Quantifizierung von Acanthamoeba spp. Motilität
Summary
Dieses Verfahren beschreibt, wie Acanthamoeba spp. visualisiert, verfolgt und quantifiziert wird.Motilität.
Abstract
Die Akanthamöben-Keratitis ist eine schwere Augeninfektion, die eine Herausforderung für die Behandlung darstellt und zur Erblindung führen kann. Trotz seiner Allgegenwart und der potenziellen Kontamination von Kontaktlinsen nach Wasserkontakt bleibt das natürliche Verhalten dieses Erregers schwer fassbar. Das Verständnis der Bewegungsmuster von Akanthamöben kann uns Aufschluss darüber geben, wie sie Kontaktlinsen besiedelt und die Hornhaut des Patienten kontaminiert. Es ist ein Glück, dass Acanthamoeba spp. sind mittels Hellfeldmikroskopie ab 4-facher Vergrößerung sichtbar. Bisherige Techniken wurden entwickelt, um die Motilität von Akanthamöben im Hinblick auf zytopathische Effekte oder Unterexposition gegenüber dem elektrischen Feld zu quantifizieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Verfolgung und Quantifizierung von Acanthamoeba spp. Motilität langfristig (Stunden bis Tage), ein Protokoll, das auf mehrere Amöbenstämme, Oberflächen und den Ernährungszustand von Amöben anwendbar ist. Dieses Verfahren ist wichtig für die Bestimmung vieler Quantifizierungen der Kernmotilität, wie z. B. Entfernung, Geschwindigkeit, Einschluss und Richtung, die zur Überwachung verschiedener Stadien der Infektion, Proliferation oder Verhaltensänderung erforderlich sind.
Introduction
Die Akanthamöbenforschung hat in den letzten Jahren aufgrund der zunehmenden Prävalenz der Akanthamöben-Keratitis (AK), einer parasitären Infektion nach der Anheftung von Akanthamöben an die Hornhaut, dramatisch zugenommen1. Während Ausbrüche von AK auf eine unsachgemäße Kontaktlinsenpflege oder unwirksame Kontaktlinsenpflegelösungen zurückzuführen sind 2,3,4,5, gibt es derzeit keine Anforderungen zum Nachweis der Desinfektionswirksamkeit von Akanthamöben für irgendein Produkt auf dem Markt. In der wissenschaftlichen Gemeinschaft und innerhalb der Normungsorganisationen gibt es jedoch laufende Bemühungen, die Protokolle zu untersuchen, die zur Quantifizierung der Desinfektionswirkung von Kontaktlinsenpflegeprodukten erforderlich sind 6,7. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Akanthamöben aufgrund ihrer Ähnlichkeit in zellulären und funktionellen Aspekten mit menschlichen Makrophagen eine bedeutende Rolle bei der Beherbergung und Verbreitung anderer menschlicher Krankheitserregerspielt 8, zusätzlich zu der Pathogenität, die die Amöbe selbst mit sich bringt.
