Quantificazione di Acanthamoeba spp. Motilità
Summary
Questa procedura descrive come visualizzare, tracciare e quantificare Acanthamoeba spp. motilità.
Abstract
La cheratite da Acanthamoeba è una grave infezione oculare che pone sfide terapeutiche e può portare alla cecità. Nonostante la sua ubiquità e la potenziale contaminazione delle lenti a contatto dopo l’esposizione all’acqua, il comportamento naturale di questo agente patogeno rimane sfuggente. Comprendere i modelli di movimento dell’Acanthamoeba può informarci su come colonizza le lenti a contatto e contamina la cornea del paziente. È una fortuna che Acanthamoeba spp. sono visibili tramite microscopia in campo chiaro a partire da un ingrandimento 4x. Precedenti tecniche sono state sviluppate per quantificare la motilità di Acanthamoeba in relazione agli effetti citopatici o alla sottoesposizione al campo elettrico. Qui, descriviamo un metodo per tracciare e quantificare Acanthamoeba spp. Motilità a lungo termine (da ore a giorni), che è un protocollo applicabile a più ceppi di ameba, superfici e stato nutrizionale dell’ameba. Questa procedura è fondamentale per determinare molte quantificazioni della motilità del nucleo, come la distanza, la velocità, il confinamento e la direzionalità, necessarie per monitorare le diverse fasi dell’infezione, della proliferazione o del cambiamento comportamentale.
Introduction
La ricerca sull’Acanthamoeba è aumentata notevolmente negli ultimi anni a causa dell’aumento della prevalenza della cheratite da Acanthamoeba (AK), che è un’infezione parassitaria a seguito dell’attaccamento di Acanthamoeba alla cornea1. Sebbene i focolai di AK possano essere attribuiti a una cura inappropriata delle lenti a contatto o a soluzioni inefficaci per la cura delle lenti a contatto 2,3,4,5, attualmente non ci sono requisiti per dimostrare l’efficacia della disinfezione di Acanthamoeba per qualsiasi prodotto sul mercato. Tuttavia, c’è uno sforzo continuo nella comunità scientifica e all’interno delle organizzazioni di standardizzazione per esaminare i protocolli necessari per quantificare l’efficacia della disinfezione dei prodotti per la cura delle lenti a contatto 6,7. Inoltre, a causa della sua somiglianza negli aspetti cellulari e funzionali con i macrofagi umani, l’Acanthamoeba è stata notata per avere un ruolo significativo nell’ospitare e diffondere altri patogeni umani8, oltre alla patogenicità che l’ameba stessa apporta.
Sono state descritte tecniche recenti che sono state in grado di quantificare la motilità di Acanthamoeba – che generalmente non è altamente soggetta al movimento browniano 9,10 – per quanto riguarda gli effetti citopatici o la sottoesposizione al campo elettrico 9,11, così come i progressi nell’analisi della motilità nella ricerca sui virus giganti utilizzando Acanthamoeba come vettore virale tracciabile 12, 13. Negli ultimi 20 anni ci sono stati anche miglioramenti costanti e significativi nel tracciamento di cellule e particelle utilizzando nuovi programmi software come il software di imaging utilizzato qui, e nuovi algoritmi e tecnologie di deep learning14. Tuttavia, questo è un campo scientifico relativamente nuovo e in crescita per quanto riguarda la ricerca da banco, l’applicazione clinica e gli standard industriali, e c’è stata una scarsità di dati pubblicati riguardo ai metodi per visualizzare e tracciare questa ameba, in particolare al fine di quantificare i cambiamenti comportamentali in seguito all’aderenza alle lenti a contatto o durante o dopo la disinfezione delle lenti a contatto. Altri campi che si espandono nel monitoraggio visivo a lungo termine hanno sostenuto questo sforzo 15,16,17. A causa della natura intrinsecamente impegnativa dell’Acanthamoeba – tra cui una resistenza generale ai plasmidi (che potrebbe conferire fluorescenza), la capacità dell’ameba di consumare e distruggere i coloranti cellulari standard e una composizione proteica esterna unica – che rende difficile la marcatura degli anticorpi – i metodi disponibili per altre cellule che li rendono visibili in contesti diversi dall’imaging in campo chiaro sono stati inutilizzabili in questo organismo. Pertanto, la quantificazione della motilità di questa ameba ha dimostrato un’aggiunta significativa al campo. Utilizzando il metodo qui descritto, siamo stati in grado di accertare che l’ameba rimane mobile per almeno 12 ore senza nutrienti18 e che l’ameba che viene sfidata con un processo di disinfezione e cessa la motilità durante la disinfezione può recuperare la propria motilità dopo la disinfezione se non viene completamente lisata19.
