Cuantificación de Acanthamoeba spp. Motilidad
Summary
Este procedimiento describe cómo visualizar, rastrear y cuantificar Acanthamoeba spp. motilidad.
Abstract
La queratitis por Acanthamoeba es una infección ocular grave que plantea desafíos para el tratamiento y puede provocar ceguera. A pesar de su ubicuidad y la posible contaminación de las lentes de contacto después de la exposición al agua, el comportamiento natural de este patógeno sigue siendo difícil de alcanzar. Comprender los patrones de movimiento de Acanthamoeba puede informarnos sobre cómo coloniza las lentes de contacto y contamina la córnea del paciente. Es una suerte que Acanthamoeba spp. son visibles a través de microscopía de campo claro a partir de un aumento de 4x. Se han desarrollado técnicas previas para cuantificar la motilidad de Acanthamoeba en relación con los efectos citopáticos o la subexposición al campo eléctrico. Aquí, describimos un método para rastrear y cuantificar Acanthamoeba spp. Motilidad a largo plazo (horas a días), que es un protocolo aplicable a múltiples cepas de amebas, superficies y estado nutricional de la ameba. Este procedimiento es pertinente para determinar muchas cuantificaciones de la motilidad central, como la distancia, la velocidad, el confinamiento y la direccionalidad, que son necesarias para monitorear diferentes etapas de infección, proliferación o cambio de comportamiento.
Introduction
La investigación sobre Acanthamoeba ha aumentado drásticamente en los últimos años debido al aumento de la prevalencia de la queratitis por Acanthamoeba (AK), que es una infección parasitaria que sigue a la unión de Acanthamoeba a la córnea1. Si bien los brotes de QA pueden atribuirse a un cuidado inadecuado de las lentes de contacto o a soluciones ineficaces para el cuidado de las lentes de contacto 2,3,4,5, actualmente no existen requisitos para demostrar la eficacia de la desinfección de Acanthamoeba para ningún producto en el mercado. Sin embargo, existe un esfuerzo continuo en la comunidad científica y dentro de las organizaciones de normalización para examinar los protocolos necesarios para cuantificar la eficacia de la desinfección de los productos para el cuidado de las lentes de contacto 6,7. Además, debido a su semejanza en aspectos celulares y funcionales con los macrófagos humanos, se ha observado que Acanthamoeba tiene un papel importante en el alojamiento y la diseminación de otros patógenos humanos8, además de la patogenicidad que aporta la ameba en sí.
Se han descrito técnicas recientes que han sido capaces de cuantificar la motilidad de Acanthamoeba – que generalmente no está muy sujeta al movimiento browniano 9,10 – en lo que respecta a los efectos citopáticos o la subexposición al campo eléctrico 9,11, así como los avances en el análisis de la motilidad en la investigación de virus gigantes utilizando Acanthamoeba como vector viral rastreable 12, 13 de la Constitución. En los últimos 20 años también se han producido mejoras constantes y significativas en el seguimiento de células y partículas utilizando nuevos programas informáticos, como el software de imagen utilizado aquí, y nuevos algoritmos y tecnologías de aprendizaje profundo14. Sin embargo, este es un campo relativamente nuevo y creciente de la ciencia con respecto a la investigación de laboratorio, la aplicación clínica y los estándares industriales, y ha habido una escasez de datos publicados sobre los métodos para visualizar y rastrear esta ameba, particularmente para cuantificar los cambios de comportamiento después de la adherencia a las lentes de contacto o durante o después de la desinfección de las lentes de contacto. Otros campos que se expanden hacia el monitoreo visual a largo plazo han apoyado este esfuerzo 15,16,17. Debido a la naturaleza inherentemente desafiante de Acanthamoeba, que incluye una resistencia general a los plásmidos (que podrían conferir fluorescencia), la capacidad de la ameba para consumir y destruir tintes celulares estándar y una composición de proteína externa única, lo que dificulta el etiquetado de anticuerpos, los métodos disponibles para otras células que los hacen visibles en entornos distintos a las imágenes de campo claro han sido inutilizables en este organismo. Por lo tanto, la cuantificación de la motilidad de esta ameba ha demostrado una adición significativa al campo. Utilizando el método aquí descrito, hemos podido determinar que las amebas permanecen móviles durante al menos 12 h sin nutrientes18 y que las amebas que se enfrentan a un proceso de desinfección y cesan su motilidad durante la desinfección pueden recuperar su motilidad después de la desinfección si no están completamente lisadas19.