Neuere Techniken wurden beschrieben, die in der Lage waren, die Motilität von Akanthamöben – die im Allgemeinen nicht stark der Brownschen Bewegung unterliegt 9,10 – im Hinblick auf zytopathische Effekte oder eine Unterexposition gegenüber dem elektrischen Feld 9,11 zu quantifizieren, sowie Fortschritte in der Motilitätsanalyse in der Riesenvirusforschung unter Verwendung von Akanthamöben als verfolgbarem viralen Vektor 12, 13. Schadenfreude In den letzten 20 Jahren gab es auch konstante und signifikante Verbesserungen bei der Zell- und Partikelverfolgung unter Verwendung neuer Softwareprogramme wie der hier verwendeten Bildgebungssoftware sowie neuer Algorithmen und Deep-Learning-Technologien14. Dies ist jedoch ein relativ neues und wachsendes Wissenschaftsgebiet in Bezug auf Tischforschung, klinische Anwendung und industrielle Standards, und es gibt einen Mangel an veröffentlichten Daten zu Methoden zur Visualisierung und Verfolgung dieser Amöbe, insbesondere zur Quantifizierung von Verhaltensänderungen nach dem Ankleben von Kontaktlinsen oder während oder nach der Kontaktlinsendesinfektion. Andere Bereiche, die sich auf die langfristige visuelle Überwachung ausweiten, haben diese Bemühungen unterstützt 15,16,17. Aufgrund der inhärenten Herausforderung von Akanthamöben – einschließlich einer allgemeinen Resistenz gegen Plasmide (die Fluoreszenz verleihen können), der Fähigkeit der Amöbe, Standard-Zellfarbstoffe zu konsumieren und zu zerstören, und einer einzigartigen äußeren Proteinzusammensetzung, die das Markieren von Antikörpern erschwert – waren Methoden, die anderen Zellen zur Verfügung stehen und sie in anderen Umgebungen als der Hellfeldbildgebung sichtbar machen, in diesem Organismus unbrauchbar. Die Quantifizierung der Motilität dieser Amöbe hat somit eine bedeutende Bereicherung für das Feld dargestellt. Mit der hier beschriebenen Methode konnten wir feststellen, dass Amöben ohne Nährstoffe mindestens 12 h lang beweglich bleiben18 und dass Amöben, die mit einem Desinfektionsprozess konfrontiert sind und während der Desinfektion ihre Beweglichkeit einstellen, ihre Beweglichkeit nach der Desinfektion wiedererlangen können, wenn sie nicht vollständig lysiert werden19.
Dieses Protokoll beschreibt, wie die Motilität von Amöben mikroskopisch visuell verfolgt und quantifiziert werden kann. Die Hauptschritte bestehen darin, Amöben im Hellfeld mit dem richtigen Fokus und Timing zwischen den Bildern aufzunehmen, die Bilder mit Hilfe einer Bildgebungssoftware in Binärbilder umzuwandeln und dann das Tracking-Plugin einer Bildgebungssoftware zu verwenden, um die experimentellen Parameter einzustellen und jeder Amöbe zu folgen, um die erforderlichen Messungen wie Geschwindigkeit, Entfernung und Einschluss zu bestimmen. Im Anschluss daran ist es möglich, die Chemotaxis einer Amöbe oder einer Amöbenpopulation zu quantifizieren, um die Richtungsabhängigkeit zu definieren. Der wichtigste Beitrag dieser Methode besteht darin, das Verhalten von Amöben während verschiedener Zustände der Ernährungsunterstützung, der Oberflächenadhärenz, der Desinfektionsherausforderung oder anderer Umweltveränderungen wie dem Zusammenleben mit Säugetierzellkulturen zu visualisieren und zu quantifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Möglichkeit, die Motilität von Amöben wie Akanthamöben zu verfolgen und zu quantifizieren, bei denen es sich um anhaftende mikroskopische Organismen handelt, die von der Brownschen Bewegung mit niedriger Geschwindigkeit nicht beeinflusst werden 9,10, enthüllt eine beträchtliche Menge an Informationen über das Verhalten von Amöben und kann die Aufklärung über AK-Präventionsmethoden erheblich verbessern. Dieses Protokoll wurde in neueren Veröffentlichungen detailliert beschrieben, und die Daten wurden durch andere ähnliche Datenanalysen bestätigt oder mit ihnen kombiniert18,19. Wir stellen hier fest, dass die Geschwindigkeit der Amöben, die mit dieser Methode detailliert wird, ähnlich ist wie die, die von anderen Gruppen veröffentlicht wurde. Dieses Protokoll zeichnet sich dadurch aus, dass es auf praktisch jeder Oberfläche oder Amöbenbehandlung verwendet werden kann, die lichttransparent ist, aber es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll zwar möglicherweise modifiziert werden könnte, um mit anderen Organismen zu funktionieren, aber bisher nur für Akanthamöben optimiert wurde. Das obige Protokoll hat im Labor durchweg gut funktioniert, aber die folgenden Änderungen sind vorgesehen, um die Methode an andere Anforderungen anzupassen oder schwierige Situationen zu beheben.
