Quantification d’Acanthamoeba spp. Motilité
Summary
Cette procédure décrit comment visualiser, suivre et quantifier Acanthamoeba spp. motilité.
Abstract
La kératite à Acanthamoeba est une infection oculaire grave qui pose des problèmes de traitement et peut entraîner la cécité. Malgré son omniprésence et la contamination potentielle des lentilles de contact après une exposition à l’eau, le comportement naturel de cet agent pathogène reste insaisissable. Comprendre les mouvements de l’Acanthamoeba peut nous renseigner sur la façon dont il colonise les lentilles de contact et contamine la cornée du patient. Il est heureux qu’Acanthamoeba spp. sont visibles par microscopie à fond clair à partir d’un grossissement de 4x. Des techniques antérieures ont été développées pour quantifier la motilité d’Acanthamoeba en ce qui concerne les effets cytopathiques ou la sous-exposition au champ électrique. Nous décrivons ici une méthode pour suivre et quantifier Acanthamoeba spp. motilité à long terme (heures à jours), qui est un protocole applicable à plusieurs souches d’amibes, surfaces et état nutritionnel des amibes. Cette procédure est pertinente pour déterminer de nombreuses quantifications de motilité de base, telles que la distance, la vitesse, le confinement et la directionnalité, qui sont nécessaires pour surveiller les différents stades de l’infection, de la prolifération ou du changement de comportement.
Introduction
La recherche sur Acanthamoeba a considérablement augmenté ces dernières années en raison de la prévalence accrue de la kératite à Acanthamoeba (AK), qui est une infection parasitaire suite à la fixation d’Acanthamoeba à la cornée1. Bien que les éclosions de KA puissent être attribuées à un entretien inapproprié des lentilles de contact ou à des solutions inefficaces pour l’entretien des lentilles de contact 2,3,4,5, il n’existe actuellement aucune exigence pour démontrer l’efficacité de la désinfection d’Acanthamoeba pour tout produit sur le marché. Cependant, la communauté scientifique et les organismes de normalisation s’efforcent actuellement d’examiner les protocoles nécessaires pour quantifier l’efficacité de désinfection des produits d’entretien des lentilles de contact 6,7. De plus, en raison de sa ressemblance cellulaire et fonctionnelle avec les macrophages humains, Acanthamoeba a été noté comme ayant un rôle important dans l’hébergement et la dissémination d’autres agents pathogènes humains8, en plus de la pathogénicité que l’amibe elle-même apporte.
Des techniques récentes ont été décrites qui ont permis de quantifier la motilité d’Acanthamoeba – qui n’est généralement pas très sujette au mouvement brownien 9,10 – en ce qui concerne les effets cytopathiques ou la sous-exposition au champ électrique 9,11, ainsi que les progrès de l’analyse de la motilité dans la recherche sur les virus géants utilisant Acanthamoeba comme vecteur viral traçable 12, 13. Planche à billets Au cours des 20 dernières années, le suivi des cellules et des particules s’est également amélioré de manière constante et significative à l’aide de nouveaux logiciels tels que le logiciel d’imagerie utilisé ici, ainsi que de nouveaux algorithmes et de technologies d’apprentissage profond14. Cependant, il s’agit d’un domaine scientifique relativement nouveau et en pleine croissance en ce qui concerne la recherche sur paillasse, les applications cliniques et les normes industrielles, et il y a eu une pénurie de données publiées concernant les méthodes de visualisation et de suivi de cette amibe, en particulier afin de quantifier les changements de comportement après l’adhésion aux lentilles de contact ou pendant ou après la désinfection des lentilles de contact. D’autres domaines s’étendant à la surveillance visuelle à long terme ont soutenu cet effort 15,16,17. En raison de la nature intrinsèquement difficile d’Acanthamoeba – y compris une résistance générale aux plasmides (qui pourraient conférer la fluorescence), la capacité de l’amibe à consommer et à détruire les colorants cellulaires standard et une composition protéique externe unique – rendant difficile le marquage des anticorps – les méthodes disponibles pour d’autres cellules qui les rendent visibles dans des contextes autres que l’imagerie en fond clair ont été inutilisables dans cet organisme. Ainsi, la quantification de la motilité de cette amibe a démontré un ajout significatif au domaine. En utilisant la méthode décrite ici, nous avons pu constater que les amibes restent mobiles pendant au moins 12 h sans nutriments18 et que les amibes qui sont confrontées à un processus de désinfection et cessent leur motilité pendant la désinfection peuvent retrouver leur motilité après la désinfection si elles ne sont pas complètement lysées19.
