Количественное определение Acanthamoeba spp. Подвижность
Summary
В этой процедуре описывается, как визуализировать, отслеживать и количественно оценить Acanthamoeba spp. подвижность.
Abstract
Акантамебный кератит — это тяжелая глазная инфекция, которая затрудняет лечение и может привести к слепоте. Несмотря на его повсеместное распространение и потенциальное загрязнение контактных линз после воздействия воды, естественное поведение этого патогена остается неуловимым. Понимание двигательных паттернов Acanthamoeba может рассказать нам о том, как она колонизирует контактные линзы и загрязняет роговицу пациента. К счастью, Acanthamoeba spp. видны с помощью светлопольной микроскопии, начиная с 4-кратного увеличения. Предыдущие методы были разработаны для количественной оценки подвижности акантамёбы в отношении цитопатических эффектов или недостаточного воздействия электрического поля. В этой статье мы опишем метод отслеживания и количественного определения Acanthamoeba spp. Долгосрочная подвижность (от нескольких часов до нескольких дней), которая является протоколом, применимым к различным штаммам амебы, поверхностям и пищевому статусу амебы. Эта процедура имеет отношение к определению многих количественных показателей основной подвижности, таких как расстояние, скорость, локализация и направленность, которые необходимы для мониторинга различных стадий инфекции, пролиферации или изменения поведения.
Introduction
Исследования акантамебы резко возросли в последние годы из-за возросшей распространенности акантамёбного кератита (АК), который является паразитарной инфекцией после прикрепления акантамёбы к роговице1. В то время как вспышки АК могут быть связаны с неправильным уходом за контактными линзами или неэффективными решениями по уходу за контактными линзами 2,3,4,5, в настоящее время нет требований для демонстрации эффективности дезинфекции Acanthamoeba для любого продукта, представленного на рынке. Тем не менее, в научном сообществе и в организациях по стандартизации предпринимаются постоянные усилия по изучению протоколов, необходимых для количественной оценки эффективности дезинфекции продуктов по уходу за контактными линзами 6,7. Кроме того, из-за своего сходства в клеточных и функциональных аспектах с человеческими макрофагами, было отмечено, что Acanthamoeba играет значительную роль в размещении и распространении других человеческихпатогенов8, в дополнение к патогенности, которую приносит сама амеба.
Были описаны последние методы, которые позволили количественно оценить подвижность акантамебы, которая, как правило, не сильно подвержена броуновскому движению 9,10, в отношении цитопатических эффектов или недостаточного воздействия электрического поля 9,11, а также достижения в анализе подвижности в исследованиях гигантских вирусов с использованием акантамебы в качестве отслеживаемого вирусного вектора. 13. Кроме того, в течение последних 20 лет наблюдаются постоянные и значительные улучшения в отслеживании клеток и частиц с использованием новых программ, таких как используемое здесь программное обеспечение для визуализации, а также новые алгоритмы и технологии глубокого обучения. Тем не менее, это относительно новая и растущая область науки в отношении настольных исследований, клинического применения и промышленных стандартов, и было опубликовано мало данных о методах визуализации и отслеживания этой амебы, особенно для количественной оценки поведенческих изменений после приверженности контактным линзам или во время или после дезинфекции контактных линз. Другие области, расширяющиеся до долгосрочного визуального мониторинга, поддержали эти усилия 15,16,17. Из-за присущей акантамебе сложной природы, включая общую устойчивость к плазмидам (которые могут придавать флуоресценцию), способность амебы потреблять и разрушать стандартные клеточные красители, а также уникальный внешний белковый состав, затрудняющий мечение антителами, методы, доступные другим клеткам, которые делают их видимыми в условиях, отличных от визуализации в светлом поле, были непригодны для использования в этом организме. Таким образом, количественная оценка подвижности этой амебы продемонстрировала значительный вклад в эту область. Используя описанный здесь способ, мы смогли установить, что амеба остается подвижной в течение по меньшей мере 12 ч без питательных веществ18 и что амеба, которая подвергается процессу дезинфекции и теряет подвижность во время дезинфекции, может восстановить свою подвижность после дезинфекции, если она не полностью лизирована19.
