アカントアメーバ属の定量化運動
Summary
この手順では、 Acanthamoeba spp .運動。
Abstract
アカントアメーバ 角膜炎は、治療上の課題を引き起こし、失明につながる可能性のある重度の眼感染症です。この病原体はどこにでも存在し、水にさらされるとコンタクトレンズが汚染される可能性があるにもかかわらず、この病原体の自然な挙動はとらえどころのないままです。 アカンタメーバの動き のパターンを理解することで、アカンタメーバがどのようにコンタクトレンズにコロニーを形成し、患者の角膜を汚染するかを知ることができます。それは Acanthamoeba spp. は、4倍の倍率から始まる明視野顕微鏡で見ることができます。これまでの技術は、細胞変性の影響や電界への曝露不足に関する アカントアメー バの運動性を定量化するために開発されてきた。ここでは、 アカントアメーバ属 を追跡し定量化する方法について説明します。運動性長期(数時間から数日)は、アメーバの複数のアメーバ株、表面、および栄養状態に適用可能なプロトコルです。この手順は、感染、増殖、または行動変化のさまざまな段階を監視するために必要な、距離、速度、閉じ込め、方向性など、多くの主要な運動性の定量化を決定するのに密接に関連しています。
Introduction
アカントアメーバの研究は、アカントアメーバが角膜に付着した後の寄生虫感染症であるアカントアメーバ角膜炎(AK)の有病率の増加により、近年劇的に増加しています1。AKの発生は、不適切なコンタクトレンズケアまたは効果のないコンタクトレンズケアソリューション2,3,4,5に起因する可能性がありますが、現在、市場に出回っている製品に対してアカントアメーバ消毒の有効性を実証するための要件はありません。しかし、科学界や標準化団体では、コンタクトレンズケア製品の消毒効果を定量化するために必要なプロトコルを検討するための継続的な取り組みが行われています6,7。さらに、アカントアメーバは、細胞的および機能的側面がヒトマクロファージに類似しているため、アメーバ自体がもたらす病原性に加えて、他のヒト病原体8をホストし、広める上で重要な役割を果たすことが注目されています。
最近の技術は、アカントアメーバの運動性を定量化することができたと記載されている – これは一般的にブラウン運動の影響をあまり受けない 9,10 – 細胞変性の影響や電界9,11への曝露不足、ならびにアカントアメーバを追跡可能なウイルスベクター12として使用した巨大ウイルス研究における運動性分析の進歩に関して、13.また、ここで使用されているイメージングソフトウェアのような新しいソフトウェアプログラムや、新しいアルゴリズムや深層学習技術14を使用して、過去20年間で細胞と粒子の追跡にも絶え間ない大幅な改善が見られました。しかし、これはベンチトップ研究、臨床応用、および工業規格に関する比較的新しく成長している科学分野であり、特にコンタクトレンズの着用後またはコンタクトレンズ消毒中または消毒後の行動変化を定量化するために、このアメーバを視覚化および追跡する方法に関するデータは不足しています。長期の目視モニタリングに拡大する他の分野も、この取り組みを支えています15,16,17。アカンタメーバは、プラスミドに対する一般的な耐性(蛍光を発する可能性がある)、アメーバが標準的な細胞色素を消費して破壊する能力、抗体の標識を困難にするユニークな外側タンパク質構成など、本質的に困難な性質を持っているため、明視野イメージング以外の設定で他の細胞がそれらを可視化する方法は、この生物では使用できませんでした。したがって、このアメーバの運動性を定量化することは、この分野への重要な追加を示しています。ここで述べた方法を用いて、アメーバは栄養素18なしで少なくとも12時間運動性を維持すること、そして消毒プロセスに挑戦して消毒中に運動性を停止したアメーバは、完全に溶解されていなくても消毒後に運動性を回復することができることを確認することができた19。
このプロトコルでは、アメーバの運動性を顕微鏡で視覚的に追跡し、定量化する方法を詳しく説明しています。主なステップは、画像間の適切な焦点とタイミングを使用して明視野でアメーバを記録し、イメージングソフトウェアを使用して画像をバイナリに変換し、イメージングソフトウェアの追跡プラグインを使用して実験パラメータを設定し、各アメーバを追跡して速度、距離、閉じ込めなどの必要な測定値を決定することです。これに続いて、方向性を定義するために、アメーバまたはアメーバ集団の走化性を定量化することが可能です。この方法の主な貢献は、栄養サポート、表面付着、消毒の課題、または哺乳類細胞培養との同居などの他の環境変化のさまざまな状態でのアメーバの行動を視覚化および定量化することです。
Protocol
Representative Results
Discussion
アカンタメーバのようなアメーバの運動性を追跡し定量化できることは、低速のブラウン運動の影響を受けない付着微生物である9,10、アメーバの行動に関するかなりの量の情報を明らかにし、AK予防方法に関する啓発を大幅に高めることができる。このプロトコルは、最近の出版物で詳述されており、データは他の同様のデータ分析18,19によって確認されているか、または組み合わされている。ここで、この方法を使用して詳述されたアメーバの速度は、他のグループによって発表されたものと類似していることに注意します。このプロトコルは、光に対して透明な基本的にあらゆる表面またはアメーバ処理に使用できる能力で注目に値しますが、このプロトコルは他の生物と機能するように変更される可能性がありますが、これまでのところアカンタメーバ用に最適化されているだけであることに注意することが重要です。上記のプロトコルはラボで一貫してうまく機能していますが、他のニーズに合わせてメソッドを変更したり、困難な状況をトラブルシューティングしたりするために、次の変更が加えられています。
トラッキングパラメータの決定:上記のプロトコルでは、フレーム間リンク、ギャップクローズ、最大フレームギャップ、およびトラック上のスポット数がリストされており、これらは最近の出版物に最も適していました。ただし、他のパラメーターが他のニーズにより適している可能性があります。さらに、他のユーザーが使用したいのにここでは使用されていないパラメーター (トラック フィルターの下のトラックの最大距離など) がある場合があります。各パラメータの詳細とそれらが説明している内容については、こちらのWebサイト(参照21を参照)でアクセスできます。どのパラメータとフィルターが他の実験に最も関連し、どのように設定すべきかを決定する際には、特定のプロジェクトにとって統計的に何が合理的であるかを考えてください。たとえば、アメーバが歩き去り、その後視野に戻るデータが必要になるでしょうか?それとも、まったく動かなかったにもかかわらず、トラックとしてタグ付けされたアメーバのデータを保持したいのでしょうか?また、画像が記録されたときのフレーム数とフレーム間の時間の長さに意味があるものは何ですか。
