Quantificação de Acanthamoeba spp. Motilidade
Summary
Este procedimento descreve como visualizar, rastrear e quantificar Acanthamoeba spp. motilidade.
Abstract
A ceratite por Acanthamoeba é uma infecção ocular grave que apresenta desafios de tratamento e pode levar à cegueira. Apesar de sua onipresença e potencial contaminação de lentes de contato após a exposição à água, o comportamento natural desse patógeno permanece indefinido. Compreender os padrões de movimento da Acanthamoeba pode nos informar sobre como ela coloniza as lentes de contato e contamina a córnea do paciente. É uma sorte que Acanthamoeba spp. são visíveis por microscopia de campo claro a partir de uma ampliação de 4x. Técnicas anteriores foram desenvolvidas para quantificar a motilidade de Acanthamoeba em relação aos efeitos citopáticos ou subexposição ao campo elétrico. Aqui, descrevemos um método para rastrear e quantificar Acanthamoeba spp. motilidade de longo prazo (horas a dias), que é um protocolo aplicável a várias cepas de ameba, superfícies e estado nutricional de ameba. Este procedimento é pertinente para determinar muitas quantificações de motilidade central, como distância, velocidade, confinamento e direcionalidade, que são necessárias para monitorar diferentes estágios de infecção, proliferação ou mudança comportamental.
Introduction
A pesquisa de Acanthamoeba aumentou dramaticamente nos últimos anos devido ao aumento da prevalência de ceratite por Acanthamoeba (AK), que é uma infecção parasitária após a fixação de Acanthamoeba à córnea1. Embora os surtos de AK possam ser atribuídos a cuidados inadequados com lentes de contato ou soluções ineficazes para cuidados com lentes de contato 2,3,4,5, atualmente não há requisitos para demonstrar a eficácia da desinfecção de Acanthamoeba para qualquer produto no mercado. No entanto, há um esforço contínuo na comunidade científica e nas organizações de padrões para examinar os protocolos necessários para quantificar a eficácia da desinfecção de produtos para cuidados com lentes de contato 6,7. Além disso, devido à sua semelhança em aspectos celulares e funcionais com macrófagos humanos, Acanthamoeba foi observado como tendo um papel significativo no hospedeiro e disseminação de outros patógenos humanos8, além da patogenicidade que a própria ameba traz.
Foram descritas técnicas recentes que foram capazes de quantificar a motilidade de Acanthamoeba – que geralmente não está altamente sujeita ao movimento browniano 9,10 – em relação a efeitos citopáticos ou subexposição ao campo elétrico 9,11, bem como avanços na análise de motilidade na pesquisa de vírus gigantes usando Acanthamoeba como vetor viral rastreável 12, 13. Também houve melhorias constantes e significativas no rastreamento de células e partículas ocorrendo nos últimos 20 anos usando novos programas de software, como o software de imagem usado aqui, e novos algoritmos e tecnologias de aprendizado profundo14. No entanto, este é um campo relativamente novo e crescente da ciência em relação à pesquisa de bancada, aplicação clínica e padrões industriais, e tem havido uma escassez de dados publicados sobre métodos para visualizar e rastrear essa ameba, particularmente para quantificar mudanças comportamentais após a adesão às lentes de contato ou durante ou após a desinfecção das lentes de contato. Outros campos que se expandem para o monitoramento visual de longo prazo apoiaram esse esforço15 , 16 , 17 . Devido à natureza inerentemente desafiadora de Acanthamoeba – incluindo uma resistência geral a plasmídeos (que podem conferir fluorescência), a capacidade da ameba de consumir e destruir corantes celulares padrão e uma composição proteica externa única – dificultando a marcação de anticorpos – métodos disponíveis para outras células que os tornam visíveis em outros ambientes que não a imagem de campo claro têm sido inutilizáveis neste organismo. Assim, quantificar a motilidade dessa ameba demonstrou uma adição significativa ao campo. Usando o método descrito aqui, pudemos verificar que as amebas permanecem móveis por pelo menos 12 h sem nutrientes18 e que as amebas que são desafiadas com um processo de desinfecção e cessam a motilidade durante a desinfecção podem recuperar sua motilidade pós-desinfecção se não forem totalmente lisadas19.