В этом протоколе подробно описано, как визуально отслеживать и количественно измерять подвижность амебы под микроскопом. Основными шагами являются запись амебы в светлом поле с использованием соответствующего фокуса и времени между изображениями, преобразование изображений в двоичные с помощью программного обеспечения для обработки изображений, а затем использование плагина отслеживания программного обеспечения для обработки изображений для установки экспериментальных параметров и отслеживание каждой амебы для определения необходимых измерений, таких как скорость, расстояние и ограничение. После этого можно количественно оценить хемотаксис амебы или популяции амебы, чтобы определить направленность. Ключевым вкладом этого метода является визуализация и количественная оценка поведения амебы во время различных состояний питательной поддержки, прилипания к поверхности, дезинфекции или других изменений окружающей среды, таких как совместное проживание с культурой клеток млекопитающих.
Protocol
Representative Results
Discussion
Возможность отслеживать и количественно оценивать подвижность амеб, таких как Acanthamoeba, которые являются адгезивными микроскопическими организмами, не подверженными влиянию броуновского движения с низкой скоростью 9,10, раскрывает значительный объем информации о поведении амеб и может значительно повысить осведомленность о методах профилактики АК. Этот протокол был подробно описан в недавних публикациях, и данные были подтверждены или объединены с другими аналогичными анализами данных18,19. Отметим здесь, что скорость амебы, подробно описанная с помощью этого метода, аналогична той, которая была опубликована другими группами. Этот протокол примечателен своей способностью использоваться практически на любой поверхности или обработке амебы, которая прозрачна для света, но важно отметить, что, хотя этот протокол потенциально может быть модифицирован для работы с другими организмами, он был оптимизирован только для Acanthamoeba. Описанный выше протокол неизменно хорошо работает в лаборатории, но в него внесены следующие изменения для изменения метода в соответствии с другими потребностями или устранения сложных ситуаций.
Определение параметров отслеживания: В приведенном выше протоколе были перечислены покадровая связь, закрытие разрыва, максимальный интервал между кадрами и количество пятен на треке, которые были наиболее применимы для последних публикаций. Однако не исключено, что другие параметры будут более подходящими для других нужд. Кроме того, могут быть параметры, которые другие хотели бы использовать, но не использовали здесь (например, максимальное расстояние трека под фильтрами трека). Более подробную информацию о каждом параметре и о том, что они описывают, можно найти здесь, на веб-сайте (см. ссылку21). Решая, какие параметры и фильтры наиболее релевантны для других экспериментов и как их следует задавать, подумайте о том, что статистически рационально для конкретного проекта; Например, нужны ли были бы данные от амебы, которая уходит из поля зрения, а затем возвращается в него? Или кто-то захочет сохранить данные от амебы, которая вообще не двигалась, но все равно была помечена как след? и что имеет смысл для количества кадров и продолжительности времени между кадрами, когда были записаны изображения.
Изменение размера капли: Мы обнаружили, что с помощью любого программного обеспечения или любой конфигурации микроскопа, основанной на современных технологиях и программном обеспечении, доступных в стандартных лабораториях, чрезвычайно сложно точно отследить количество амеб в совокупности, поскольку оно меняется с течением времени. Если вы отслеживаете размер капли и пытаетесь соотнести этот размер с количеством организмов в нем, используйте стандартную кривую, сгенерированную после повторных экспериментов, чтобы математически предсказать размер агрегата. Например, агрегаты были созданы путем посева лунок с различным количеством амеб, таких как 8, 16, 32, 125, 250, 500, 1000 и 2000 клеток на скважину. Были получены таймлапс-изображения в различных временных точках каждой скважины в течение 24 часов. Каждый сфероид (который имел известное количество амеб) был проанализирован для двумерной области, и стандартная кривая была сгенерирована как функция зависимости количества амеб от размера сфероида с течением времени. Этот эксперимент был повторен по крайней мере в трех экземплярах, чтобы получить соответствующее стандартное отклонение любой сгенерированной кривой.
