Kwantificering van Acanthamoeba spp. Motility
Summary
In deze procedure wordt beschreven hoe u Acanthamoeba spp. kunt visualiseren, volgen en kwantificeren.Motility.
Abstract
Acanthamoeba keratitis is een ernstige ooginfectie die behandelingsproblemen met zich meebrengt en tot blindheid kan leiden. Ondanks de alomtegenwoordigheid en mogelijke besmetting van contactlenzen na blootstelling aan water, blijft het natuurlijke gedrag van deze ziekteverwekker ongrijpbaar. Inzicht in de bewegingspatronen van Acanthamoeba kan ons informeren over hoe het contactlenzen koloniseert en het hoornvlies van de patiënt besmet. Het is een geluk dat Acanthamoeba spp. zijn zichtbaar via helderveldmicroscopie vanaf 4x vergroting. Eerdere technieken zijn ontwikkeld om de beweeglijkheid van Acanthamoeba te kwantificeren met betrekking tot cytopathische effecten of te weinig blootstelling aan het elektrische veld. Hier beschrijven we een methode om Acanthamoeba spp. te volgen en te kwantificeren.beweeglijkheid op lange termijn (uren tot dagen), een protocol dat van toepassing is op meerdere amoebestammen, oppervlakken en voedingsstatus van amoeben. Deze procedure is relevant voor het bepalen van veel kwantificeringen van de kernmotiliteit, zoals afstand, snelheid, opsluiting en richting, die nodig zijn om verschillende stadia van infectie, proliferatie of gedragsverandering te volgen.
Introduction
Het onderzoek naar acanthamoeba is de afgelopen jaren dramatisch toegenomen als gevolg van de verhoogde prevalentie van Acanthamoeba keratitis (AK), een parasitaire infectie na de aanhechting van Acanthamoeba aan het hoornvlies. Hoewel uitbraken van AK kunnen worden toegeschreven aan ongepaste contactlensverzorging of ineffectieve contactlensverzorgingsoplossingen 2,3,4,5, zijn er momenteel geen vereisten om de werkzaamheid van Acanthamoeba-desinfectie aan te tonen voor enig product op de markt. Er is echter een voortdurende inspanning in de wetenschappelijke gemeenschap en binnen normalisatie-organisaties om de protocollen te onderzoeken die nodig zijn voor het kwantificeren van de desinfecterende werkzaamheid van contactlensverzorgingsproducten 6,7. Verder is opgemerkt dat Acanthamoeba, vanwege zijn gelijkenis in cellulaire en functionele aspecten met menselijke macrofagen, een belangrijke rol speelt bij het hosten en verspreiden van andere menselijke pathogenen8, naast de pathogeniteit die de amoebe zelf met zich meebrengt.
Er zijn recente technieken beschreven die in staat zijn geweest om de beweeglijkheid van Acanthamoeba – die over het algemeen niet sterk onderhevig is aan Brownse beweging 9,10 – te kwantificeren met betrekking tot cytopathische effecten of onderblootstelling aan het elektrische veld 9,11, evenals vooruitgang in motiliteitsanalyse in onderzoek naar gigantische virussen met behulp van Acanthamoeba als de traceerbare virale vector 12, 13. okt. In de afgelopen 20 jaar zijn er ook constante en aanzienlijke verbeteringen opgetreden in het volgen van cellen en deeltjes met behulp van nieuwe softwareprogramma’s zoals de beeldvormingssoftware die hier wordt gebruikt, en nieuwe algoritmen en deep learning-technologieën14. Dit is echter een relatief nieuw en groeiend wetenschapsgebied met betrekking tot benchtop-onderzoek, klinische toepassing en industriële normen, en er is een gebrek aan gegevens gepubliceerd over methoden om deze amoebe te visualiseren en te volgen, met name om gedragsveranderingen te kwantificeren na het dragen van contactlenzen of tijdens of na desinfectie van contactlenzen. Andere gebieden die zich uitstrekken tot visuele monitoring op lange termijn hebben deze inspanning ondersteund 15,16,17. Vanwege de inherent uitdagende aard van Acanthamoeba – waaronder een algemene resistentie tegen plasmiden (die fluorescentie zouden kunnen verlenen), het vermogen van de amoebe om standaard celkleurstoffen te consumeren en te vernietigen, en een unieke buitenste eiwitsamenstelling – waardoor het labelen van antilichamen moeilijk wordt – zijn methoden die beschikbaar zijn voor andere cellen die ze zichtbaar maken in andere instellingen dan helderveldbeeldvorming onbruikbaar geweest in dit organisme. Het kwantificeren van de beweeglijkheid van deze amoebe heeft dus een significante toevoeging aan het veld aangetoond. Met behulp van de hier beschreven methode hebben we kunnen vaststellen dat amoeben minstens 12 uur beweeglijk blijven zonder voedingsstoffen18 en dat amoeben die worden uitgedaagd met een desinfectieproces en tijdens de desinfectie niet meer bewegen, hun beweeglijkheid na desinfectie kunnen herstellen als ze niet volledig zijn gelyseerd19.