Este protocolo detalha como rastrear e quantificar visualmente a motilidade da ameba microscopicamente. As etapas principais são registrar a ameba em campo claro usando o foco e o tempo apropriados entre as imagens, transformar as imagens em binárias usando o software de imagem e, em seguida, usar o plug-in de rastreamento de um software de imagem para definir os parâmetros experimentais e seguir cada ameba para determinar as medidas necessárias, como velocidade, distância e confinamento. Em seguida, é possível quantificar a quimiotaxia de uma ameba ou de uma população de amebas para definir a direcionalidade. A principal contribuição deste método é visualizar e quantificar o comportamento da ameba durante diferentes estados de suporte nutricional, adesão à superfície, desafio de desinfecção ou outras alterações ambientais, como coabitação com cultura de células de mamíferos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ser capaz de rastrear e quantificar a motilidade de amebas como Acanthamoeba, que são organismos microscópicos aderentes não afetados pelo movimento browniano de baixa velocidade 9,10, revela uma quantidade substancial de informações sobre o comportamento da ameba e pode aumentar muito o esclarecimento sobre os métodos de prevenção da CA. Esse protocolo foi detalhado em publicações recentes, e os dados foram confirmados ou combinados com outras análises de dados semelhantes 18,19. Notamos aqui que a velocidade da ameba detalhada usando este método é semelhante ao que foi publicado por outros grupos. Este protocolo é notável por sua capacidade de ser usado basicamente em qualquer tratamento de superfície ou ameba, que é transparente à luz, mas é importante observar que, embora este protocolo possa ser modificado para funcionar com outros organismos, ele só foi otimizado até agora para Acanthamoeba. O protocolo acima funcionou consistentemente bem no laboratório, mas as seguintes alterações para alterar o método para atender a outras necessidades ou solucionar problemas de situações difíceis são fornecidas.
Determinando os parâmetros de rastreamento: No protocolo acima, foram listados a vinculação quadro a quadro, o fechamento da lacuna, a lacuna máxima do quadro e o número de pontos na pista, que eram os mais aplicáveis para publicações recentes. No entanto, é possível que outros parâmetros sejam mais adequados para outras necessidades. Além disso, pode haver parâmetros que outros gostariam de usar, mas não foram usados aqui (como a distância máxima de uma trilha em filtros de trilha). Mais informações sobre cada parâmetro e o que eles descrevem podem ser acessadas aqui no site (consulte a referência21). Ao decidir quais parâmetros e filtros são mais relevantes para outros experimentos e como eles devem ser definidos, pense no que é estatisticamente racional para um projeto específico; Por exemplo, alguém gostaria de dados de uma ameba que sai e depois volta para o campo de visão? Ou alguém gostaria de manter os dados de uma ameba que não se moveu muito, mas ainda foi marcada como uma faixa? e o que faz sentido para o número de quadros e o período de tempo entre os quadros em que as imagens foram gravadas.
Alterando o tamanho da bolha: Descobrimos que é extremamente difícil com qualquer software ou configuração de microscópio – com base nas tecnologias atuais e software disponível para laboratórios padrão – rastrear com precisão o número de amebas em um agregado à medida que ele muda ao longo do tempo. Se estiver rastreando o tamanho de uma bolha e tentando correlacionar esse tamanho com o número de organismos nela, use uma curva padrão gerada após experimentos repetidos para prever matematicamente o tamanho de um agregado. Por exemplo, os agregados foram criados semeando poços com uma variedade de números de ameba, como 8, 16, 32, 125, 250, 500, 1.000 e 2.000 células por poço. Imagens de lapso de tempo em vários pontos de tempo de cada poço por 24 h foram geradas. Cada esferóide (que era de um número conhecido de ameba) foi analisado para uma área bidimensional, e uma curva padrão foi gerada em função da contagem de amebas versus o tamanho do esferóide ao longo do tempo. Este experimento foi repetido em pelo menos triplicado para nos dar um desvio padrão apropriado de qualquer curva gerada.