Questo protocollo descrive in dettaglio come tracciare e quantificare visivamente la motilità dell’ameba al microscopio. I passaggi principali consistono nel registrare l’ameba in campo chiaro utilizzando la messa a fuoco e la tempistica appropriate tra le immagini, trasformare le immagini in binarie utilizzando il software di imaging e quindi utilizzare il plug-in di tracciamento di un software di imaging per impostare i parametri sperimentali e seguire ogni ameba per determinare le misure richieste come velocità, distanza e confinamento. Successivamente, è possibile quantificare la chemiotassi di un’ameba o di una popolazione di ameba al fine di definire la direzionalità. Il contributo chiave di questo metodo è quello di visualizzare e quantificare il comportamento dell’ameba durante diversi stati di supporto nutrizionale, aderenza superficiale, sfida di disinfezione o altre alterazioni ambientali come la coabitazione con colture cellulari di mammifero.
Protocol
Representative Results
Discussion
Essere in grado di tracciare e quantificare la motilità di amebe come Acanthamoeba, che sono organismi microscopici aderenti non influenzati dal movimento browniano a bassa velocità 9,10, rivela una notevole quantità di informazioni sul comportamento dell’ameba e può migliorare notevolmente l’illuminazione riguardo ai metodi di prevenzione dell’AK. Questo protocollo è stato dettagliato in recenti pubblicazioni e i dati sono stati confermati o combinati con altre analisi di dati simili18,19. Notiamo qui che la velocità dell’ameba descritta con questo metodo è simile a quella che è stata pubblicata da altri gruppi. Questo protocollo è notevole per la sua capacità di essere utilizzato praticamente su qualsiasi trattamento di superficie o ameba, che è trasparente alla luce, ma è importante notare che mentre questo protocollo potrebbe potenzialmente essere modificato per funzionare con altri organismi, è stato finora ottimizzato solo per Acanthamoeba. Il protocollo di cui sopra ha sempre funzionato bene in laboratorio, ma vengono fornite le seguenti modifiche per modificare il metodo in base ad altre esigenze o risolvere situazioni difficili.
Determinazione dei parametri di tracciamento: Nel protocollo di cui sopra, sono stati elencati il collegamento frame-to-frame, la chiusura del gap, il gap massimo di frame e il numero di punti sulla traccia, che erano i più applicabili per le pubblicazioni recenti. Tuttavia, è possibile che altri parametri siano più adatti ad altre esigenze. Inoltre, potrebbero esserci parametri che altri utenti vorrebbero utilizzare ma che non sono stati utilizzati qui (come la distanza massima di una traccia sotto i filtri della traccia). Ulteriori informazioni su ciascun parametro e su ciò che descrivono sono disponibili qui sul sito Web (vedi riferimento21). Quando decidi quali parametri e filtri sono più rilevanti per altri esperimenti e come dovrebbero essere impostati, pensa a ciò che è statisticamente razionale per un progetto specifico; Ad esempio, si vorrebbero i dati di un’ameba che si allontana e poi torna nel campo visivo? O si vorrebbero conservare i dati di un’ameba che non si è mossa molto ma è stata comunque etichettata come una traccia? e cosa ha senso per il numero di fotogrammi e il periodo di tempo tra i fotogrammi in cui le immagini sono state registrate.