Dit protocol beschrijft hoe de beweeglijkheid van amoeben microscopisch kan worden gevolgd en gekwantificeerd. De primaire stappen zijn het opnemen van amoebe in helderveld met behulp van de juiste focus en timing tussen beelden, het omzetten van de afbeeldingen in binair met behulp van beeldvormingssoftware en vervolgens het gebruik van de tracking-plug-in van een beeldvormingssoftware om de experimentele parameters in te stellen en elke amoebe te volgen om de vereiste metingen te bepalen, zoals snelheid, afstand en opsluiting. Hierna is het mogelijk om de chemotaxis van een amoebe of een amoebepopulatie te kwantificeren om directionaliteit te definiëren. De belangrijkste bijdrage van deze methode is het visualiseren en kwantificeren van amoebegedrag tijdens verschillende toestanden van voedingsondersteuning, oppervlaktehechting, desinfectie-uitdaging of andere veranderingen in de omgeving, zoals samenleven met zoogdiercelcultuur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het kunnen volgen en kwantificeren van de beweeglijkheid van amoeben zoals Acanthamoebe, aanhangende microscopische organismen die niet worden beïnvloed door Brownse beweging met lage snelheid 9,10, onthult een aanzienlijke hoeveelheid informatie over het gedrag van amoeben en kan de verlichting met betrekking tot AK-preventiemethoden aanzienlijk verbeteren. Dit protocol is gedetailleerd beschreven in recente publicaties en de gegevens zijn bevestigd door of gecombineerd met andere vergelijkbare gegevensanalyses18,19. We merken hier op dat de snelheid van amoeben die met deze methode worden beschreven, vergelijkbaar is met wat door andere groepen is gepubliceerd. Dit protocol is opmerkelijk vanwege zijn vermogen om te worden gebruikt op vrijwel elk oppervlak of amoebebehandeling, die transparant is voor licht, maar het is belangrijk op te merken dat hoewel dit protocol mogelijk kan worden aangepast om met andere organismen te werken, het tot nu toe alleen is geoptimaliseerd voor Acanthamoeba. Het bovenstaande protocol heeft consequent goed gewerkt in het laboratorium, maar de volgende wijzigingen voor het wijzigen van de methode om aan andere behoeften te voldoen of het oplossen van moeilijke situaties zijn beschikbaar.
Bepalen van trackingparameters: In het bovenstaande protocol zijn de frame-to-frame koppeling, het sluiten van de opening, de maximale frameafstand en het aantal plekken op de baan vermeld, die het meest van toepassing waren op recente publicaties. Het is echter mogelijk dat andere parameters meer geschikt zijn voor andere behoeften. Verder kunnen er parameters zijn die anderen graag zouden willen gebruiken, maar die hier niet zijn gebruikt (zoals de maximale afstand van een spoor onder spoorfilters). Meer informatie over elke parameter en wat ze beschrijven is hier te vinden op de website (zie referentie21). Wanneer u beslist welke parameters en filters het meest relevant zijn voor andere experimenten en hoe ze moeten worden ingesteld, moet u nadenken over wat statistisch rationeel is voor een specifiek project; Zou men bijvoorbeeld gegevens willen van een amoebe die wegloopt en vervolgens weer terug in het gezichtsveld? Of zou men de gegevens willen bewaren van een amoebe die helemaal niet veel bewoog, maar toch als een spoor werd gelabeld? En wat logisch is voor het aantal frames en de tijdsduur tussen frames wanneer de beelden zijn opgenomen.