Este protocolo detalla cómo rastrear visualmente y cuantificar la motilidad de la ameba microscópicamente. Los pasos principales son grabar amebas en campo claro utilizando el enfoque y el tiempo adecuados entre imágenes, transformar las imágenes en binarias utilizando un software de imágenes y, a continuación, utilizar el complemento de seguimiento de un software de imágenes para establecer los parámetros experimentales y seguir a cada ameba para determinar las mediciones necesarias, como la velocidad, la distancia y el confinamiento. A continuación, es posible cuantificar la quimiotaxis de una ameba o de una población de amebas para definir la direccionalidad. La contribución clave de este método es visualizar y cuantificar el comportamiento de las amebas durante diferentes estados de soporte nutricional, adherencia a la superficie, desafío de desinfección u otras alteraciones ambientales como la cohabitación con el cultivo de células de mamíferos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ser capaz de rastrear y cuantificar la motilidad de amebas como Acanthamoeba, que son organismos microscópicos adherentes que no se ven afectados por el movimiento browniano de baja velocidad 9,10, revela una cantidad sustancial de información sobre el comportamiento de las amebas y puede mejorar en gran medida el esclarecimiento sobre los métodos de prevención de la AK. Este protocolo ha sido detallado en publicaciones recientes, y los datos han sido confirmados o combinados con otros análisis de datos similares 18,19. Observamos aquí que la velocidad de la ameba detallada utilizando este método es similar a lo que ha sido publicado por otros grupos. Este protocolo es notable por su capacidad para usarse básicamente en cualquier superficie o tratamiento de ameba, que es transparente a la luz, pero es importante tener en cuenta que, si bien este protocolo podría modificarse para funcionar con otros organismos, hasta ahora solo se ha optimizado para Acanthamoeba. El protocolo anterior siempre ha funcionado bien en el laboratorio, pero se proporcionan las siguientes modificaciones para cambiar el método para adaptarlo a otras necesidades o solucionar situaciones difíciles.
Determinación de los parámetros de seguimiento: En el protocolo anterior, se han enumerado la vinculación de fotograma a fotograma, el cierre de la brecha, la brecha máxima de fotograma y el número de puntos en la pista, que fueron los más aplicables para las publicaciones recientes. Sin embargo, es posible que otros parámetros sean más adecuados para otras necesidades. Además, puede haber parámetros que a otros les gustaría usar pero que no se usaron aquí (como la distancia máxima de una pista en los filtros de pista). Se puede acceder a más información sobre cada parámetro y lo que describen aquí en el sitio web (ver referencia21). Al decidir qué parámetros y filtros son más relevantes para otros experimentos y cómo deben establecerse, piense en lo que es estadísticamente racional para un proyecto específico; Por ejemplo, ¿querría uno datos de una ameba que se aleja y luego regresa al campo de visión? ¿O querría uno conservar los datos de una ameba que no se movió mucho pero que aún así fue etiquetada como una huella? y lo que tiene sentido para el número de fotogramas y el tiempo entre fotogramas en el que se grabaron las imágenes.
Cambiar el tamaño de la mancha: Descubrimos que es extremadamente difícil con cualquier software o configuración de microscopio, basada en las tecnologías actuales y el software disponible para los laboratorios estándar, rastrear con precisión el número de amebas en un agregado a medida que cambia con el tiempo. Si realiza un seguimiento del tamaño de una mancha y trata de correlacionar ese tamaño con el número de organismos que contiene, utilice una curva estándar generada después de experimentos repetidos para predecir matemáticamente el tamaño de un agregado. Por ejemplo, los agregados se crearon sembrando pozos con un rango de números de ameba, como 8, 16, 32, 125, 250, 500, 1,000 y 2,000 células por pocillo. Se generaron imágenes timelapse en varios puntos temporales de cada pozo durante 24 h. Cada esferoide (que era de un número conocido de amebas) se analizó para un área bidimensional, y se generó una curva estándar en función del recuento de amebas frente al tamaño del esferoide a lo largo del tiempo. Este experimento se repitió al menos por triplicado para obtener una desviación estándar adecuada de cualquier curva generada.
