التنبؤ الحسابي لتفضيلات الأحماض الأمينية لمجالات ربط الببتيد متعددة الأنواع المحتملة المشاركة في تفاعلات البروتين والبروتين
Summary
وصفنا منهجية تعتمد على تنويع التسلسل لتقدير تفضيلات الأحماض الأمينية لمواقع الارتباط متعددة الأنواع في تفاعلات البروتين والبروتين (PPIs). في هذه الاستراتيجية ، يتم إنشاء الآلاف من روابط الببتيد المحتملة وفحصها في السيليكو ، وبالتالي التغلب على بعض القيود المفروضة على الطرق التجريبية المتاحة.
Abstract
تتضمن العديد من تفاعلات البروتين والبروتين ارتباط شرائح البروتين القصيرة بمجالات ربط الببتيد. عادة ، تتطلب مثل هذه التفاعلات التعرف على الزخارف الخطية مع الحفظ المتغير. غالبا ما يساهم الجمع بين المناطق المحفوظة للغاية والأكثر تنوعا في نفس الروابط في تعدد أنواع الارتباط ، وهي خاصية مشتركة للإنزيمات وبروتينات إشارات الخلايا. يعد توصيف تفضيلات الأحماض الأمينية لمجالات ربط الببتيد أمرا مهما لتصميم وسطاء تفاعلات البروتين والبروتين (PPIs). تعد الطرق الحسابية بديلا فعالا للتقنيات التجريبية المكلفة والمرهقة في كثير من الأحيان ، مما يتيح تصميم وسطاء محتملين يمكن التحقق من صحتها لاحقا في التجارب النهائية. هنا ، وصفنا منهجية باستخدام تطبيق Pepspec لحزمة النمذجة الجزيئية Rosetta للتنبؤ بتفضيلات الأحماض الأمينية لمجالات ربط الببتيد. هذه المنهجية مفيدة عندما تكون بنية بروتين المستقبل وطبيعة ليجند الببتيد معروفة أو يمكن الاستدلال عليها. تبدأ المنهجية بمرساة مميزة جيدا من الليجند ، والتي يتم تمديدها عن طريق إضافة بقايا الأحماض الأمينية بشكل عشوائي. ثم يتم تقييم تقارب الربط للببتيدات المتولدة بهذه الطريقة عن طريق إرساء الببتيد العمود الفقري المرن من أجل اختيار الببتيدات ذات أفضل درجات الربط المتوقعة. ثم تستخدم هذه الببتيدات لحساب تفضيلات الأحماض الأمينية ولحساب مصفوفة وزن الموضع (PWM) التي يمكن استخدامها في مزيد من الدراسات اختياريا. لتوضيح تطبيق هذه المنهجية ، استخدمنا التفاعل بين الوحدات الفرعية للعامل التنظيمي للإنترفيرون البشري 5 (IRF5) ، المعروف سابقا بأنه متعدد الأنواع ولكنه يسترشد عالميا بفكرة قصيرة محفوظة تسمى pLxIS. كانت تفضيلات الأحماض الأمينية المقدرة متوافقة مع المعرفة السابقة حول سطح ربط IRF5. أظهرت المواضع التي تشغلها بقايا سيرين القابلة للفسفورية تواترا عاليا من الأسبارتات والغلوتامات ، على الأرجح لأن سلاسلها الجانبية سالبة الشحنة تشبه الفوسفوسيرين.