Veranderende blobgrootte: We ontdekten dat het buitengewoon moeilijk is met software of een microscoopopstelling – op basis van de huidige technologieën en software die beschikbaar is voor standaardlaboratoria – om het aantal amoeben in een aggregaat nauwkeurig te volgen terwijl het in de loop van de tijd verandert. Als u de grootte van een klodder volgt en probeert die grootte te correleren met het aantal organismen erin, gebruik dan een standaardcurve die is gegenereerd na herhaalde experimenten om de grootte van een aggregaat wiskundig te voorspellen. Aggregaten werden bijvoorbeeld gemaakt door putjes te zaaien met een reeks aantallen amoeben, zoals 8, 16, 32, 125, 250, 500, 1.000 en 2.000 cellen per put. Timelapse-beelden op verschillende tijdstippen van elke put gedurende 24 uur werden gegenereerd. Elke sferoïde (die een bekend aantal amoeben had) werd geanalyseerd voor een tweedimensionaal gebied en er werd een standaardcurve gegenereerd als functie van het aantal amoeben versus de sferoïde grootte in de loop van de tijd. Dit experiment werd ten minste in drievoud herhaald om ons een geschikte standaarddeviatie van elke gegenereerde curve te geven.
Het bepalen van de richtingsgevoeligheid van de amoebe: Hoewel dit misschien niet nodig is voor bepaalde onderzoeken, kan het nuttig zijn om de richtingsgevoeligheid van de amoebe te begrijpen. Dit zou gegevens opleveren over de chemotactische effecten van de behandeling of het experiment. Deze gegevens kunnen ook worden gebruikt om zowel visuele (grafische) als kwantitatieve gegevens te creëren. Dit is beschikbaar via de Chemotaxis and Migration Tool, een gratis plug-in voor beeldvormingssoftware. Het is beschikbaar op de website, samen met de toepassingsgids en voorbeeldafbeeldingen en -films (zie Materiaaltabel).
Gedetailleerde bewegingsdynamiek: andere groepen hebben de spreidingsdynamiek en diffuse trajecten onderzocht met zeer geavanceerde en ontwikkelde statistische analyses die verder gaan dan wat hier wordt besproken 9,10,22. Deze kunnen worden overwogen op basis van de behoeften van de gebruiker.
Zoals met elke succesvolle methode, heeft het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, vele rondes van probleemoplossing doorlopen om consistentie te bereiken. Hoewel uitstekende traceerbare video’s van hoge kwaliteit kunnen worden gemaakt door elke seconde een foto te maken (of zo snel als de microscoop kan, het kan minder dan een seconde zijn), ontstaan hierdoor extreem grote bestanden, die moeilijk kunnen zijn om mee te werken. Dit is realistisch gezien alleen geschikt voor zeer korte video’s die maximaal een paar minuten zijn opgenomen. Omgekeerd, door om de paar seconden een foto te maken, hebben we ontdekt dat het gedrag van amoeben nog steeds zeer traceerbaar is op basis van de snelheid van deze soort, en dat het mogelijk is om werkbare video’s te maken over uren of dagen. We hebben ontdekt dat de maximale hoeveelheid tijd tussen beelden 30 s is, wat de tijd is die nodig is om amoeben nauwkeurig te volgen door beeldvormingssoftware. Het tijdsinterval dat de gebruiker kiest, moet worden overwogen aan de hand van de bekende beperkingen van hoe snel de microscoop beelden kan opnemen, hoeveel beelden per putje nodig zijn en hoeveel putjes er bij elk interval worden opgenomen. Evenzo zijn de parameters die in dit protocol worden genoemd met betrekking tot maximale verplaatsing, toegestane frameopeningen, minimaal benodigde frames, enzovoort, door dit lab met vallen en opstaan bepaald om trackinformatie te creëren die de meest complete amoebe-tracks omvat en ruis negeert die wordt veroorzaakt door onvolledige tracks, amoeben die zich halverwege de video bij het podium voegen of het podium verlaten, of fouten die worden veroorzaakt door verwarring door beeldvormingssoftware, zoals wanneer twee amoeben elkaar halverwege de baan ontmoeten en vervolgens scheiden. Dit soort fouten en onvolledige sporen zijn begrijpelijkerwijs hoog bij het maken van extreem lange (uren tot dagen) video’s van microscopisch kleine biologische organismen die constant met elkaar interageren en zijn de reden dat een zeer groot deel van de foutieve sporen moet worden afgewezen. Opgemerkt moet worden dat de stap voor het opvullen van gaten in het protocol, in de ervaring van dit lab, belangrijk is voor het verminderen van fouten in de manier waarop de beeldvormingssoftware amoeben opspoort. Door ervoor te zorgen dat elke amoebe een vaste cirkel is in plaats van soms een donut of een c-vorm, is de kans veel groter dat de software elke amoebe met succes kan volgen.