Determinación de la direccionalidad de la ameba: Si bien esto puede no ser necesario para estudios particulares, puede ser útil comprender la direccionalidad de la ameba. Esto proporcionaría datos sobre los efectos quimiotácticos del tratamiento o experimento. Estos datos también se pueden utilizar para crear datos visuales (gráficos) y cuantitativos. Esto está disponible a través de Chemotaxis and Migration Tool, que es un complemento gratuito para software de imágenes. Está disponible en el sitio web junto con la guía de aplicación y muestras de imágenes y películas (ver Tabla de Materiales).
Dinámica de movimiento detallada: otros grupos han examinado la dinámica de propagación y las trayectorias difusivas con análisis estadísticos muy avanzados y desarrollados más allá de lo que aquí se discute 9,10,22. Estos podrían considerarse en función de las necesidades del usuario.
Al igual que con cualquier método exitoso, el protocolo detallado en este manuscrito ha pasado por muchas rondas de solución de problemas para lograr la consistencia. Si bien se pueden hacer excelentes videos rastreables de alta calidad tomando una imagen cada segundo (o tan rápido como lo pueda el microscopio, podría ser menos de un segundo), esto crea archivos extremadamente grandes, con los que puede ser difícil trabajar. Esto solo es adecuado de manera realista para videos a muy corto plazo grabados durante un máximo de unos minutos. Por el contrario, al tomar una imagen cada pocos segundos, hemos descubierto que el comportamiento de las amebas sigue siendo muy rastreable en función de la velocidad de esta especie, y es posible crear videos viables durante horas o días. Hemos descubierto que la cantidad máxima de tiempo entre imágenes es de 30 s, que es el tiempo que se requiere para que el software de imágenes rastree con precisión las amebas. El intervalo de tiempo que elija el usuario debe considerarse utilizando las restricciones conocidas de la rapidez con la que el microscopio puede registrar imágenes, cuántas imágenes por pocillo se necesitan y cuántos pocillos se registran en cada intervalo. Del mismo modo, los parámetros mencionados en este protocolo con respecto al desplazamiento máximo, los espacios de fotogramas permitidos, los fotogramas mínimos necesarios, etc., han sido determinados a través de prueba y error por este laboratorio para crear información de pista que incluye las pistas de ameba más completas e ignora el ruido creado por pistas incompletas, amebas que se unen o abandonan el escenario a mitad de video, o errores creados por la confusión del software de imágenes, como cuando dos amebas se encuentran a mitad de la pista y luego se separan. Este tipo de errores y pistas incompletas son comprensiblemente altas cuando se crean videos extremadamente largos (horas o días) de organismos biológicos microscópicos que interactúan constantemente entre sí y son la razón por la que una gran parte de las pistas erróneas deben ser rechazadas. Cabe señalar que el paso de llenado de agujeros en el protocolo es, según la experiencia de este laboratorio, importante para reducir el error en la forma en que el software de imágenes rastrea la ameba. Al asegurarse de que cada ameba sea un círculo sólido en lugar de, a veces, una rosquilla o una forma de c, es mucho más probable que el software pueda rastrear cada ameba con éxito.
