glue-3 | |
| EEG wire | Science Products GmbH | 7SS-2T | |
| Electrode wire | Science Products GmbH | NC7620F | |
| Ethanol | LC | For standard pre-operative sterilization procedure of drive | |
| Fine forceps (5) | FST | 91150-20 | For wire bundle preperation and handling |
| Form 3B | Formlabs | 3D printer used to 3D print the self-printed parts of the TD drive | |
| Gold pins (small) | Neuralynx, Inc. | 9885 | Attachment of electorde wires to EIB board |
| Ground wire | Science Products GmbH | SS-3T/A | |
| High-density connector | LabMaker GmbH/Omnetics | A79026-001 | |
| Lister Hodded rats | Charles River Laboratories | Crl:LIS | we used male rats, 9-12 weeks of age at arrival |
| M1 brass insert | AliExpress | Commercially available | https://aliexpress.com/item/33047616164.html |
| M1 tap | McMaster | 2504A33 | |
| M1x16 screw | Bossard | 1096613 | |
| M1x3 stainless steel screws | Screws and More | 84213_14985 | |
| M2.5×5 polyimide screws | Screws and more | 7985PA25S_50 | |
| mineral oil | McMaster | 1244K14 | |
| Nail polish | Etos | Commercially available | For color coding EEG and GND wires |
| painter's tape | Gamma | Commercially available | For wire bundle preperation |
| Pin vise | McMaster | 8455A16 | |
| plotting paper | Canson | Commercially available | For wire bundle preperation |
| polyimide tubes | Amazon / Small Parts | TWPT-0159-30-50 | AWG, 0.0159" ID, 0.0219" OD, 0.0030" Wall, 30" Length |
| RHD 32-channel headstage with accelerometer | Intan Technologies, LLC | C3324 | For tethered recordings in the sleepbox |
| RHD 3-ft (0.9 m) standard SPI cables | Intan Technologies, LLC | C3203 | From commutator to headstage |
| RHD 6-ft (1.8 m) standard SPI cables | Intan Technologies, LLC | C3206 | From OpenEphys box to commutator |
| Slip Ring with Flange | Adafruit | 1196 | Commutator: 22 mm diameter, 12 wires |
| Solder flux | Griffon S-39 50 ml | Commercially available | For soldering EEG & GND screws |
| soldering paste | Amazon | B08CBZ5HC5 | |
| stainless steel M2 nut | McMaster | 93935A305 | |
| Tethered recording setup | OpenEphys | Acquasition Board | |
| Wireless recording logger | SpikeGadgets | miniLogger 32 | For wireless recordings in the task |
| Wireless recording setup | SpikeGadgets | Main Control Unit (MCU) incl. breakout board and RF transceiver | For wireless recordings in the task |
References
- Deffieux, T., Demené, C., Tanter, M. Functional Ultrasound Imaging: A New Imaging Modality for Neuroscience. Neuroscience. 474, 110-121 (2021).
- Finn, E. S., Poldrack, R. A., Shine, J. M. Functional neuroimaging as a catalyst for integrated neuroscience. Nature. 623 (7986), 263-273 (2023).
- Aharoni, D., Federico Guo, C. Aharoni-Lab/Miniscope-v4: Release for generating. GitHub. , (2023).
- Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain. eNeuro. 7 (1), (2020).
- Buzsáki, G., et al. Tools for probing local circuits: High-density silicon probes combined with optogenetics. Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).
- Lacroix, M. M., et al. Improved sleep scoring in mice reveals human-like stages. bioRxi.v. , (2018).
- Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Dynamics of the hippocampal ensemble code for space. Sci New Ser. 261 (5124), 1055-1058 (1993).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
- Headley, D. B., DeLucca, M. V., Haufler, D., Paré, D. Incorporating 3D-printing technology in the design of head-caps and electrode drives for recording neurons in multiple brain regions. J Neurophysiol. 113 (7), 2721-2732 (2015).
- Camba, J. D., Contero, M., Company, P. Parametric CAD modeling: An analysis of strategies for design reusability. Comput Aided Des. 74, 18-31 (2016).
- Kloosterman, F., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: Drive fabrication. J Vis Exp. (26), e1094 (2009).
- Voigts, J., Siegle, J. H., Pritchett, D. L., Moore, C. I. The flexDrive: An ultra-light implant for optical control and highly parallel chronic recording of neuronal ensembles in freely moving mice. Front Syst Neurosci. 7, (2013).
- Voigts, J., Newman, J. P., Wilson, M. A., Harnett, M. T. An easy-to-assemble, robust, and lightweight drive implant for chronic tetrode recordings in freely moving animals. J Neural Eng. 17 (2), 026044 (2020).
- Sheng, T., et al. A novel 3D-printed multi-driven system for large-scale neurophysiological recordings in multiple brain regions. J Neurosci Methods. 361, 109286 (2021).
- Vöröslakos, M., Petersen, P. C., Vöröslakos, B., Buzsáki, G. Metal microdrive and head cap system for silicon probe recovery in freely moving rodent. eLife. 10, e65859 (2021).
- Mishra, A., Marzban, N., Cohen, M. X., Englitz, B. Dynamics of neural microstates in the VTA-striatal-prefrontal loop during novelty exploration in the rat. bioRxiv. , (2020).
- Allen, L. M., et al. RatHat: A self-targeting printable brain implant system. eNeuro. 7 (2), (2020).
- . Soldering Safety Available from: https://safety.eng.cam.ac.uk/safe-working/copy_of_soldering-safety (2018)
- . Harvard Soldering Safety Guidelines Available from: https://www.ehs.harvard.edu/sites/default/files/soldering_safety_guidelines.pdf (2019)
- Samanta, A., et al. CBD lengthens sleep but shortens ripples and leads to intact simple but worse cumulative memory. iScience. 26 (11), 108327 (2023).
- Machado, F., Malpica, N., Borromeo, S. Parametric CAD modeling for open source scientific hardware: Comparing OpenSCAD and FreeCAD Python scripts. PLOS One. 14 (12), e0225795 (2019).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat: Procedures and pitfalls. Somatosens Mot Res. 27 (4), 131-148 (2010).
- Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic surgery and long-term maintenance of cranial implants in research animals. Contemp Top Lab Anim Sci. 38 (1), 56-63 (1999).
- França, A. S. C., van Hulten, J. A., Cohen, M. X. Low-cost and versatile electrodes for extracellular chronic recordings in rodents. Heliyon. 6 (9), e04867 (2020).