Bestimmung der Tracking-Parameter: Im obigen Protokoll wurden die Frame-to-Frame-Verknüpfung, das Lückenschließen, der maximale Frame-Abstand und die Anzahl der Spots auf der Spur aufgelistet, die für neuere Veröffentlichungen am besten geeignet waren. Es ist jedoch möglich, dass andere Parameter für andere Anforderungen besser geeignet sind. Darüber hinaus kann es Parameter geben, die andere gerne verwenden würden, die hier aber nicht verwendet wurden (z. B. die maximale Entfernung eines Tracks unter Track-Filtern). Weitere Informationen zu den einzelnen Parametern und deren Beschreibung finden Sie hier auf der Website (siehe Referenz21). Wenn Sie entscheiden, welche Parameter und Filter für andere Experimente am relevantesten sind und wie sie eingestellt werden sollten, denken Sie darüber nach, was für ein bestimmtes Projekt statistisch rational ist. Würde man zum Beispiel Daten von einer Amöbe wollen, die aus dem Sichtfeld verschwindet und dann wieder zurückkehrt? Oder würde man die Daten von einer Amöbe behalten wollen, die sich nicht sehr viel bewegt hat, aber dennoch als Spur markiert wurde? und was für die Anzahl der Frames und die Zeitspanne zwischen den Frames, als die Bilder aufgenommen wurden, sinnvoll ist.
Änderung der Blob-Größe: Wir haben festgestellt, dass es mit jeder Software oder jedem Mikroskop-Setup – basierend auf aktuellen Technologien und Software, die Standardlaboren zur Verfügung steht – extrem schwierig ist, die Anzahl der Amöben in einem Aggregat genau zu verfolgen, während sie sich im Laufe der Zeit ändert. Wenn Sie die Größe eines Blobs verfolgen und versuchen, diese Größe mit der Anzahl der darin enthaltenen Organismen zu korrelieren, verwenden Sie eine Standardkurve, die nach wiederholten Experimenten erstellt wurde, um die Größe eines Aggregats mathematisch vorherzusagen. Zum Beispiel wurden Aggregate durch Aussaat von Vertiefungen mit einer Reihe von Amöbenanzahl, wie 8, 16, 32, 125, 250, 500, 1.000 und 2.000 Zellen pro Vertiefung, erzeugt. Es wurden Zeitrafferbilder zu verschiedenen Zeitpunkten jeder Vertiefung für 24 Stunden erstellt. Jedes Sphäroid (das eine bekannte Anzahl von Amöben aufwies) wurde auf einen zweidimensionalen Bereich analysiert, und es wurde eine Standardkurve als Funktion der Amöbenzahl im Vergleich zur Sphäroidengröße im Laufe der Zeit erstellt. Dieses Experiment wurde mindestens in dreifacher Ausfertigung wiederholt, um eine angemessene Standardabweichung jeder erzeugten Kurve zu erhalten.
Bestimmung der Richtungsabhängigkeit der Amöbe: Während dies für bestimmte Studien möglicherweise nicht notwendig ist, kann es hilfreich sein, die Richtungsabhängigkeit der Amöbe zu verstehen. Dies würde Daten über die chemotaktischen Effekte der Behandlung oder des Experiments liefern. Diese Daten können auch verwendet werden, um sowohl visuelle (grafische) als auch quantitative Daten zu erstellen. Dies ist über das Chemotaxis and Migration Tool möglich, ein kostenloses Plug-in für Imaging-Software. Es ist auf der Website zusammen mit dem Anwendungsleitfaden sowie Beispielbildern und -filmen verfügbar (siehe Materialtabelle).
Detaillierte Bewegungsdynamik: Andere Gruppen haben die Ausbreitungsdynamik und die diffusiven Flugbahnen mit hochentwickelten statistischen Analysen untersucht und statistische Analysen entwickelt, die über das hinausgehen, was hier diskutiert wird 9,10,22. Diese können je nach den Bedürfnissen des Nutzers in Betracht gezogen werden.
