Protein-Protein Etkileşimlerinde Görev Alan Potansiyel Olarak Çok Spesifik Peptit Bağlayıcı Alanların Amino Asit Tercihlerinin Hesaplamalı Tahmini

İki protein arasındaki etkileşim genellikle kısa amino asit segmentlerinin, protein-peptit arayüzlerine benzeyen peptit bağlama alanlarına bağlanmasını içerir. Bu tür protein-protein etkileşimlerinde (PPI) yer alan reseptör proteinleri, genellikle multispesifisite ^1,2 olarak bilinen bir özellik olan belirli bir örtüşen ancak farklı ligand dizileri setini tanıma yeteneğine sahiptir. Multispesifik tanıma, birçok hücresel proteinin bir özelliğidir, ancak enzimlerde ve hücre sinyal proteinlerinde özellikle dikkat çekicidir³. Multispesifik bağlanma bölgeleri ile etkileşime giren proteinler genellikle dizilimlerinde daha fazla ve daha az korunmuş bölgelerin bir kombinasyonuna sahiptir ^4,5,6. Bu senaryoda, daha fazla korunmuş dizi motifleri, sıkı moleküler etkileşimlerde yer alır. Tersine, daha değişken diziler, reseptör bağlanma bölgesindeki bir şekilde izin verilen yüzeylerle etkileşime girer. Genellikle, bu daha az korunmuş ancak yine de işlevsel olarak ilgili segmentler, tanımlanmış ikincil yapı modellerinden yoksun döngülerdir veya içsel olarak düzensiz proteinlerin tipik olanları gibi daha dinamik konformasyonlara sahiptir⁷.

Bağlanma bölgelerinin potansiyel peptit ligandlarının tanımlanması, genellikle karşılık gelen PPI’lere müdahale edebilen aracıların tasarımında ilk adımdır⁸. Bununla birlikte, çok spesifik bağlanma bölgelerinin ligandlarında çoğu dizi pozisyonunda en sık görülen tek bir amino asit kalıntısı bulmak genellikle olası değildir. Bunun yerine, bu bölgeler kimyasal özelliklerine göre belirli bir amino asit sınıfı için özel tercihlere sahip olabilir, örneğin aspartat veya glutamat gibi asidik ve negatif yüklü amino asitler, fenilalanin gibi hacimli aromatik amino asitler veya alifatik amino asitler alanin, valin, lösin veya izolösin gibi daha hidrofobik kalıntılar³. Yönlendirilmiş evrim⁹, çoklu kodon tarama mutajenez¹⁰ ve derin mutasyon taraması¹¹ dahil olmak üzere çeşitli deneysel yöntemler, protein bağlanma bölgelerinin amino asit tercihleri hakkında bilgi sağlayabilir. Bu yöntemlerin tümü, orijinal ligandlara mutasyonların eklenmesine ve bunların reseptör proteininin işlevi üzerindeki etkilerinin daha fazla analiz edilmesine dayanan dizi çeşitlendirmesi yaklaşımını takip eder (kapsamlı bir inceleme için Bratulic ve Badran^12’ye bakınız). Bununla birlikte, bu yöntemler genellikle büyük dizi kitaplıklarının araştırılmasını gerektirir ve bu da onları daha hantal, maliyetli ve zaman alıcı hale getirir.

Çok spesifik bağlanma bölgelerinin amino asit tercihlerini çıkarmak için kullanılan hesaplama yöntemleri, ıslak laboratuvar yöntemlerinin sınırlamalarını aşma potansiyeline sahiptir. Bunlar arasında, in silico dizi çeşitlendirme yaklaşımı, PPI^13’ün yapısal plastisitesini karakterize etmenin bir yolu olarak ligand dizisindeki çok çeşitli amino asit replasmanlarının enerjik etkisini değerlendirir. Bu yöntem, reseptör bağlanma bölgesine bağlı peptit ligandının yapısı veya modeli ile başlar ve daha sonra ligand dizisine mutasyonlar getirir. İstatistiksel ve enerji puanlama fonksiyonları daha sonra bu mutasyonların stabilite ve bağlanma afinitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılır. Değerlendirme aşamasından elde edilen en iyi skor ligand dizileri seti daha sonra amino asit tercihlerini hesaplamak için kullanılabilir. Bu strateji, çok yüksek sayıda ligand dizisini verimli bir şekilde işleme potansiyeline sahiptir. Bu nedenle, genellikle ıslak laboratuvar yaklaşımlarında işlenebilen daha sınırlı sayıda diziden hesaplananlara kıyasla amino asit tercihlerinin daha eksiksiz ve tutarlı bir çıkarımını sağlayabilir.