Определение направленности амебы: Хотя это может и не быть необходимым для конкретных исследований, может быть полезно понять направленность амебы. Это позволило бы получить данные о хемотаксических эффектах лечения или эксперимента. Эти данные также могут быть использованы для создания как визуальных (графических), так и количественных данных. Это доступно с помощью инструмента Chemotaxis and Migration Tool, который является бесплатным плагином для программного обеспечения для обработки изображений. Он доступен на веб-сайте вместе с руководством по применению и образцами изображений и видеороликов (см. Таблицу материалов).
Детальная динамика движения: другие группы исследовали динамику спрединга и диффузионные траектории с помощью высокоразвитого и развитого статистического анализа, выходящего за рамки того, что обсуждается здесь 9,10,22. Они могут быть рассмотрены в зависимости от потребностей пользователя.
Как и в случае с любым успешным методом, протокол, подробно описанный в этой рукописи, прошел множество раундов устранения неполадок для достижения согласованности. В то время как отличные высококачественные отслеживаемые видео могут быть сделаны путем съемки изображения каждую секунду (или так быстро, как микроскоп может это сделать, это может быть меньше секунды), это создает чрезвычайно большие файлы, с которыми может быть трудно работать. Это реально подходит только для очень краткосрочных видео, записанных максимум на несколько минут. И наоборот, делая изображение каждые несколько секунд, мы обнаружили, что поведение амебы по-прежнему очень легко отслеживается в зависимости от скорости этого вида, и можно создавать рабочие видео в течение нескольких часов или дней. Мы обнаружили, что максимальный промежуток времени между изображениями составляет 30 с, что является временем, которое требуется для точного отслеживания амебы программным обеспечением для обработки изображений. Временной интервал, выбранный пользователем, следует учитывать с учетом известных ограничений, связанных с тем, с какой скоростью микроскоп может записывать изображения, сколько изображений требуется на лунку и сколько лунок записывается на каждом интервале. Аналогичным образом, параметры, упомянутые в этом протоколе относительно максимального смещения, допустимых промежутков между кадрами, минимального количества необходимых кадров и т. д., были определены методом проб и ошибок этой лабораторией для создания информации о дорожке, которая включает в себя наиболее полные следы амебы и игнорирует шум, создаваемый незавершенными дорожками, амебой, которая присоединяется к сцене или покидает ее в середине видео, или ошибками, вызванными путаницей программного обеспечения для обработки изображений, например, когда две амебы встречаются в середине трека, а затем разделяются. Такого рода ошибки и неполные треки по понятным причинам высоки при создании чрезвычайно длинных (от нескольких часов до нескольких дней) видео микроскопических биологических организмов, которые постоянно взаимодействуют друг с другом и являются причиной того, что очень большая часть ошибочных треков должна быть отбракована. Следует отметить, что этап заполнения отверстий в протоколе, по опыту этой лаборатории, важен для уменьшения ошибок в том, как программное обеспечение для визуализации отслеживает амебу. Убедившись, что каждая амеба представляет собой сплошной круг, а не пончик или букву «с», программное обеспечение с гораздо большей вероятностью сможет успешно отслеживать каждую амебу.
Кроме того, как уже говорилось, существует множество параметров, доступных пользователю для анализа изображения или видео. Основываясь на экспериментальных потребностях, мы постоянно извлекаем наибольшую пользу из анализа общего расстояния, максимального расстояния, скорости и водоизмещения. Они подробно обсуждаются (в том числе с использованием различных деформаций и поверхностей) с графическими интерпретациями в предыдущих публикациях18,19. Эти четыре параметра позволяют пользователю экстраполировать способность амебы преодолевать линейные расстояния и время, необходимое для этого, что помогает понять их поведение в отношении загрязнения контактных линз. Получение и анализ этих параметров — это большая работа, как подробно описано на наших рисунках. Работая с большими и многочисленными электронными таблицами из выходных данных программного обеспечения для обработки изображений, мы ограничили количество непреднамеренных ошибок, создав заблокированные шаблоны электронных таблиц, которые автоматически рассчитывали все необходимые анализы. Тем не менее, возможным улучшением этого метода было бы написание скрипта, который может обрабатывать эти данные, сортировать и анализировать их.