Introduction
غالبا ما يتضمن التفاعل بين بروتينين ربط أجزاء قصيرة من الأحماض الأمينية بمجالات ربط الببتيد ، تشبه واجهات البروتين والببتيد. غالبا ما تتمتع بروتينات المستقبلات المشاركة في مثل هذه التفاعلات بين البروتين والبروتين (PPI) بالقدرة على التعرف على مجموعة معينة من تسلسلات الرباط المتداخلة ولكن المتباينة ، وهي خاصية تعرف باسم تعدد الأنواع 1,2. يعد التعرف متعدد الأنواع سمة من سمات العديد من البروتينات الخلوية ، ولكنه ملحوظ بشكل خاص في الإنزيمات وبروتينات إشارات الخلية3. غالبا ما تحتوي البروتينات التي تتفاعل مع مواقع الارتباط متعددة الأنواع على مزيج من المناطق المحفوظة أكثر وأقل في تسلسلها4،5،6. في هذا السيناريو ، تشارك أشكال التسلسل الأكثر حفظا في التفاعلات الجزيئية الصارمة. على العكس من ذلك ، تتفاعل التسلسلات الأكثر تنوعا مع الأسطح المتساهلة بطريقة ما في موقع ربط المستقبلات. عادة ما تكون هذه الأجزاء الأقل حفظا ولكنها لا تزال ذات صلة وظيفية عبارة عن حلقات تفتقر إلى أنماط بنية ثانوية محددة أو لها تطابقات أكثر ديناميكية ، مثل تلك النموذجية للبروتينات المضطربة جوهريا7.
عادة ما يكون تحديد روابط الببتيد المحتملة لمواقع الربط هو الخطوة الأولى في تصميم الوسطاء القادرين على التدخل في PPIsالمقابلة 8. ومع ذلك ، فمن غير المحتمل في كثير من الأحيان العثور على بقايا واحدة من الأحماض الأمينية الأكثر شيوعا في معظم مواضع التسلسل في روابط مواقع الارتباط متعددة الأنواع. بدلا من ذلك ، قد يكون لهذه المواقع تفضيلات خاصة لفئة معينة من الأحماض الأمينية وفقا لخصائصها الكيميائية ، على سبيل المثال ، الأحماض الأمينية الحمضية وسالبة الشحنة مثل الأسبارتات أو الغلوتامات ، والأحماض الأمينية العطرية الضخمة مثل الفينيل ألانين أو المزيد من المخلفات الكارهة للماء مثل الأحماض الأمينية الأليفاتية ألانين ، فالين ، ليوسين أو إيزولوسين3. يمكن أن توفر العديد من الطرق التجريبية رؤى حول تفضيلات الأحماض الأمينية لمواقع ربط البروتين ، بما في ذلك التطور الموجه9 ، ومطفرات المسح متعدد الكودون10 ، والمسح الطفري العميق11. تتبع كل هذه الطرق نهج تنويع التسلسل ، والذي يعتمد على إدخال طفرات إلى الروابط الأصلية وتحليل تأثيرها على وظيفة بروتين المستقبل (انظر Bratulic and Badran12 للحصول على مراجعة شاملة). ومع ذلك ، غالبا ما تتطلب هذه الطرق مسح مكتبات التسلسل الكبيرة ، مما يجعلها أكثر تعقيدا وتكلفة وتستغرق وقتا طويلا.
الطرق الحسابية لاستنتاج تفضيلات الأحماض الأمينية لمواقع الربط متعددة الأنواع لديها القدرة على التحايل على قيود طرق المختبر الرطب. من بين هؤلاء ، يقوم نهج تنويع تسلسل السيليكو بتقييم التأثير النشط لمجموعة واسعة من بدائل الأحماض الأمينية في تسلسل الليجند كطريقة لتوصيف اللدونة الهيكلية ل PPI13. تبدأ هذه الطريقة ببنية أو نموذج ليجند الببتيد المرتبط بموقع ارتباط المستقبلات ، ثم تدخل طفرات إلى تسلسل الليجند. ثم يتم استخدام الوظائف الإحصائية وتسجيل الطاقة لتقييم تأثير هذه الطفرات على الاستقرار وتقارب الارتباط. يمكن بعد ذلك استخدام مجموعة تسلسلات الرباط الأفضل تسجيلا الناتجة عن مرحلة التقييم لحساب تفضيلات الأحماض الأمينية. هذه الاستراتيجية لديها القدرة على معالجة عدد كبير جدا من تسلسلات الليجند بطريقة فعالة. لذلك ، يمكن أن يوفر استدلالا أكثر اكتمالا واتساقا لتفضيلات الأحماض الأمينية مقارنة بتلك المحسوبة من العدد المحدود من التسلسلات التي يمكن معالجتها عادة في مناهج المختبر الرطب.