Rosetta moleküler modelleme paketi^14’ün Pepspec uygulaması, peptit tasarım modunun önemli bir adımı olarak dizi çeşitlendirmesini gerçekleştiren bir araçtır. Bu uygulama, sonraki adımlar için bir çapa olarak kullanılan, uzunluk olarak tek bir amino asit kalıntısına kadar bağlı bir peptit ile reseptör proteininin bir yapısını veya modelini gerektirir. Bağlı peptitin dizisi daha sonra genişletilir (gerekirse) ve çok sayıda varsayılan peptit ligandı oluşturmak için çeşitlendirilir. Bu peptitlerin bağlanma afinitesi daha sonra en iyi tahmin edilen bağlanma skorlarına sahip olanları seçmek için esnek omurga peptit yerleştirme ile değerlendirilir. Bu uygulamanın ana çıktısı, tasarım aşamasının sonunda seçilen en iyi peptit adayları olmasına rağmen, bu aşamada kabul edilen çok daha büyük peptit seti, hedef bağlanma bölgesinin amino asit tercihlerini hesaplamak için de kullanılabilir. Amino asit tercihleri, bir konum ağırlık matrisi (PWM) veya daha görsel bir dizi logosu olarak temsil edilen ligand dizisinin konumu başına her bir amino asit kalıntısının frekansı olarak hesaplanır.

Bu makalede, bir PPI’da yer alan bir reseptör proteininin bağlanma yüzeyinin amino asit tercihlerini tahmin etmek için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, protein-ligandın doğrusal bir segmentinin reseptör proteinine bağlandığı bilinen PPI’lara odaklanmıştır, bu nedenle senaryo bir protein-peptit arayüzü olarak modellenebilir. Bu senaryoda, liganddan korunan motifler tipik olarak reseptör bağlanma bölgesindeki tanımlanmış ceplerle etkileşime girer, ancak PPI’da yer alan tüm ligand segmenti daha az korunmuş bölgeler içerebilir. Protokolün ana adımlarını özetleyen bir akış şeması Şekil 1’de gösterilmektedir. Protokol, protein-protein kompleksinin 3D yapısı ile başlar ve ligand proteinini potansiyel olarak en iyi etkileşime giren segmente indirgeyerek reseptör proteinini sağlam bırakır. En iyi etkileşime giren segment, etkileşen iki protein arasındaki sıcak nokta kalıntılarını tanımlamak için hesaplamalı alanin tarama mutajenezi gerçekleştiren BUDE Alanin Tarama sunucusu¹⁵ kullanılarak çıkarılır. Bu yaklaşımda, liganddan gelen kalıntılar ayrı ayrı alanin ile değiştirilir ve daha sonra serbest enerjideki veya kompleksin stabilitesindeki (ΔΔG) tahmini değişiklik, hedef PPI için karşılık gelen kalıntının alaka düzeyini çıkarmak için kullanılır. En iyi etkileşime giren segment çıkarıldıktan sonra, reseptör proteini ile olan kompleksi, dizi çeşitlendirmesini gerçekleştirmek için Pepspec’e gönderilen baz yapı olarak kullanılır.

Şekil 1: Bu çalışmada önerilen protokolün ana adımlarına genel bakış. Sayılar, protokol bölümündeki adım numaralarıyla eşleşir. Metinde anlatılan örnek olarak kullanılan protein-protein kompleksi ile figürler yapılmıştır. Bu komplekste, reseptör olarak kabul edilen protein zinciri pembe renkle gösterilirken, ligand olarak kabul edilen zincir açık mavi renkle gösterilir ve tahmin edilen en iyi etkileşime giren segmenti kırmızı renkle vurgulanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Önerilen protokolün sınırlamalarından biri, protein-peptit arayüzünün çözülmüş bir yapısı için gerekliliktir. Protokol alternatif olarak hedef protein-peptit arayüzünün bir modeli ile başlayabilir, ancak spesifik modelleme adımları burada açıklanmamıştır. Ayrıca, protokol herhangi bir işletim sistemini çalıştıran kişisel bir bilgisayarda yürütülebilse de, Rosetta uygulamalarını içeren adımlar için bir Linux ortamı gereklidir. Genellikle Pepspec tarafından gerçekleştirilen çok sayıda yineleme nedeniyle dizi çeşitlendirme adımı için bir bilgisayar kümesi de şiddetle tavsiye edilir.

Önerilen protokolün uygulanması, insan interferon düzenleyici faktör (IRF) ailesinin bir üyesi olan IRF5’in teklif yüzeyinin amino asit tercihlerinin tahmini ile gösterilmiştir. Bu proteini örnek olarak seçtik, çünkü aktivasyonu sırasında iki alt birim, yapısı iyi karakterize edilmiş bir dimer oluşturmak üzere bağlanır¹⁶. IRF dimerlerinde bağlanma, bir alt birimin bağlanma yüzeyini sağladığı ve diğerinin pLxIS^17,18 adı verilen kısa korunmuş bir motif içeren bir bölge aracılığıyla etkileşime girdiği bir protein-peptit arayüzü olarak modellenebilir. Ek olarak, IRF alt birimlerine bağlanma çok spesifiktir; bu nedenle, koaktivatörler¹⁸ olarak bilinen diğer hücresel proteinlerle homodimerler, heterodimerler ve kompleksler oluşturabilirler.