Determinando a direcionalidade da ameba: Embora isso possa não ser necessário para estudos específicos, pode ser útil entender a direcionalidade da ameba. Isso forneceria dados sobre os efeitos quimiotáticos do tratamento ou experimento. Esses dados também podem ser usados para criar dados visuais (gráficos) e quantitativos. Isso está disponível por meio da Ferramenta de Quimiotaxia e Migração, que é um plug-in gratuito para software de imagem. Está disponível no site junto com o guia de aplicação e imagens e filmes de amostra (consulte a Tabela de Materiais).
Dinâmica de movimento detalhada: outros grupos examinaram a dinâmica de espalhamento e as trajetórias difusivas com análises estatísticas altamente avançadas e desenvolvidas além do que é discutido aqui 9,10,22. Estes podem ser considerados com base nas necessidades do usuário.
Como acontece com qualquer método bem-sucedido, o protocolo detalhado neste manuscrito passou por muitas rodadas de solução de problemas para obter consistência. Embora excelentes vídeos rastreáveis de alta qualidade possam ser feitos tirando uma imagem a cada segundo (ou tão rápido quanto o microscópio é capaz, pode ser menos de um segundo), isso cria arquivos extremamente grandes, com os quais pode ser difícil trabalhar. Isso só é realisticamente adequado para vídeos de muito curto prazo gravados por no máximo alguns minutos. Por outro lado, ao tirar uma imagem a cada poucos segundos, descobrimos que o comportamento da ameba ainda é muito rastreável com base na velocidade dessa espécie, e é possível criar vídeos viáveis ao longo de horas ou dias. Descobrimos que a quantidade máxima de tempo entre as imagens é de 30 s, que é o tempo necessário para que a ameba seja rastreada com precisão pelo software de imagem. O intervalo de tempo que o usuário escolhe deve ser considerado usando as restrições conhecidas de quão rápido o microscópio pode gravar imagens, quantas imagens por poço são necessárias e quantos poços estão sendo registrados em cada intervalo. Da mesma forma, os parâmetros mencionados neste protocolo em relação ao deslocamento máximo, lacunas de quadros permitidas, quadros mínimos necessários e assim por diante, foram determinados por tentativa e erro por este laboratório para criar informações de trilha que incluem as faixas de ameba mais completas e ignorar o ruído criado por trilhas incompletas, ameba que se junta ou sai do palco no meio do vídeo ou erros criados por confusão de software de imagem, como quando duas amebas se encontram no meio da pista e depois se separam. Esses tipos de erros e faixas incompletas são compreensivelmente altos ao criar vídeos extremamente longos (horas a dias) de organismos biológicos microscópicos que estão constantemente interagindo uns com os outros e são a razão pela qual uma grande parte das trilhas errôneas deve ser rejeitada. Deve-se notar que a etapa de preenchimento de orifícios no protocolo é, na experiência deste laboratório, importante para reduzir o erro na forma como o software de imagem rastreia a ameba. Ao certificar-se de que cada ameba é um círculo sólido em vez de, às vezes, uma rosquinha ou uma forma de c, é muito mais provável que o software seja capaz de rastrear cada ameba com sucesso.
Além disso, conforme discutido, existem muitos parâmetros disponíveis para um usuário analisar uma imagem ou vídeo. Com base nas necessidades experimentais, temos consistentemente nos beneficiado mais da análise da distância total, distância máxima, velocidade e deslocamento. Estes são discutidos em profundidade (incluindo o uso de diferentes linhagens e superfícies) com interpretações gráficas em publicações anteriores18,19. Esses quatro parâmetros permitem que um usuário extrapole a capacidade de uma ameba de percorrer distâncias lineares e quanto tempo leva para fazê-lo, o que ajuda a entender seu comportamento no que se refere à contaminação das lentes de contato. Recuperar e analisar esses parâmetros é um trabalho grande, conforme detalhado em nossas figuras. Ao trabalhar com planilhas grandes e numerosas a partir da saída do software de imagem, limitamos os erros não intencionais criando modelos de planilhas bloqueadas que calculavam automaticamente todas as análises necessárias. No entanto, uma possível melhoria nesse método seria escrever um script que possa lidar com esses dados, classificá-los e analisá-los.