Ce protocole détaille comment suivre visuellement et quantifier la motilité des amibes au microscope. Les premières étapes consistent à enregistrer les amibes en fond clair en utilisant la mise au point et le timing appropriés entre les images, à transformer les images en binaires à l’aide d’un logiciel d’imagerie, puis à utiliser le plug-in de suivi d’un logiciel d’imagerie pour définir les paramètres expérimentaux et suivre chaque amibe pour déterminer les mesures requises telles que la vitesse, la distance et le confinement. Suite à cela, il est possible de quantifier la chimiotaxie d’une amibe ou d’une population d’amibes afin de définir la directionnalité. La principale contribution de cette méthode est de visualiser et de quantifier le comportement des amibes lors de différents états de soutien nutritionnel, d’adhérence de surface, de défi de désinfection ou d’autres altérations environnementales telles que la cohabitation avec la culture de cellules de mammifères.
Protocol
Representative Results
Discussion
Être capable de suivre et de quantifier la motilité des amibes telles que les Acanthamoeba, qui sont des organismes microscopiques adhérents non affectés par le mouvement brownien à basse vitesse 9,10, révèle une quantité substantielle d’informations sur le comportement des amibes et peut considérablement améliorer l’éclairage sur les méthodes de prévention de l’AK. Ce protocole a été détaillé dans des publications récentes, et les données ont été confirmées ou combinées à d’autres analyses de données similaires18,19. Notons ici que la vitesse des amibes détaillée à l’aide de cette méthode est similaire à ce qui a été publié par d’autres groupes. Ce protocole se distingue par sa capacité à être utilisé sur pratiquement n’importe quelle surface ou traitement d’amibe, qui est transparent à la lumière, mais il est important de noter que même si ce protocole pourrait potentiellement être modifié pour fonctionner avec d’autres organismes, il n’a été optimisé jusqu’à présent que pour Acanthamoeba. Le protocole ci-dessus a toujours bien fonctionné en laboratoire, mais les modifications suivantes sont apportées pour modifier la méthode afin de l’adapter à d’autres besoins ou de résoudre des situations difficiles.
Détermination des paramètres de suivi : Dans le protocole ci-dessus, la liaison d’image à image, la fermeture de l’espace, l’écart maximal entre les images et le nombre de points sur la piste ont été répertoriés, qui étaient les plus applicables pour les publications récentes. Cependant, il est possible que d’autres paramètres soient mieux adaptés à d’autres besoins. De plus, il peut y avoir des paramètres que d’autres aimeraient utiliser mais qui n’ont pas été utilisés ici (tels que la distance maximale d’une piste sous les filtres de piste). Plus d’informations sur chaque paramètre et ce qu’ils décrivent peuvent être consultées ici sur le site Web (voir référence21). Lorsque vous décidez quels paramètres et filtres sont les plus pertinents pour d’autres expériences et comment ils doivent être définis, réfléchissez à ce qui est statistiquement rationnel pour un projet spécifique ; Par exemple, voudrait-on des données d’une amibe qui s’éloigne puis revient dans le champ de vision ? Ou voudrait-on conserver les données d’une amibe qui n’a pas beaucoup bougé du tout mais qui a quand même été étiquetée comme une piste ? et ce qui a du sens pour le nombre d’images et la durée entre les images lorsque les images ont été enregistrées.
Modification de la taille des gouttes : Nous avons constaté qu’il est extrêmement difficile, avec un logiciel ou une configuration de microscope – sur la base des technologies actuelles et des logiciels disponibles pour les laboratoires standard – de suivre avec précision le nombre d’amibes dans un agrégat au fur et à mesure qu’il change au fil du temps. Si vous suivez la taille d’une goutte et essayez de corréler cette taille avec le nombre d’organismes qu’elle contient, utilisez une courbe standard générée après des expériences répétées pour prédire mathématiquement la taille d’un agrégat. Par exemple, les agrégats ont été créés en enfonçant des puits avec une gamme de nombres d’amibes, tels que 8, 16, 32, 125, 250, 500, 1 000 et 2 000 cellules par puits. Des images en accéléré à différents points temporels de chaque puits pendant 24 heures ont été générées. Chaque sphéroïde (qui était d’un nombre connu d’amibes) a été analysé pour une zone bidimensionnelle, et une courbe standard a été générée en fonction du nombre d’amibes par rapport à la taille du sphéroïde au fil du temps. Cette expérience a été répétée au moins en trois exemplaires pour nous donner un écart-type approprié de toute courbe générée.