ブロブサイズの変更:現在の技術や標準的なラボで利用可能なソフトウェアに基づくソフトウェアや顕微鏡のセットアップでは、時間の経過とともに変化するアメーバの数を骨材内で正確に追跡することは非常に難しいことがわかりました。ブロブのサイズを追跡し、そのサイズをその中の生物の数と関連付けようとする場合は、実験を繰り返した後に生成された標準曲線を使用して、集合体のサイズを数学的に予測します。たとえば、凝集体は、ウェルあたり8、16、32、125、250、500、1,000、2,000セルなど、さまざまな数のアメーバをウェルに播種することによって作成されました。各ウェルのさまざまな時点における24時間のタイムラプス画像を生成しました。各スフェロイド(既知の数のアメーバ)を2次元領域について分析し、アメーバ数とスフェロイドサイズの経時変化の関数として標準曲線を生成しました。この実験は、生成された曲線の適切な標準偏差を得るために、少なくとも3回で繰り返されました。
アメーバの方向性の決定:これは特定の研究には必要ではないかもしれませんが、アメーバの方向性を理解することは役立つ場合があります。これにより、治療または実験の走化性効果に関するデータが得られます。このデータは、ビジュアル (グラフィック) データと定量的データの両方を作成するためにも使用できます。これは、イメージングソフトウェア用の無料プラグインであるChemotaxis and Migration Toolから利用できます。応募ガイド、サンプル画像・動画( 資料表参照)とともに、ウェブサイト上で公開しています。
詳細な移動ダイナミクス:他のグループは、ここで議論されているものを超えて、高度に高度で開発された統計分析を使用して、拡散ダイナミクスと拡散軌道を調査しました9,10,22。これらは、ユーザーのニーズに基づいて検討できます。
成功した方法と同様に、この原稿で詳述されているプロトコルは、一貫性を達成するために何度もトラブルシューティングを経てきました。優れた高品質の追跡可能なビデオは、毎秒(または顕微鏡で可能な限り速く、1秒未満)の画像を撮影することで作成できますが、これにより非常に大きなファイルが作成され、作業が難しくなる可能性があります。これは、最大で数分間録画された非常に短時間のビデオにのみ現実的に適しています。逆に、数秒ごとに画像を撮影することで、アメーバの行動はこの種の速度に基づいてまだ非常に追跡可能であり、数時間または数日にわたって実行可能なビデオを作成できることがわかりました。画像間の最大時間は30秒であり、これはアメーバがイメージングソフトウェアによって正確に追跡されるために必要な時間であることがわかりました。ユーザーが選択する時間間隔は、顕微鏡が画像を記録できる速度、ウェルごとに必要な画像の数、および各間隔で記録されるウェルの数という既知の制約を使用して検討する必要があります。同様に、このプロトコルで言及されている最大変位、許容フレームギャップ、必要な最小フレームなどに関するパラメータは、このラボが試行錯誤を通じて決定し、最も完全なアメーバトラックを含むトラック情報を作成し、不完全なトラックによって生成されるノイズ、ビデオの途中でステージに参加または離れるアメーバ、または2つのアメーバがトラックの途中で出会ってから分離するなどのイメージングソフトウェアの混乱によって生成されるエラーを無視します。このようなエラーや不完全なトラックは、常に相互に相互作用している微細な生物の非常に長い(数時間から数日)ビデオを作成するときには当然のことながら高く、そのためにエラーのあるトラックの大部分を拒否する必要があります。このラボの経験では、プロトコルの穴埋めステップは、イメージングソフトウェアがアメーバを追跡する方法のエラーを減らすために重要であることに注意すべきです。各アメーバがドーナツやC字型ではなく、実線の円であることを確認することで、ソフトウェアは各アメーバを成功裏に追跡できる可能性がはるかに高くなります。
さらに、説明したように、ユーザーが画像またはビデオを分析するために利用できる多くのパラメーターがあります。実験的なニーズに基づいて、総距離、最大距離、速度、および変位の分析から一貫して最も恩恵を受けています。これらについては、以前の出版物18,19でグラフィカルな解釈とともに詳細に説明されています(異なるひずみと表面の使用を含む)。これらの4つのパラメータにより、ユーザーはアメーバが直線距離を移動する能力とそれにかかる時間を推定することができ、コンタクトレンズの汚染に関連するアメーバの行動を理解するのに役立ちます。これらのパラメータを取得して分析することは、図で詳しく説明されているように、大きな作業です。イメージングソフトウェアの出力から大規模で多数のスプレッドシートを扱いながら、必要なすべての分析を自動計算するロックされたスプレッドシートテンプレートを作成することで、意図しないエラーを制限しました。ただし、この方法の改善点として考えられるのは、このデータを処理し、並べ替えて分析できるスクリプトを作成することです。
結論として、ここでは、さまざまな条件で アカントアメーバ のサイズと運動性を測定するためのアクセス可能で正確な方法について説明します。私たちは、この方法が多くの異なるアメーバ株に適用できることを実証し、運動性情報を得るための単純なパラメータがあるかもしれない一方で、この実験セットアップは任意の特定のニーズに合わせて高度に調整できることを概説しました。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、Alcon Research, LLCによって資金提供されました。
Materials
| ¼ Ringer’s solution | ThermoFisher Scientific | BR0052G | Oxoid Ringers Solution Tablets. Follow directions to make one-quarter strength instead of full strength Ringers. |