Además, como se ha comentado, hay muchos parámetros disponibles para un usuario para analizar una imagen o un vídeo. Basándonos en las necesidades experimentales, nos hemos beneficiado sistemáticamente al máximo del análisis de la distancia total, la distancia máxima, la velocidad y el desplazamiento. Estos se discuten en profundidad (incluyendo el uso de diferentes deformaciones y superficies) con interpretaciones gráficas en publicaciones anteriores18,19. Estos cuatro parámetros permiten al usuario extrapolar la capacidad de una ameba para recorrer distancias lineales y el tiempo que tarda en hacerlo, lo que ayuda a comprender su comportamiento en relación con la contaminación de las lentes de contacto. Recuperar y analizar estos parámetros es un trabajo de gran envergadura, como se detalla en nuestras figuras. Al trabajar con hojas de cálculo grandes y numerosas de la salida del software de imágenes, limitamos los errores involuntarios mediante la creación de plantillas de hojas de cálculo bloqueadas que calcularon automáticamente todos los análisis requeridos. Sin embargo, una posible mejora de este método sería escribir un script que pueda manejar estos datos y ordenarlos y analizarlos.
En conclusión, aquí se describe un método accesible y preciso para medir el tamaño y la motilidad de Acanthamoeba en muchas condiciones diferentes. Hemos demostrado que este método se puede aplicar a muchas cepas diferentes de ameba y hemos señalado que, si bien puede haber parámetros sencillos para obtener información sobre la motilidad, esta configuración experimental puede adaptarse en gran medida a cualquier necesidad específica.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por Alcon Research, LLC.
Materials
| ¼ Ringer’s solution | ThermoFisher Scientific | BR0052G | Oxoid Ringers Solution Tablets. Follow directions to make one-quarter strength instead of full strength Ringers. |
| 10 µL pipette | Eppendorf Research | 3123000039 | 2 µL-20 µL single channel |
| 10 µL pipette tips | Neptune Scientific, San Diego, CA, USA | BT10.N | 10 µL Universal Barrier Tip |
| 48 well plate | Millipore Sigma, | CLS3548 | Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid |
| 50 mL conical tubes (1 for each sample, 1 for each pass 2 sample) | Fisher Scientific | Falcon 352098 | Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge Tubes, polypropylene |
| 96-well plate | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | CLS3596 | Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid |
| Acanthamoeba | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | ATCC 30461 | This protocol has been verified for ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115, and PRA-411 |
| Axenic culture media (AC6) | Made in house | n/a | Containing 20 g biosate peptone, 5 g glucose, 0.3 g KH2PO4, 10 µg vitamin B12, and 1 glass5 mg l-methionine per liter of distilled deionized water. Adjust pH to 6.6-6.95 with 1 M NaOH and autoclave at 121 °C for 20 min, store at room temperature for up to 3 months. |
| Centrifuge and appropriate rotor | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Sorvall ST 40R | Any equivalent centrifuge and rotor are acceptable so long as it can spin 50 mL conical tubes at 500 x g for 5 min |
| Chemotaxis and Migration Tool | Free software based on ImageJ, available at https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html | ||
| Disposable hemocytometer | Bulldog Bio, Portsmouth, NH, USA | DHC-N01 | Neubauer Improved 2-Chip Disposable Hemocytometer, Individually packaged, Nonpyrogenic |
| ImageJ software with Trackmate plugin (this protocol written with Trackmate version 6.0.2.) | Free software developed by the National Institutes of Health, available at imagej.net. Trackmate plugin available at https://imagej.net/plugins/trackmate/ | ||
| Microscope, preferably with automated moveable stage | Nikon, Tokyo, Japan | A Nikon Eclipse Ti-U Microscope was used in this study and the automated moveable stage was utilized to be able to record images in multiple wells at a time. | |
| NIS-Elements software | Nikon | ||
| Serological pipette | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | BrandTech 26331 | BrandTech accu-jet pro Pipet Controller |
| Serological pipette tips | VWR | 5 mL: 76201-710 10 mL: 170356 25 mL: 89130-900 50 mL: 75816-088 |
VWR Serological Pipette, Non-Pyrogenic |
| Sterile aluminum transmission flow cell | Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT, USA | FC 81-AL | Anodized aluminum single channel transmission flow cell with 96-well plate footprint for use with an inverted microscope |
| T75 Flasks | VWR, Radnor, PA, USA | 734-2316 | VWR Tissue Culture Flask, 182.5 cm, Surface treated, Plug seal cap, Sterile |
References
- Randag, A. C., et al. The rising incidence of Acanthamoeba keratitis: A 7-year nationwide survey and clinical assessment of risk factors and functional outcomes. PLoS One. 14 (9), e0222092 (2019).