تطبيق Pepspec لمجموعة النمذجة الجزيئيةRosetta 14 هو أداة تقوم بتنويع التسلسل كخطوة أساسية في وضع تصميم الببتيد. يتطلب هذا التطبيق بنية أو نموذجا لبروتين المستقبل مع ببتيد مرتبط وصولا إلى بقايا حمض أميني واحد في الطول ، والذي يستخدم كمرساة للخطوات التالية. ثم يتم تمديد تسلسل الببتيد المرتبط (إذا لزم الأمر) وتنويعها لتوليد عدد كبير من روابط الببتيد المفترضة. ثم يتم تقييم تقارب الربط لهذه الببتيدات عن طريق إرساء الببتيد العمود الفقري المرن من أجل اختيار تلك التي لديها أفضل درجات الربط المتوقعة. على الرغم من أن الناتج الرئيسي لهذا التطبيق هو أفضل الببتيدات المرشحة المختارة في نهاية مرحلة التصميم ، إلا أنه يمكن أيضا استخدام مجموعة أكبر بكثير من الببتيدات المقبولة خلال هذه المرحلة لحساب تفضيلات الأحماض الأمينية لموقع الربط المستهدف. يتم حساب تفضيلات الأحماض الأمينية على أنها تكرار كل بقايا من الأحماض الأمينية لكل موضع من تسلسل الربيطة ممثلة إما كمصفوفة وزن موضع (PWM) أو كشعار تسلسل مرئي أكثر.
في هذه المقالة ، نصف بروتوكولا لتقدير تفضيلات الأحماض الأمينية لسطح الارتباط لبروتين مستقبلات تشارك في PPI. يركز البروتوكول على PPIs التي يعرف فيها أن الجزء الخطي من بروتين ligand يرتبط ببروتين المستقبل ، لذلك يمكن نمذجة السيناريو كواجهة بروتين-ببتيد. في هذا السيناريو ، تتفاعل الزخارف المحفوظة من الربيطة عادة مع جيوب محددة في موقع ربط المستقبلات ، على الرغم من أن جزء الربيطة بأكمله المتضمن في PPI قد يحتوي على مناطق أقل حفظا. يظهر مخطط انسيابي يلخص الخطوات الرئيسية للبروتوكول في الشكل 1. يبدأ البروتوكول بهيكل 3D لمركب البروتين البروتيني ويقلل من بروتين الليجند إلى الجزء المحتمل الأفضل تفاعلا ، تاركا بروتين المستقبل سليما. يتم الاستدلال على الجزء الأفضل تفاعلا باستخدام خادم BUDE Alanine Scan15 ، الذي يجري طفرات مسح ألانين الحسابية لتحديد بقايا النقاط الساخنة بين البروتينين المتفاعلين. في هذا النهج ، يتم استبدال المخلفات من الربيطة بشكل فردي بالألانين ، ثم يتم استخدام التغير المقدر في الطاقة الحرة أو استقرار المجمع (ΔΔG) لاستنتاج أهمية البقايا المقابلة لمؤشر أسعار المنتجين المستهدف. بمجرد استنتاج الجزء الأفضل تفاعلا ، يتم استخدام معقده مع بروتين المستقبل كهيكل أساسي مقدم إلى Pepspec لإجراء تنويع التسلسل.