| 10 µL pipette | Eppendorf Research | 3123000039 | 2 µL-20 µL single channel |
| 10 µL pipette tips | Neptune Scientific, San Diego, CA, USA | BT10.N | 10 µL Universal Barrier Tip |
| 48 well plate | Millipore Sigma, | CLS3548 | Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid |
| 50 mL conical tubes (1 for each sample, 1 for each pass 2 sample) | Fisher Scientific | Falcon 352098 | Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge Tubes, polypropylene |
| 96-well plate | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | CLS3596 | Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid |
| Acanthamoeba | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | ATCC 30461 | This protocol has been verified for ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115, and PRA-411 |
| Axenic culture media (AC6) | Made in house | n/a | Containing 20 g biosate peptone, 5 g glucose, 0.3 g KH2PO4, 10 µg vitamin B12, and 1 glass5 mg l-methionine per liter of distilled deionized water. Adjust pH to 6.6-6.95 with 1 M NaOH and autoclave at 121 °C for 20 min, store at room temperature for up to 3 months. |
| Centrifuge and appropriate rotor | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Sorvall ST 40R | Any equivalent centrifuge and rotor are acceptable so long as it can spin 50 mL conical tubes at 500 x g for 5 min |
| Chemotaxis and Migration Tool | Free software based on ImageJ, available at https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html | ||
| Disposable hemocytometer | Bulldog Bio, Portsmouth, NH, USA | DHC-N01 | Neubauer Improved 2-Chip Disposable Hemocytometer, Individually packaged, Nonpyrogenic |
| ImageJ software with Trackmate plugin (this protocol written with Trackmate version 6.0.2.) | Free software developed by the National Institutes of Health, available at imagej.net. Trackmate plugin available at https://imagej.net/plugins/trackmate/ | ||
| Microscope, preferably with automated moveable stage | Nikon, Tokyo, Japan | A Nikon Eclipse Ti-U Microscope was used in this study and the automated moveable stage was utilized to be able to record images in multiple wells at a time. | |
| NIS-Elements software | Nikon | ||
| Serological pipette | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | BrandTech 26331 | BrandTech accu-jet pro Pipet Controller |
| Serological pipette tips | VWR | 5 mL: 76201-710 10 mL: 170356 25 mL: 89130-900 50 mL: 75816-088 |
VWR Serological Pipette, Non-Pyrogenic |
| Sterile aluminum transmission flow cell | Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT, USA | FC 81-AL | Anodized aluminum single channel transmission flow cell with 96-well plate footprint for use with an inverted microscope |
| T75 Flasks | VWR, Radnor, PA, USA | 734-2316 | VWR Tissue Culture Flask, 182.5 cm, Surface treated, Plug seal cap, Sterile |
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