Cambiamento delle dimensioni dei blob: abbiamo scoperto che è estremamente difficile con qualsiasi software o configurazione del microscopio – basata sulle tecnologie attuali e sui software disponibili per i laboratori standard – tracciare con precisione il numero di amebe in un aggregato mentre cambia nel tempo. Se si tiene traccia della dimensione di un blob e si cerca di correlare tale dimensione con il numero di organismi in esso contenuti, utilizzare una curva standard generata dopo esperimenti ripetuti per prevedere matematicamente la dimensione di un aggregato. Ad esempio, gli aggregati sono stati creati seminando pozzi con un intervallo di numeri di amebe, come 8, 16, 32, 125, 250, 500, 1.000 e 2.000 cellule per pozzetto. Sono state generate immagini timelapse in vari punti temporali di ciascun pozzo per 24 ore. Ogni sferoide (che era di un numero noto di amebe) è stato analizzato per un’area bidimensionale ed è stata generata una curva standard in funzione del conteggio delle amebe rispetto alle dimensioni degli sferoidi nel tempo. Questo esperimento è stato ripetuto almeno in triplice copia per darci una deviazione standard appropriata di qualsiasi curva generata.
Determinare la direzionalità dell’ameba: anche se questo potrebbe non essere necessario per studi particolari, può essere utile comprendere la direzionalità dell’ameba. Ciò fornirebbe dati sugli effetti chemiotattici del trattamento o dell’esperimento. Questi dati possono essere utilizzati anche per creare dati visivi (grafici) e quantitativi. Questo è disponibile tramite lo strumento Chemiotassi e migrazione, che è un plug-in gratuito per il software di imaging. È disponibile sul sito Web insieme alla guida all’applicazione e alle immagini e ai filmati di esempio (vedere la tabella dei materiali).
Dinamiche di movimento dettagliate: altri gruppi hanno esaminato le dinamiche di diffusione e le traiettorie diffusive con analisi statistiche altamente avanzate e sviluppate oltre a quanto discusso qui 9,10,22. Questi potrebbero essere presi in considerazione in base alle esigenze dell’utente.
Come per ogni metodo di successo, il protocollo descritto in questo manoscritto è stato sottoposto a molti cicli di risoluzione dei problemi per raggiungere la coerenza. Sebbene sia possibile realizzare eccellenti video tracciabili di alta qualità scattando un’immagine ogni secondo (o alla velocità massima consentita dal microscopio, potrebbe essere inferiore a un secondo), questo crea file estremamente grandi, con cui può essere difficile lavorare. Questo è realisticamente adatto solo per video a brevissimo termine registrati per un massimo di pochi minuti. Al contrario, scattando un’immagine ogni pochi secondi, abbiamo scoperto che il comportamento dell’ameba è ancora molto tracciabile in base alla velocità di questa specie, ed è possibile creare video praticabili nell’arco di ore o giorni. Abbiamo scoperto che la quantità massima di tempo tra le immagini è di 30 s, che è il tempo necessario affinché l’ameba venga tracciata con precisione dal software di imaging. L’intervallo di tempo scelto dall’utente deve essere considerato utilizzando i vincoli noti della velocità con cui il microscopio può registrare le immagini, quante immagini per pozzetto sono necessarie e quanti pozzetti vengono registrati ad ogni intervallo. Allo stesso modo, i parametri menzionati in questo protocollo riguardanti lo spostamento massimo, gli spazi tra i fotogrammi consentiti, i fotogrammi minimi necessari e così via, sono stati determinati attraverso tentativi ed errori da questo laboratorio per creare informazioni sulla traccia che includono le tracce di ameba più complete e ignorano il rumore creato da tracce incomplete, ameba che si unisce o lascia il palco a metà video o errori creati dalla confusione del software di imaging come quando due ameba si incontrano a metà traccia e poi si separano. Questi tipi di errori e tracce incomplete sono comprensibilmente alti quando si creano video estremamente lunghi (da ore a giorni) di organismi biologici microscopici che interagiscono costantemente tra loro e sono la ragione per cui una parte molto grande delle tracce errate deve essere rifiutata. Va notato che la fase di riempimento dei fori nel protocollo è, secondo l’esperienza di questo laboratorio, importante per ridurre l’errore nel modo in cui il software di imaging traccia l’ameba. Assicurandosi che ogni ameba sia un cerchio pieno anziché, a volte, una ciambella o una forma a c, è molto più probabile che il software sia in grado di tracciare con successo ogni ameba.