Déterminer la directionnalité de l’amibe : Bien que cela ne soit peut-être pas nécessaire pour des études particulières, il peut être utile de comprendre la directionnalité de l’amibe. Cela fournirait des données sur les effets chimiotactiques du traitement ou de l’expérience. Ces données peuvent également être utilisées pour créer des données visuelles (graphiques) et quantitatives. Il est disponible via l’outil de chimiotaxie et de migration, qui est un plug-in gratuit pour les logiciels d’imagerie. Il est disponible sur le site Web, accompagné du guide d’application et d’exemples d’images et de films (voir la table des matières).
Dynamique détaillée du mouvement : d’autres groupes ont examiné la dynamique d’expansion et les trajectoires diffusives avec des analyses statistiques très avancées et développées au-delà de ce qui est discuté ici 9,10,22. Ceux-ci pourraient être envisagés en fonction des besoins de l’utilisateur.
Comme pour toute méthode réussie, le protocole détaillé dans ce manuscrit a fait l’objet de nombreuses séries de dépannage pour atteindre la cohérence. Bien qu’il soit possible de réaliser d’excellentes vidéos traçables de haute qualité en prenant une image toutes les secondes (ou, aussi vite que le microscope le peut, cela peut prendre moins d’une seconde), cela crée des fichiers extrêmement volumineux, qui peuvent être difficiles à utiliser. Cela ne convient de manière réaliste qu’aux vidéos à très court terme enregistrées pendant quelques minutes au maximum. À l’inverse, en prenant une image toutes les quelques secondes, nous avons constaté que le comportement des amibes est toujours très traçable en fonction de la vitesse de cette espèce, et il est possible de créer des vidéos exploitables pendant des heures ou des jours. Nous avons constaté que le temps maximum entre les images est de 30 s, ce qui est le temps nécessaire pour que les amibes soient suivies avec précision par un logiciel d’imagerie. L’intervalle de temps choisi par l’utilisateur doit être pris en compte à l’aide des contraintes connues de la vitesse à laquelle le microscope peut enregistrer les images, du nombre d’images par puits nécessaires et du nombre de puits enregistrés à chaque intervalle. De même, les paramètres mentionnés dans ce protocole concernant le déplacement maximal, les écarts d’images autorisés, les images minimales nécessaires, etc., ont été déterminés par essais et erreurs par ce laboratoire pour créer des informations sur les pistes qui incluent les pistes d’amibes les plus complètes et ignorent le bruit créé par les pistes incomplètes, les amibes qui rejoignent ou quittent la scène au milieu de la vidéo, ou les erreurs créées par la confusion du logiciel d’imagerie, comme lorsque deux amibes se rencontrent au milieu de la piste puis se séparent. Ce genre d’erreurs et de traces incomplètes est naturellement élevé lors de la création de vidéos extrêmement longues (de quelques heures à quelques jours) d’organismes biologiques microscopiques qui interagissent constamment les uns avec les autres et sont la raison pour laquelle une très grande partie des pistes erronées doivent être rejetées. Il convient de noter que l’étape de remplissage des trous dans le protocole est, d’après l’expérience de ce laboratoire, importante pour réduire les erreurs dans la façon dont le logiciel d’imagerie suit les amibes. En s’assurant que chaque amibe est un cercle solide au lieu d’un beignet ou d’une forme en C, le logiciel a beaucoup plus de chances de pouvoir suivre chaque amibe avec succès.