В заключение следует отметить, что здесь описан доступный и точный метод измерения размера и подвижности акантамебы в самых разных условиях. Мы продемонстрировали, что этот метод может быть применен ко многим различным штаммам амебы, и показали, что, хотя могут существовать простые параметры для получения информации о подвижности, эта экспериментальная установка может быть в значительной степени адаптирована к любым конкретным потребностям.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была профинансирована компанией Alcon Research, LLC.
Materials
| ¼ Ringer’s solution | ThermoFisher Scientific | BR0052G | Oxoid Ringers Solution Tablets. Follow directions to make one-quarter strength instead of full strength Ringers. |
| 10 µL pipette | Eppendorf Research | 3123000039 | 2 µL-20 µL single channel |
| 10 µL pipette tips | Neptune Scientific, San Diego, CA, USA | BT10.N | 10 µL Universal Barrier Tip |
| 48 well plate | Millipore Sigma, | CLS3548 | Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid |
| 50 mL conical tubes (1 for each sample, 1 for each pass 2 sample) | Fisher Scientific | Falcon 352098 | Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge Tubes, polypropylene |
| 96-well plate | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | CLS3596 | Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid |
| Acanthamoeba | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | ATCC 30461 | This protocol has been verified for ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115, and PRA-411 |
| Axenic culture media (AC6) | Made in house | n/a | Containing 20 g biosate peptone, 5 g glucose, 0.3 g KH2PO4, 10 µg vitamin B12, and 1 glass5 mg l-methionine per liter of distilled deionized water. Adjust pH to 6.6-6.95 with 1 M NaOH and autoclave at 121 °C for 20 min, store at room temperature for up to 3 months. |
| Centrifuge and appropriate rotor | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Sorvall ST 40R | Any equivalent centrifuge and rotor are acceptable so long as it can spin 50 mL conical tubes at 500 x g for 5 min |
| Chemotaxis and Migration Tool | Free software based on ImageJ, available at https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html | ||
| Disposable hemocytometer | Bulldog Bio, Portsmouth, NH, USA | DHC-N01 | Neubauer Improved 2-Chip Disposable Hemocytometer, Individually packaged, Nonpyrogenic |
| ImageJ software with Trackmate plugin (this protocol written with Trackmate version 6.0.2.) | Free software developed by the National Institutes of Health, available at imagej.net. Trackmate plugin available at https://imagej.net/plugins/trackmate/ | ||
| Microscope, preferably with automated moveable stage | Nikon, Tokyo, Japan | A Nikon Eclipse Ti-U Microscope was used in this study and the automated moveable stage was utilized to be able to record images in multiple wells at a time. | |
| NIS-Elements software | Nikon | ||
| Serological pipette | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | BrandTech 26331 | BrandTech accu-jet pro Pipet Controller |
| Serological pipette tips | VWR | 5 mL: 76201-710 10 mL: 170356 25 mL: 89130-900 50 mL: 75816-088 |
VWR Serological Pipette, Non-Pyrogenic |
| Sterile aluminum transmission flow cell | Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT, USA | FC 81-AL | Anodized aluminum single channel transmission flow cell with 96-well plate footprint for use with an inverted microscope |
| T75 Flasks | VWR, Radnor, PA, USA | 734-2316 | VWR Tissue Culture Flask, 182.5 cm, Surface treated, Plug seal cap, Sterile |
References
- Randag, A. C., et al. The rising incidence of Acanthamoeba keratitis: A 7-year nationwide survey and clinical assessment of risk factors and functional outcomes. PLoS One. 14 (9), e0222092 (2019).