Em conclusão, um método acessível e preciso para medir o tamanho e a motilidade de Acanthamoeba em muitas condições diferentes é descrito aqui. Demonstramos que esse método pode ser aplicado a muitas cepas diferentes de ameba e destacamos que, embora possa haver parâmetros diretos para obter informações de motilidade, essa configuração experimental pode ser altamente adaptada a quaisquer necessidades específicas.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Alcon Research, LLC.
Materials
| ¼ Ringer’s solution | ThermoFisher Scientific | BR0052G | Oxoid Ringers Solution Tablets. Follow directions to make one-quarter strength instead of full strength Ringers. |
| 10 µL pipette | Eppendorf Research | 3123000039 | 2 µL-20 µL single channel |
| 10 µL pipette tips | Neptune Scientific, San Diego, CA, USA | BT10.N | 10 µL Universal Barrier Tip |
| 48 well plate | Millipore Sigma, | CLS3548 | Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid |
| 50 mL conical tubes (1 for each sample, 1 for each pass 2 sample) | Fisher Scientific | Falcon 352098 | Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge Tubes, polypropylene |
| 96-well plate | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | CLS3596 | Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid |
| Acanthamoeba | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | ATCC 30461 | This protocol has been verified for ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115, and PRA-411 |
| Axenic culture media (AC6) | Made in house | n/a | Containing 20 g biosate peptone, 5 g glucose, 0.3 g KH2PO4, 10 µg vitamin B12, and 1 glass5 mg l-methionine per liter of distilled deionized water. Adjust pH to 6.6-6.95 with 1 M NaOH and autoclave at 121 °C for 20 min, store at room temperature for up to 3 months. |
| Centrifuge and appropriate rotor | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Sorvall ST 40R | Any equivalent centrifuge and rotor are acceptable so long as it can spin 50 mL conical tubes at 500 x g for 5 min |
| Chemotaxis and Migration Tool | Free software based on ImageJ, available at https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html | ||
| Disposable hemocytometer | Bulldog Bio, Portsmouth, NH, USA | DHC-N01 | Neubauer Improved 2-Chip Disposable Hemocytometer, Individually packaged, Nonpyrogenic |
| ImageJ software with Trackmate plugin (this protocol written with Trackmate version 6.0.2.) | Free software developed by the National Institutes of Health, available at imagej.net. Trackmate plugin available at https://imagej.net/plugins/trackmate/ | ||
| Microscope, preferably with automated moveable stage | Nikon, Tokyo, Japan | A Nikon Eclipse Ti-U Microscope was used in this study and the automated moveable stage was utilized to be able to record images in multiple wells at a time. | |
| NIS-Elements software | Nikon | ||
| Serological pipette | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | BrandTech 26331 | BrandTech accu-jet pro Pipet Controller |
| Serological pipette tips | VWR | 5 mL: 76201-710 10 mL: 170356 25 mL: 89130-900 50 mL: 75816-088 |
VWR Serological Pipette, Non-Pyrogenic |
| Sterile aluminum transmission flow cell | Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT, USA | FC 81-AL | Anodized aluminum single channel transmission flow cell with 96-well plate footprint for use with an inverted microscope |
| T75 Flasks | VWR, Radnor, PA, USA | 734-2316 | VWR Tissue Culture Flask, 182.5 cm, Surface treated, Plug seal cap, Sterile |
References
- Randag, A. C., et al. The rising incidence of Acanthamoeba keratitis: A 7-year nationwide survey and clinical assessment of risk factors and functional outcomes. PLoS One. 14 (9), e0222092 (2019).