De plus, comme nous l’avons vu, il existe de nombreux paramètres à la disposition d’un utilisateur pour l’analyse d’une image ou d’une vidéo. Sur la base des besoins expérimentaux, nous avons toujours tiré le meilleur parti de l’analyse de la distance totale, de la distance maximale, de la vitesse et du déplacement. Celles-ci sont discutées en profondeur (y compris en utilisant différentes déformations et surfaces) avec des interprétations graphiques dans des publications précédentes18,19. Ces quatre paramètres permettent à un utilisateur d’extrapoler la capacité d’une amibe à parcourir des distances linéaires et le temps qu’il lui faut pour le faire, ce qui aide à comprendre son comportement en ce qui concerne la contamination des lentilles de contact. La récupération et l’analyse de ces paramètres est un travail important, comme le détaillent nos chiffres. En travaillant avec de grandes et nombreuses feuilles de calcul à partir de la sortie de logiciels d’imagerie, nous avons limité les erreurs involontaires en créant des modèles de feuilles de calcul verrouillées qui calculaient automatiquement toutes les analyses requises. Cependant, une amélioration possible de cette méthode serait d’écrire un script capable de gérer ces données, de les trier et de les analyser.
En conclusion, une méthode accessible et précise pour mesurer la taille et la motilité d’Acanthamoeba dans de nombreuses conditions différentes est décrite ici. Nous avons démontré que cette méthode peut être appliquée à de nombreuses souches différentes d’amibes et souligné que, bien qu’il puisse y avoir des paramètres simples pour obtenir des informations sur la motilité, cette configuration expérimentale peut être hautement adaptée à des besoins spécifiques.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par Alcon Research, LLC.
Materials
| ¼ Ringer’s solution | ThermoFisher Scientific | BR0052G | Oxoid Ringers Solution Tablets. Follow directions to make one-quarter strength instead of full strength Ringers. |
| 10 µL pipette | Eppendorf Research | 3123000039 | 2 µL-20 µL single channel |
| 10 µL pipette tips | Neptune Scientific, San Diego, CA, USA | BT10.N | 10 µL Universal Barrier Tip |
| 48 well plate | Millipore Sigma, | CLS3548 | Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid |
| 50 mL conical tubes (1 for each sample, 1 for each pass 2 sample) | Fisher Scientific | Falcon 352098 | Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge Tubes, polypropylene |
| 96-well plate | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | CLS3596 | Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid |
| Acanthamoeba | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | ATCC 30461 | This protocol has been verified for ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115, and PRA-411 |
| Axenic culture media (AC6) | Made in house | n/a | Containing 20 g biosate peptone, 5 g glucose, 0.3 g KH2PO4, 10 µg vitamin B12, and 1 glass5 mg l-methionine per liter of distilled deionized water. Adjust pH to 6.6-6.95 with 1 M NaOH and autoclave at 121 °C for 20 min, store at room temperature for up to 3 months. |
| Centrifuge and appropriate rotor | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Sorvall ST 40R | Any equivalent centrifuge and rotor are acceptable so long as it can spin 50 mL conical tubes at 500 x g for 5 min |
| Chemotaxis and Migration Tool | Free software based on ImageJ, available at https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html | ||
| Disposable hemocytometer | Bulldog Bio, Portsmouth, NH, USA | DHC-N01 | Neubauer Improved 2-Chip Disposable Hemocytometer, Individually packaged, Nonpyrogenic |
| ImageJ software with Trackmate plugin (this protocol written with Trackmate version 6.0.2.) | Free software developed by the National Institutes of Health, available at imagej.net. Trackmate plugin available at https://imagej.net/plugins/trackmate/ | ||
| Microscope, preferably with automated moveable stage | Nikon, Tokyo, Japan | A Nikon Eclipse Ti-U Microscope was used in this study and the automated moveable stage was utilized to be able to record images in multiple wells at a time. | |
| NIS-Elements software | Nikon | ||
| Serological pipette | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | BrandTech 26331 | BrandTech accu-jet pro Pipet Controller |
| Serological pipette tips | VWR | 5 mL: 76201-710 10 mL: 170356 25 mL: 89130-900 50 mL: 75816-088 |
VWR Serological Pipette, Non-Pyrogenic |
| Sterile aluminum transmission flow cell | Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT, USA | FC 81-AL | Anodized aluminum single channel transmission flow cell with 96-well plate footprint for use with an inverted microscope |
| T75 Flasks | VWR, Radnor, PA, USA | 734-2316 | VWR Tissue Culture Flask, 182.5 cm, Surface treated, Plug seal cap, Sterile |
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