Modello murino modificato di lesione cerebrale traumatica lieve ripetitiva che incorpora finestra cranica assottigliata e percussione fluida
Summary
Questo protocollo presenta un modello murino modificato di lesione cerebrale traumatica lieve ripetitiva (rmTBI) indotta tramite un metodo di lesione cranica chiusa (CHI). L’approccio presenta una finestra cranica assottigliata e una percussione fluida per ridurre l’infiammazione comunemente causata dall’esposizione alle meningi, insieme a una migliore riproducibilità e accuratezza nella modellazione dell’rmTBI nei roditori.
Abstract
La lesione cerebrale traumatica lieve è un disturbo neurologico clinicamente molto eterogeneo. Modelli animali di lesione cerebrale traumatica (TBI) altamente riproducibili con patologie ben definite sono urgentemente necessari per studiare i meccanismi della neuropatologia dopo trauma cranico lieve e testare le terapie. Replicare tutte le sequele del trauma cranico nei modelli animali si è rivelata una sfida. Pertanto, la disponibilità di più modelli animali di trauma cranico è necessaria per tenere conto dei diversi aspetti e gravità osservati nei pazienti con trauma cranico. CHI è uno dei metodi più comuni per fabbricare modelli di roditori di rmTBI. Tuttavia, questo metodo è suscettibile a molti fattori, tra cui il metodo di impatto utilizzato, lo spessore e la forma dell’osso del cranio, l’apnea animale e il tipo di supporto per la testa e l’immobilizzazione utilizzati. Lo scopo di questo protocollo è dimostrare una combinazione dei metodi FPI (Fluid Covered Window) e Fluid Percussion Injury (FPI) per produrre un modello murino preciso di rmTBI associato a CHI. L’obiettivo principale di questo protocollo è ridurre al minimo i fattori che potrebbero influire sull’accuratezza e sulla coerenza della modellazione CHI e FPI, tra cui lo spessore, la forma e il supporto della testa dell’osso del cranio. Utilizzando un metodo della finestra cranica assottigliata, la potenziale infiammazione dovuta alla craniotomia e all’FPI è ridotta al minimo, ottenendo un modello murino migliorato che replica le caratteristiche cliniche osservate nei pazienti con trauma cranico lieve. I risultati dell’analisi comportamentale e istologica utilizzando la colorazione con ematossilina ed eosina (HE) suggeriscono che l’rmTBI può portare a una lesione cumulativa che produce cambiamenti sia nel comportamento che nella morfologia grossolana del cervello. Nel complesso, l’rmTBI modificato associato a CHI rappresenta uno strumento utile per i ricercatori per esplorare i meccanismi sottostanti che contribuiscono ai cambiamenti fisiopatologici focali e diffusi nell’rmTBI.
Introduction
Il trauma cranico lieve, tra cui commozione cerebrale e sub-commozione cerebrale, rappresenta la maggior parte di tutti i casi di trauma cranico (>80% di tutti i trauma cranico)1. Il trauma cranico lieve deriva comunemente da cadute, incidenti stradali, atti di violenza, sport di contatto (ad es. calcio, boxe, hockey) e combattimenti militari 2,3. Un trauma cranico lieve può portare a eventi neurobiologici che influenzano le funzioni neurocomportamentali per tutta la vita del paziente e aumentano il rischio di malattie neurodegenerative 4,5,6. I modelli animali forniscono un mezzo efficiente e controllato per studiare il trauma cranico lieve, con la speranza di migliorare ulteriormente la diagnosi e il trattamento del trauma cranico lieve. Sono stati sviluppati vari modelli per il trauma cranico lieve, come l’impatto corticale controllato (CCI), la caduta di peso (WD), la lesione da percussione del fluido (FPI) e i modelli blast-TBI 7,8. Nessun singolo modello sperimentale può imitare l’intera complessità della patologia indotta da TBI 9,10. L’eterogeneità di questi modelli è vantaggiosa per affrontare le diverse caratteristiche associate ai pazienti con trauma cranico lieve e studiare i corrispondenti meccanismi cellulari e molecolari. Tuttavia, ogni modello animale di trauma cranico ha i suoi limiti3, limitando le nostre attuali conoscenze riguardo al trauma cranico lieve animale e alla loro rilevanza clinica.
I modelli WD e CCI sono utilizzati per replicare condizioni cliniche come la perdita di tessuto cerebrale, l’ematoma subdurale acuto, la lesione assonale, la commozione cerebrale, la disfunzione della barriera emato-encefalica e persino il coma dopo TBI 3,11,12. Il modello WD prevede l’induzione di danni cerebrali colpendo la dura madre o il cranio con pesi che cadono liberamente. L’impatto di un oggetto ponderato su un cranio intatto può replicare lesioni miste focali/diffuse; Tuttavia, questo metodo è associato a scarsa precisione e ripetibilità del sito della lesione, lesioni da rimbalzo e un tasso di mortalità più elevato a causa di fratture del cranio 3,11,12. Il modello CCI prevede l’applicazione di metallo azionato ad aria per colpire direttamente la dura madre esposta. Rispetto al modello WD, il modello CCI è più accurato e riproducibile, ma non produce lesioni diffuse a causa del piccolo diametro della punta d’impatto11. Durante la modellazione FPI, il tessuto cerebrale viene brevemente spostato e deformato dalla percussione. L’FPI può indurre lesioni miste focali/diffuse e replicare l’emorragia intracranica, il gonfiore cerebrale e il danno progressivo della materia grigia dopo trauma cranico. Tuttavia, l’FPI ha un alto tasso di mortalità a causa del danno del tronco encefalico e dell’apnea prolungata 3,12. La craniotomia coinvolta nei modelli convenzionali di WD, CCI e FPI può portare a contusione corticale, lesioni emorragiche, danni alla barriera emato-encefalica, infiltrazione di cellule immunitarie, attivazione delle cellule gliali, tempo di modellazione prolungato e possibili esiti fatali 3,12.