الشكل 1: نظرة عامة على الخطوات الرئيسية للبروتوكول المقترح في هذا العمل. تتطابق الأرقام مع أرقام الخطوات في قسم البروتوكول. تم عمل الأرقام باستخدام مركب البروتين والبروتين المستخدم كمثال موصوف في النص. في هذا المركب ، تظهر سلسلة البروتين التي تعتبر مستقبلات باللون الوردي ، بينما تظهر السلسلة التي تعتبر بمثابة الرباط باللون الأزرق الفاتح مع تمييز الجزء الأفضل تفاعلا المتوقع باللون الأحمر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
أحد قيود البروتوكول المقترح هو شرط وجود بنية تم حلها لواجهة البروتين والببتيد. قد يبدأ البروتوكول بدلا من ذلك بنموذج لواجهة البروتين والببتيد المستهدفة ، على الرغم من أن خطوات النمذجة المحددة غير موصوفة هنا. علاوة على ذلك ، على الرغم من أنه يمكن إجراء البروتوكول على جهاز كمبيوتر شخصي يعمل بأي نظام تشغيل ، إلا أن بيئة Linux مطلوبة للخطوات التي تتضمن تطبيقات Rosetta. يوصى بشدة أيضا باستخدام مجموعة الكمبيوتر لخطوة تنويع التسلسل نظرا للعدد الكبير من التكرارات التي تقوم بها Pepspec عادة.
يتم توضيح تطبيق البروتوكول المقترح من خلال تقدير تفضيلات الأحماض الأمينية لسطح العطاءات ل IRF5 ، وهو عضو في عائلة العامل التنظيمي للإنترفيرون البشري (IRF). اخترنا هذا البروتين كمثال لأنه أثناء تنشيطه ، ترتبط وحدتان فرعيتان لتكوين دايمر يتميز هيكله جيدا16. في ثنائيات IRF ، يمكن نمذجة الربط كواجهة بروتينية بروتينية توفر فيها وحدة فرعية سطح الربط وتتفاعل الوحدة الأخرى عبر منطقة تحتوي على شكل قصير محفوظ يسمى pLxIS17,18. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الارتباط بالوحدات الفرعية IRF متعدد الأنواع ؛ لذلك ، يمكن أن تشكل متجانسات ، متغايرة ، ومعقدات مع البروتينات الخلوية الأخرى المعروفة باسم المنشطات18.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه المقالة بروتوكولا لتقدير تفضيلات الأحماض الأمينية لمواقع الربط متعددة الأنواع المحتملة بناء على تنويع تسلسل السيليكو. تم تطوير عدد قليل من الأدوات الحسابية لتقدير تفضيلات الأحماض الأمينية لواجهات البروتين والببتيد14،25،<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونعرب عن امتناننا للدعم المالي المقدم من النظام الوطني للبحوث (SNI) (أرقام المنح SNI-043-2023 و SNI-170-2021) والأمانة الوطنية للعلوم والتكنولوجيا والابتكار (SENACYT) في بنما ومعهد البحث والتحسين في إعادة تمثيل الإنسان (IFARHU). يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور ميغيل رودريغيز على مراجعة المخطوطة بعناية.
Materials
| BUDE Alanine Scan Server | University of Edinburgh | https://pragmaticproteindesign.bio.ed.ac.uk/balas/ | doi: 10.1021/acschembio.9b00560 |
| Rosetta Modeling Software | Rosetta Commons | https://www.rosettacommons.org/software | doi: 10.1002/prot.22851 |
| UCSF Chimera | University of California San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | doi: 10.1002/jcc.20084 |
References
- Kim, P. M., Lu, L. J., Xia, Y., Gerstein, M. B. Relating three-dimensional structures to protein networks provides evolutionary insights. Science. 314 (5807), 1938-1941 (2006).
- Schreiber, G., Keating, A. E. Protein binding specificity versus promiscuity. Current Opinion in Structural Biology. 21 (1), 50-61 (2011).
- Erijman, A., Aizner, Y., Shifman, J. M. Multispecific recognition: Mechanism, evolution, and design. Biochemistry. 50 (5), 602-611 (2011).
- Fromer, M., Shifman, J. M. Tradeoff between stability and multispecificity in the design of promiscuous proteins. PLoS Computational Biology. 5 (12), e1000627 (2009).