Inoltre, come discusso, ci sono molti parametri disponibili per un utente per analizzare un’immagine o un video. Sulla base delle esigenze sperimentali, abbiamo costantemente beneficiato al massimo dall’analisi della distanza totale, della distanza massima, della velocità e dello spostamento. Questi sono discussi in profondità (incluso l’uso di diverse deformazioni e superfici) con interpretazioni grafiche in precedenti pubblicazioni18,19. Questi quattro parametri consentono a un utente di estrapolare la capacità di un’ameba di percorrere distanze lineari e quanto tempo impiega per farlo, il che aiuta a comprendere il suo comportamento in relazione alla contaminazione delle lenti a contatto. Il recupero e l’analisi di questi parametri è un lavoro impegnativo, come descritto in dettaglio nelle nostre cifre. Mentre lavoravamo con fogli di calcolo di grandi dimensioni e numerosi dall’output del software di imaging, abbiamo limitato gli errori involontari creando modelli di fogli di calcolo bloccati che calcolavano automaticamente tutte le analisi richieste. Tuttavia, un possibile miglioramento di questo metodo consiste nello scrivere uno script in grado di gestire questi dati, ordinarli e analizzarli.
In conclusione, qui viene descritto un metodo accessibile e accurato per misurare le dimensioni e la motilità di Acanthamoeba in molte condizioni diverse. Abbiamo dimostrato che questo metodo può essere applicato a molti ceppi diversi di ameba e abbiamo sottolineato che, sebbene possano esserci parametri semplici per ottenere informazioni sulla motilità, questa configurazione sperimentale può essere altamente adattata a qualsiasi esigenza specifica.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da Alcon Research, LLC.
Materials
| ¼ Ringer’s solution | ThermoFisher Scientific | BR0052G | Oxoid Ringers Solution Tablets. Follow directions to make one-quarter strength instead of full strength Ringers. |
| 10 µL pipette | Eppendorf Research | 3123000039 | 2 µL-20 µL single channel |
| 10 µL pipette tips | Neptune Scientific, San Diego, CA, USA | BT10.N | 10 µL Universal Barrier Tip |
| 48 well plate | Millipore Sigma, | CLS3548 | Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid |
| 50 mL conical tubes (1 for each sample, 1 for each pass 2 sample) | Fisher Scientific | Falcon 352098 | Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge Tubes, polypropylene |
| 96-well plate | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | CLS3596 | Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid |
| Acanthamoeba | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | ATCC 30461 | This protocol has been verified for ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115, and PRA-411 |
| Axenic culture media (AC6) | Made in house | n/a | Containing 20 g biosate peptone, 5 g glucose, 0.3 g KH2PO4, 10 µg vitamin B12, and 1 glass5 mg l-methionine per liter of distilled deionized water. Adjust pH to 6.6-6.95 with 1 M NaOH and autoclave at 121 °C for 20 min, store at room temperature for up to 3 months. |
| Centrifuge and appropriate rotor | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Sorvall ST 40R | Any equivalent centrifuge and rotor are acceptable so long as it can spin 50 mL conical tubes at 500 x g for 5 min |
| Chemotaxis and Migration Tool | Free software based on ImageJ, available at https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html | ||
| Disposable hemocytometer | Bulldog Bio, Portsmouth, NH, USA | DHC-N01 | Neubauer Improved 2-Chip Disposable Hemocytometer, Individually packaged, Nonpyrogenic |
| ImageJ software with Trackmate plugin (this protocol written with Trackmate version 6.0.2.) | Free software developed by the National Institutes of Health, available at imagej.net. Trackmate plugin available at https://imagej.net/plugins/trackmate/ | ||
| Microscope, preferably with automated moveable stage | Nikon, Tokyo, Japan | A Nikon Eclipse Ti-U Microscope was used in this study and the automated moveable stage was utilized to be able to record images in multiple wells at a time. | |
| NIS-Elements software | Nikon | ||
| Serological pipette | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | BrandTech 26331 | BrandTech accu-jet pro Pipet Controller |
| Serological pipette tips | VWR | 5 mL: 76201-710 10 mL: 170356 25 mL: 89130-900 50 mL: 75816-088 |
VWR Serological Pipette, Non-Pyrogenic |
| Sterile aluminum transmission flow cell | Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT, USA | FC 81-AL | Anodized aluminum single channel transmission flow cell with 96-well plate footprint for use with an inverted microscope |
| T75 Flasks | VWR, Radnor, PA, USA | 734-2316 | VWR Tissue Culture Flask, 182.5 cm, Surface treated, Plug seal cap, Sterile |
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