- Szentmary, N., et al. Acanthamoeba keratitis – Clinical signs, differential diagnosis and treatment. J Curr Ophthalmol. 31 (1), 16-23 (2019).
- Carnt, N., et al. Acanthamoeba keratitis: confirmation of the UK outbreak and a prospective case-control study identifying contributing risk factors. Br J Ophthalmol. 102 (12), 1621-1628 (2018).
- Verani, J. R., et al. National outbreak of Acanthamoeba keratitis associated with use of a contact lens solution, United States. Emerg Infect Dis. 15 (8), 1236-1242 (2009).
- Tu, E. Y., Joslin, C. E. Recent outbreaks of atypical contact lens-related keratitis: what have we learned. Am J Ophthalmol. 150 (5), 602-608.e2 (2010).
- . ISO 14729:2001/A1. Ophthalmic optics-Contact lens care products-Microbiological requirements and test methods for products and regimens for hygienic management of contact lenses. , (2010).
- . ASC Z80, Parent Committee Meeting, February 27 Available from: https://www.thevisioncouncil.org/sites/default/files/ASCZ80_ParentCommitteeMinutes_February_27_2018_FINALMar19-2018.pdf (2023)
- Rayamajhee, B., et al. Acanthamoeba, an environmental phagocyte enhancing survival and transmission of human pathogens. Trends Parasitol. 38 (11), 975-990 (2022).
- Reverey, J. F., et al. Superdiffusion dominates intracellular particle motion in the supercrowded cytoplasm of pathogenic Acanthamoeba castellanii. Sci Rep. 5, 11690 (2015).
- Thapa, S., Lukat, N., Selhuber-Unkel, C., Cherstvy, A. G., Metzler, R. Transient superdiffusion of polydisperse vacuoles in highly motile amoeboid cells. J Chem Phys. 150 (14), 144901 (2019).
- Rudell, J. C., et al. Acanthamoeba migration in an electric field. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (6), 4225-4233 (2013).
- Fukaya, S., Aoki, K., Kobayashi, M., Takemura, M. Kinetic analysis of the motility of giant virus-infected amoebae using phase-contrast microscopic images. Front Microbiol. 10, 3014 (2019).
- Fukaya, S., Takemura, M. Kinetic analysis of Acanthamoeba castellanii infected with giant viruses quantitatively revealed process of morphological and behavioral changes in host cells. Microbiol Spectr. 9 (1), e0036821 (2021).
- Cheng, H. J., Hsu, C. H., Hung, C. L., Lin, C. Y. A review for cell and particle tracking on microscopy images using algorithms and deep learning technologies. Biomed J. 45 (3), 465-471 (2022).
- Mathieu, E., et al. Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments. Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).
- Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry A. 93 (3), 357-370 (2018).
- Piltti, K. M., et al. Live-cell time-lapse imaging and single-cell tracking of in vitro cultured neural stem cells – Tools for analyzing dynamics of cell cycle, migration, and lineage selection. Methods. 133, 81-90 (2018).
- Campolo, A., et al. Continuous real-time motility analysis of Acanthamoeba reveals sustained movement in absence of nutrients. Pathogens. 10 (8), 995 (2021).
- Campolo, A., Patterson, B., Lara, E., Shannon, P., Crary, M. Complete recovery of Acanthamoeba motility among surviving organisms after contact lens care disinfection. Microorganisms. 11 (2), 299 (2023).
- Crary, M. J., Walters, R., Shannon, P., Gabriel, M. M. Variables affecting the recovery of Acanthamoeba trophozoites. Pathogens. 10 (2), 221 (2021).
- . Trackmate Available from: https://imagej.net/plugins/trackmate/tutorials/getting-started (2024)
- Cherstvy, A. G., Nagel, O., Beta, C., Metzler, R. Non-Gaussianity, population heterogeneity, and transient superdiffusion in the spreading dynamics of amoeboid cells. Phys Chem Chem Phys. 20 (35), 23034-23054 (2018).