- Szentmary, N., et al. Acanthamoeba keratitis – Clinical signs, differential diagnosis and treatment. J Curr Ophthalmol. 31 (1), 16-23 (2019).
- Carnt, N., et al. Acanthamoeba keratitis: confirmation of the UK outbreak and a prospective case-control study identifying contributing risk factors. Br J Ophthalmol. 102 (12), 1621-1628 (2018).
- Verani, J. R., et al. National outbreak of Acanthamoeba keratitis associated with use of a contact lens solution, United States. Emerg Infect Dis. 15 (8), 1236-1242 (2009).
- Tu, E. Y., Joslin, C. E. Recent outbreaks of atypical contact lens-related keratitis: what have we learned. Am J Ophthalmol. 150 (5), 602-608.e2 (2010).
- . ISO 14729:2001/A1. Ophthalmic optics-Contact lens care products-Microbiological requirements and test methods for products and regimens for hygienic management of contact lenses. , (2010).
- . ASC Z80, Parent Committee Meeting, February 27 Available from: https://www.thevisioncouncil.org/sites/default/files/ASCZ80_ParentCommitteeMinutes_February_27_2018_FINALMar19-2018.pdf (2023)
- Rayamajhee, B., et al. Acanthamoeba, an environmental phagocyte enhancing survival and transmission of human pathogens. Trends Parasitol. 38 (11), 975-990 (2022).
- Reverey, J. F., et al. Superdiffusion dominates intracellular particle motion in the supercrowded cytoplasm of pathogenic Acanthamoeba castellanii. Sci Rep. 5, 11690 (2015).
- Thapa, S., Lukat, N., Selhuber-Unkel, C., Cherstvy, A. G., Metzler, R. Transient superdiffusion of polydisperse vacuoles in highly motile amoeboid cells. J Chem Phys. 150 (14), 144901 (2019).
- Rudell, J. C., et al. Acanthamoeba migration in an electric field. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (6), 4225-4233 (2013).
- Fukaya, S., Aoki, K., Kobayashi, M., Takemura, M. Kinetic analysis of the motility of giant virus-infected amoebae using phase-contrast microscopic images. Front Microbiol. 10, 3014 (2019).
- Fukaya, S., Takemura, M. Kinetic analysis of Acanthamoeba castellanii infected with giant viruses quantitatively revealed process of morphological and behavioral changes in host cells. Microbiol Spectr. 9 (1), e0036821 (2021).
- Cheng, H. J., Hsu, C. H., Hung, C. L., Lin, C. Y. A review for cell and particle tracking on microscopy images using algorithms and deep learning technologies. Biomed J. 45 (3), 465-471 (2022).
- Mathieu, E., et al. Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments. Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).
- Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry A. 93 (3), 357-370 (2018).
- Piltti, K. M., et al. Live-cell time-lapse imaging and single-cell tracking of in vitro cultured neural stem cells – Tools for analyzing dynamics of cell cycle, migration, and lineage selection. Methods. 133, 81-90 (2018).
- Campolo, A., et al. Continuous real-time motility analysis of Acanthamoeba reveals sustained movement in absence of nutrients. Pathogens. 10 (8), 995 (2021).
- Campolo, A., Patterson, B., Lara, E., Shannon, P., Crary, M. Complete recovery of Acanthamoeba motility among surviving organisms after contact lens care disinfection. Microorganisms. 11 (2), 299 (2023).
- Crary, M. J., Walters, R., Shannon, P., Gabriel, M. M. Variables affecting the recovery of Acanthamoeba trophozoites. Pathogens. 10 (2), 221 (2021).
- . Trackmate Available from: https://imagej.net/plugins/trackmate/tutorials/getting-started (2024)
- Cherstvy, A. G., Nagel, O., Beta, C., Metzler, R. Non-Gaussianity, population heterogeneity, and transient superdiffusion in the spreading dynamics of amoeboid cells. Phys Chem Chem Phys. 20 (35), 23034-23054 (2018).