Wie bei jeder erfolgreichen Methode hat das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll viele Runden der Fehlerbehebung durchlaufen, um Konsistenz zu erreichen. Während hervorragende, qualitativ hochwertige, verfolgbare Videos erstellt werden können, indem jede Sekunde ein Bild aufgenommen wird (oder so schnell wie das Mikroskop dazu in der Lage ist, kann es weniger als eine Sekunde sein), entstehen dadurch extrem große Dateien, mit denen es schwierig sein kann, zu arbeiten. Dies ist realistischerweise nur für sehr kurzfristige Videos geeignet, die maximal wenige Minuten lang aufgenommen wurden. Umgekehrt haben wir durch die Aufnahme eines Bildes alle paar Sekunden festgestellt, dass das Verhalten von Amöben basierend auf der Geschwindigkeit dieser Spezies immer noch sehr gut verfolgbar ist, und es ist möglich, über Stunden oder Tage hinweg brauchbare Videos zu erstellen. Wir haben festgestellt, dass die maximale Zeitspanne zwischen den Bildern 30 s beträgt, was der Zeit entspricht, die Amöben benötigen, um von einer Bildgebungssoftware genau verfolgt zu werden. Das Zeitintervall, das der Benutzer wählt, sollte unter Berücksichtigung der bekannten Einschränkungen betrachtet werden, wie schnell das Mikroskop Bilder aufnehmen kann, wie viele Bilder pro Vertiefung benötigt werden und wie viele Vertiefungen in jedem Intervall aufgezeichnet werden. In ähnlicher Weise wurden die in diesem Protokoll erwähnten Parameter in Bezug auf die maximale Verschiebung, die zulässigen Frame-Lücken, die minimal benötigten Frames und so weiter durch Versuch und Irrtum von diesem Labor bestimmt, um Spurinformationen zu erstellen, die die vollständigsten Amöbenspuren einschließen, und Rauschen zu ignorieren, das durch unvollständige Spuren erzeugt wird, Amöben, die sich mitten im Video der Bühne verbinden oder diese verlassen, oder Fehler, die durch Verwirrung der Bildgebungssoftware verursacht werden, wie z. B. wenn zwei Amöben sich in der Mitte der Spur treffen und sich dann trennen. Diese Art von Fehlern und unvollständigen Spuren sind verständlicherweise hoch, wenn extrem lange (Stunden bis Tage) Videos von mikroskopisch kleinen biologischen Organismen erstellt werden, die ständig miteinander interagieren und der Grund dafür sind, dass ein sehr großer Teil fehlerhafter Spuren zurückgewiesen werden muss. Es sollte beachtet werden, dass der Schritt zum Füllen von Löchern im Protokoll nach der Erfahrung dieses Labors wichtig ist, um Fehler bei der Verfolgung von Amöben durch die Bildgebungssoftware zu reduzieren. Indem sichergestellt wird, dass jede Amöbe ein fester Kreis ist, anstatt manchmal ein Donut oder eine C-Form, ist es viel wahrscheinlicher, dass die Software in der Lage ist, jede Amöbe erfolgreich zu verfolgen.
Darüber hinaus stehen einem Benutzer, wie bereits erwähnt, viele Parameter zur Analyse eines Bildes oder Videos zur Verfügung. Basierend auf den experimentellen Anforderungen haben wir durchweg am meisten von der Analyse der Gesamtdistanz, der maximalen Entfernung, der Geschwindigkeit und der Verschiebung profitiert. Diese werden in früheren Publikationen (einschließlich der Verwendung verschiedener Dehnungen und Oberflächen) mit grafischen Interpretationen ausführlich diskutiert 18,19. Diese vier Parameter ermöglichen es einem Benutzer, die Fähigkeit einer Amöbe, lineare Entfernungen zurückzulegen, und die Zeit, die sie dafür benötigt, zu extrapolieren, was zum Verständnis ihres Verhaltens in Bezug auf Kontaktlinsenkontamination beiträgt. Das Abrufen und Analysieren dieser Parameter ist eine große Aufgabe, wie unsere Zahlen zeigen. Bei der Arbeit mit großen und zahlreichen Tabellenkalkulationen aus der Ausgabe von Imaging-Software haben wir unbeabsichtigte Fehler begrenzt, indem wir gesperrte Tabellenkalkulationsvorlagen erstellt haben, die alle erforderlichen Analysen automatisch berechnet haben. Eine mögliche Verbesserung dieser Methode besteht jedoch darin, ein Skript zu schreiben, das diese Daten verarbeiten und sortieren und analysieren kann.