Il trauma cranico lieve è caratterizzato da un punteggio GCS (Glasgow coma scale, GCS) compreso tra 13 e 152. Il trauma cranico lieve può essere focale o diffuso ed è associato sia a lesioni acute, come la rottura dell’omeostasi cellulare, l’eccitotossicità, la deplezione di glucosio, la disfunzione mitocondriale, il disturbo del flusso sanguigno e il danno assonale, sia a lesioni subacute, tra cui danno assonale, neuroinfiammazione e gliosi 2,3. Nonostante i progressi significativi nel delineare l’intricata fisiopatologia del trauma cranico, i meccanismi alla base del trauma cranico/rmTBI lieve rimangono sfuggenti e richiedono ulteriori indagini9. Dato che il CHI è il tipo più comune di TBI12, questo protocollo presenta un nuovo approccio alla creazione di un modello murino di rmTBI controllato in modo più preciso utilizzando un dispositivo FPI modificato per eseguire l’impatto in una finestra cranica assottigliata13. Evitando lesioni indotte dalla craniotomia, lo spessore variabile del cranio e le imprecisioni indotte dalla forma e le lesioni da rimbalzo, questo approccio mira a superare i principali svantaggi associati ai modelli WD, CCI e FPI. L’applicazione dell’impatto FPI sulla finestra del cranio assottigliato è utile per valutare il danno ai vasi cerebrali dopo rmTBI e aiuta a ridurre al minimo gli alti tassi di mortalità in alcuni modelli, risultando in una maggiore somiglianza con le caratteristiche cliniche dei pazienti con trauma cranico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il trauma cranico si riferisce a due tipi primari, chiusi e penetranti, con quest’ultimo caratterizzato da una rottura del cranio e della dura madre. I dati clinici suggeriscono che i CHI sono più diffusi delle lesioni penetranti 1,2. Dopo un singolo trauma cranico lieve, la maggior parte dei pazienti manifesta sintomi di PCS che in genere si risolvono in un breve periodo di tempo e c’è controversia riguardo alla percentuale di pazienti il cui PCS si sviluppa i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione per lo sviluppo sociale chiave del comune di Jinhua (n. 2020-3-071), dal programma di formazione per l’innovazione e l’imprenditorialità degli studenti dello Zhejiang College (n. S202310345087, S202310345088) e dal progetto del piano di attività per l’innovazione scientifica e tecnologica degli studenti dello Zhejiang Provincial College (2023R404044). Gli autori ringraziano la signorina Emma Ouyang (studentessa del primo anno della Johns Hopkins University, Bachelor of Science, Baltimora, USA) per la revisione linguistica dell’articolo.
Materials
| 75% ethanol | Shandong XieKang Medical Technology Co., Ltd. | 220502 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd | H12020272 | Solution, Analgesic |
| Carprofen | Shanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd | 53716-49-7 | Powder, Analgesic |
| Chlorhexidine digluconate | Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd. | 18472-51-0 | 19%-21% aqueous solution, Antimicrobial |
| Dental cement and solvent kit | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. | 20220405, 3# | Powder reconsituted in matching solvent |
| Dissecting microscope | Shenzhen RWD Life Science Inc. | 77019 | |
| Erythromycin ointment | Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd. | 220412 | Antibiotic |
| Fiber Optic Cold Light Source | Shenzhen RWD Life Science Inc. | F-150C | |
| Flat-tipped micro-drill bit | Shenzhen RWD Life Science Inc. | HM31008 | 2 mm, steel |
| FPI device software | Jiaxing Bocom Biotech Inc. | Biocom Animal Brain Impactor V1.0 | |
| ICR mice | Jinhua Laboratory Animal Center | Stock#2023091 | 25 Male mice, 25-30g, 8 weeks old |
| Isoflurane | Shandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd. | 2023090501 | |
| Isothermal heating pad | Wenzhou Repshop Pet Products Co., Ltd. | ||
| Luer Loc hup | Custom made using a 19G needle hub | ||
| Micro hand-held skull drill | Shenzhen RWD Life Science Inc. | 78001 | Max: 38,000rpm |
| Modified FPI device | Jiaxing Bocom Biotech Inc. | ||
| Morris water maze | Shenzhen RWD Life Science Inc. | 63031 | Evaluate mouse spatial learning and memory abilities |
| Open field | Shenzhen RWD Life Science Inc. | 63008 | Evaluate mouse locomoation and anxiety |
| Ophthalmic lubricant | Suzhou Tianlong Pharmaceutical Co., Ltd. | SC230724B | |
| Sodium diclofenac ointment | Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd. | 221207 | nonsteroidal anti-inflammatory drug |
| Small animal anesthesia system-Enhanced | Shenzhen RWD Life Science Inc. | R530IP | |
| Smart video-tracking system | Panlab Harvard Apparatus Inc., MA, USA | V3.0 | Animal tracking and analysis |
| Stereotactic frame | Shenzhen RWD Life Science Inc. | 68043 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M, St Paul, MN, USA | 202402AX | Suture the animal wound |
| Y maze | Shenzhen RWD Life Science Inc. | 63005 | Evaluate mouse spatial working memory |
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