- Szentmary, N., et al. Acanthamoeba keratitis – Clinical signs, differential diagnosis and treatment. J Curr Ophthalmol. 31 (1), 16-23 (2019).
- Carnt, N., et al. Acanthamoeba keratitis: confirmation of the UK outbreak and a prospective case-control study identifying contributing risk factors. Br J Ophthalmol. 102 (12), 1621-1628 (2018).
- Verani, J. R., et al. National outbreak of Acanthamoeba keratitis associated with use of a contact lens solution, United States. Emerg Infect Dis. 15 (8), 1236-1242 (2009).
- Tu, E. Y., Joslin, C. E. Recent outbreaks of atypical contact lens-related keratitis: what have we learned. Am J Ophthalmol. 150 (5), 602-608.e2 (2010).
- . ISO 14729:2001/A1. Ophthalmic optics-Contact lens care products-Microbiological requirements and test methods for products and regimens for hygienic management of contact lenses. , (2010).
- . ASC Z80, Parent Committee Meeting, February 27 Available from: https://www.thevisioncouncil.org/sites/default/files/ASCZ80_ParentCommitteeMinutes_February_27_2018_FINALMar19-2018.pdf (2023)
- Rayamajhee, B., et al. Acanthamoeba, an environmental phagocyte enhancing survival and transmission of human pathogens. Trends Parasitol. 38 (11), 975-990 (2022).
- Reverey, J. F., et al. Superdiffusion dominates intracellular particle motion in the supercrowded cytoplasm of pathogenic Acanthamoeba castellanii. Sci Rep. 5, 11690 (2015).
- Thapa, S., Lukat, N., Selhuber-Unkel, C., Cherstvy, A. G., Metzler, R. Transient superdiffusion of polydisperse vacuoles in highly motile amoeboid cells. J Chem Phys. 150 (14), 144901 (2019).
- Rudell, J. C., et al. Acanthamoeba migration in an electric field. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (6), 4225-4233 (2013).
- Fukaya, S., Aoki, K., Kobayashi, M., Takemura, M. Kinetic analysis of the motility of giant virus-infected amoebae using phase-contrast microscopic images. Front Microbiol. 10, 3014 (2019).
- Fukaya, S., Takemura, M. Kinetic analysis of Acanthamoeba castellanii infected with giant viruses quantitatively revealed process of morphological and behavioral changes in host cells. Microbiol Spectr. 9 (1), e0036821 (2021).
- Cheng, H. J., Hsu, C. H., Hung, C. L., Lin, C. Y. A review for cell and particle tracking on microscopy images using algorithms and deep learning technologies. Biomed J. 45 (3), 465-471 (2022).
- Mathieu, E., et al. Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments. Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).
- Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry A. 93 (3), 357-370 (2018).
- Piltti, K. M., et al. Live-cell time-lapse imaging and single-cell tracking of in vitro cultured neural stem cells – Tools for analyzing dynamics of cell cycle, migration, and lineage selection. Methods. 133, 81-90 (2018).
- Campolo, A., et al. Continuous real-time motility analysis of Acanthamoeba reveals sustained movement in absence of nutrients. Pathogens. 10 (8), 995 (2021).
- Campolo, A., Patterson, B., Lara, E., Shannon, P., Crary, M. Complete recovery of Acanthamoeba motility among surviving organisms after contact lens care disinfection. Microorganisms. 11 (2), 299 (2023).
- Crary, M. J., Walters, R., Shannon, P., Gabriel, M. M. Variables affecting the recovery of Acanthamoeba trophozoites. Pathogens. 10 (2), 221 (2021).
- . Trackmate Available from: https://imagej.net/plugins/trackmate/tutorials/getting-started (2024)
- Cherstvy, A. G., Nagel, O., Beta, C., Metzler, R. Non-Gaussianity, population heterogeneity, and transient superdiffusion in the spreading dynamics of amoeboid cells. Phys Chem Chem Phys. 20 (35), 23034-23054 (2018).