Zusammenfassend wird hier eine zugängliche und genaue Methode zur Messung der Größe und Beweglichkeit von Akanthamöben unter vielen verschiedenen Bedingungen beschrieben. Wir haben gezeigt, dass diese Methode auf viele verschiedene Amöbenstämme angewendet werden kann, und skizziert, dass es zwar einfache Parameter für die Gewinnung von Motilitätsinformationen geben kann, dieser Versuchsaufbau jedoch stark auf alle spezifischen Bedürfnisse zugeschnitten werden kann.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Alcon Research, LLC finanziert.
Materials
| ¼ Ringer’s solution | ThermoFisher Scientific | BR0052G | Oxoid Ringers Solution Tablets. Follow directions to make one-quarter strength instead of full strength Ringers. |
| 10 µL pipette | Eppendorf Research | 3123000039 | 2 µL-20 µL single channel |
| 10 µL pipette tips | Neptune Scientific, San Diego, CA, USA | BT10.N | 10 µL Universal Barrier Tip |
| 48 well plate | Millipore Sigma, | CLS3548 | Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid |
| 50 mL conical tubes (1 for each sample, 1 for each pass 2 sample) | Fisher Scientific | Falcon 352098 | Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge Tubes, polypropylene |
| 96-well plate | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | CLS3596 | Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid |
| Acanthamoeba | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | ATCC 30461 | This protocol has been verified for ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115, and PRA-411 |
| Axenic culture media (AC6) | Made in house | n/a | Containing 20 g biosate peptone, 5 g glucose, 0.3 g KH2PO4, 10 µg vitamin B12, and 1 glass5 mg l-methionine per liter of distilled deionized water. Adjust pH to 6.6-6.95 with 1 M NaOH and autoclave at 121 °C for 20 min, store at room temperature for up to 3 months. |
| Centrifuge and appropriate rotor | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Sorvall ST 40R | Any equivalent centrifuge and rotor are acceptable so long as it can spin 50 mL conical tubes at 500 x g for 5 min |
| Chemotaxis and Migration Tool | Free software based on ImageJ, available at https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html | ||
| Disposable hemocytometer | Bulldog Bio, Portsmouth, NH, USA | DHC-N01 | Neubauer Improved 2-Chip Disposable Hemocytometer, Individually packaged, Nonpyrogenic |
| ImageJ software with Trackmate plugin (this protocol written with Trackmate version 6.0.2.) | Free software developed by the National Institutes of Health, available at imagej.net. Trackmate plugin available at https://imagej.net/plugins/trackmate/ | ||
| Microscope, preferably with automated moveable stage | Nikon, Tokyo, Japan | A Nikon Eclipse Ti-U Microscope was used in this study and the automated moveable stage was utilized to be able to record images in multiple wells at a time. | |
| NIS-Elements software | Nikon | ||
| Serological pipette | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | BrandTech 26331 | BrandTech accu-jet pro Pipet Controller |
| Serological pipette tips | VWR | 5 mL: 76201-710 10 mL: 170356 25 mL: 89130-900 50 mL: 75816-088 |
VWR Serological Pipette, Non-Pyrogenic |
| Sterile aluminum transmission flow cell | Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT, USA | FC 81-AL | Anodized aluminum single channel transmission flow cell with 96-well plate footprint for use with an inverted microscope |
| T75 Flasks | VWR, Radnor, PA, USA | 734-2316 | VWR Tissue Culture Flask, 182.5 cm, Surface treated, Plug seal cap, Sterile |
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