- Xie, T., Zmyslowski, A. M., Zhang, Y., Radhakrishnan, I. Structural basis for multispecificity of MRG domains. Structure. 23 (6), 1049-1057 (2015).
- Hendler, A., et al. Human SIRT1 multispecificity is modulated by active-site vicinity substitutions during natural evolution. Molecular Biology and Evolution. 38 (2), 545-556 (2021).
- Teilum, K., Olsen, J. G., Kragelund, B. B. On the specificity of protein-protein interactions in the context of disorder. The Biochemical Journal. 478 (11), 2035-2050 (2021).
- Pelay-Gimeno, M., Glas, A., Koch, O., Grossmann, T. N. Structure-based design of inhibitors of protein-protein interactions: Mimicking peptide binding epitopes. Angewandte Chemie (International ed. in English). 54 (31), 8896-8927 (2015).
- Wang, Y., Xue, P., Cao, M., Yu, T., Lane, S. T., Zhao, H. Directed evolution: Methodologies and applications. Chemical Reviews. 121 (20), 12384-12444 (2021).
- Liu, J., Cropp, T. A. Rational protein sequence diversification by multi-codon scanning mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 978, 217-228 (2013).
- Wei, H., Li, X. Deep mutational scanning: A versatile tool in systematically mapping genotypes to phenotypes. Frontiers in Genetics. 14, 1087267 (2023).
- Bratulic, S., Badran, A. H. Modern methods for laboratory diversification of biomolecules. Current Opinion in Chemical Biology. 41, 50-60 (2017).
- Humphris, E. L., Kortemme, T. Prediction of protein-protein interface sequence diversity using flexible backbone computational protein design. Structure. 16 (12), 1777-1788 (2008).
- King, C. A., Bradley, P. Structure-based prediction of protein-peptide specificity in Rosetta. Proteins. 78 (16), 3437-3449 (2010).
- Ibarra, A. A., et al. Predicting and experimentally validating hot-spot residues at protein-protein interfaces. ACS Chemical Biology. 14 (10), 2252-2263 (2019).
- Chen, W., Srinath, H., Lam, S. S., Schiffer, C. A., Royer, W. E., Lin, K. Contribution of Ser386 and Ser396 to activation of interferon regulatory factor 3. Journal of Molecular Biology. 379 (2), 251-260 (2008).
- Mancino, A., Natoli, G. Specificity and function of IRF family transcription factors: Insights from genomics. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36 (7), 462-469 (2016).
- Schwanke, H., Stempel, M., Brinkmann, M. M. Of keeping and tipping the balance: Host regulation and viral modulation of IRF3-dependent IFNB1 expression. Viruses. 12 (7), 33 (2020).
- Chen, W., et al. Insights into interferon regulatory factor activation from the crystal structure of dimeric IRF5. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (11), 1213-1220 (2008).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25, 1605-1612 (2004).
- Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. -. M., Brenner, S. E. WebLogo: a sequence logo generator. Genome Research. 14 (6), 1188-1190 (2004).
- Panne, D., McWhirter, S. M., Maniatis, T., Harrison, S. C. Interferon regulatory factor 3 is regulated by a dual phosphorylation-dependent switch. The Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22816-22822 (2007).
- Weihrauch, D., et al. An IRF5 decoy peptide reduces myocardial inflammation and fibrosis and improves endothelial cell function in tight-skin mice. PloS One. 11 (4), e0151999 (2016).
- Mori, M., Yoneyama, M., Ito, T., Takahashi, K., Inagaki, F., Fujita, T. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. The Journal of Biological Chemistry. 279 (11), 9698-9702 (2004).
- Smith, C. A., Kortemme, T. Predicting the tolerated sequences for proteins and protein interfaces using RosettaBackrub flexible backbone design. PloS One. 6 (7), e20451 (2011).
- Rubenstein, A. B., Pethe, M. A., Khare, S. D. MFPred: Rapid and accurate prediction of protein-peptide recognition multispecificity using self-consistent mean field theory. PLoS Computational Biology. 13 (6), e1005614 (2017).