Verder zijn er, zoals besproken, veel parameters beschikbaar voor een gebruiker voor het analyseren van een afbeelding of video. Op basis van de experimentele behoeften hebben we consequent het meest geprofiteerd van het analyseren van de totale afstand, maximale afstand, snelheid en verplaatsing. Deze worden uitgebreid besproken (inclusief het gebruik van verschillende stammen en oppervlakken) met grafische interpretaties in eerdere publicaties18,19. Deze vier parameters stellen een gebruiker in staat om het vermogen van een amoebe om lineaire afstanden af te leggen te extrapoleren en hoe lang het duurt om dit te doen, wat helpt bij het begrijpen van hun gedrag in relatie tot contactlensbesmetting. Het ophalen en analyseren van deze parameters is een grote klus, zoals beschreven in onze cijfers. Tijdens het werken met grote en talrijke spreadsheets uit de uitvoer van beeldvormingssoftware hebben we onbedoelde fouten beperkt door vergrendelde spreadsheetsjablonen te maken die alle vereiste analyses automatisch berekenden. Een mogelijke verbetering van deze methode zou echter zijn om een script te schrijven dat deze gegevens kan verwerken en sorteren en analyseren.
Tot slot wordt hier een toegankelijke en nauwkeurige methode beschreven om de grootte en beweeglijkheid van Acanthamoeba in veel verschillende omstandigheden te meten. We hebben aangetoond dat deze methode kan worden toegepast op veel verschillende stammen van amoeben en hebben uiteengezet dat, hoewel er eenvoudige parameters kunnen zijn voor het verkrijgen van informatie over beweeglijkheid, deze experimentele opzet in hoge mate kan worden afgestemd op specifieke behoeften.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door Alcon Research, LLC.
Materials
| ¼ Ringer’s solution | ThermoFisher Scientific | BR0052G | Oxoid Ringers Solution Tablets. Follow directions to make one-quarter strength instead of full strength Ringers. |
| 10 µL pipette | Eppendorf Research | 3123000039 | 2 µL-20 µL single channel |
| 10 µL pipette tips | Neptune Scientific, San Diego, CA, USA | BT10.N | 10 µL Universal Barrier Tip |
| 48 well plate | Millipore Sigma, | CLS3548 | Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid |
| 50 mL conical tubes (1 for each sample, 1 for each pass 2 sample) | Fisher Scientific | Falcon 352098 | Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge Tubes, polypropylene |
| 96-well plate | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | CLS3596 | Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid |
| Acanthamoeba | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | ATCC 30461 | This protocol has been verified for ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115, and PRA-411 |
| Axenic culture media (AC6) | Made in house | n/a | Containing 20 g biosate peptone, 5 g glucose, 0.3 g KH2PO4, 10 µg vitamin B12, and 1 glass5 mg l-methionine per liter of distilled deionized water. Adjust pH to 6.6-6.95 with 1 M NaOH and autoclave at 121 °C for 20 min, store at room temperature for up to 3 months. |
| Centrifuge and appropriate rotor | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Sorvall ST 40R | Any equivalent centrifuge and rotor are acceptable so long as it can spin 50 mL conical tubes at 500 x g for 5 min |
| Chemotaxis and Migration Tool | Free software based on ImageJ, available at https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html | ||
| Disposable hemocytometer | Bulldog Bio, Portsmouth, NH, USA | DHC-N01 | Neubauer Improved 2-Chip Disposable Hemocytometer, Individually packaged, Nonpyrogenic |
| ImageJ software with Trackmate plugin (this protocol written with Trackmate version 6.0.2.) | Free software developed by the National Institutes of Health, available at imagej.net. Trackmate plugin available at https://imagej.net/plugins/trackmate/ | ||
| Microscope, preferably with automated moveable stage | Nikon, Tokyo, Japan | A Nikon Eclipse Ti-U Microscope was used in this study and the automated moveable stage was utilized to be able to record images in multiple wells at a time. | |
| NIS-Elements software | Nikon | ||
| Serological pipette | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | BrandTech 26331 | BrandTech accu-jet pro Pipet Controller |
| Serological pipette tips | VWR | 5 mL: 76201-710 10 mL: 170356 25 mL: 89130-900 50 mL: 75816-088 |
VWR Serological Pipette, Non-Pyrogenic |
| Sterile aluminum transmission flow cell | Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT, USA | FC 81-AL | Anodized aluminum single channel transmission flow cell with 96-well plate footprint for use with an inverted microscope |
| T75 Flasks | VWR, Radnor, PA, USA | 734-2316 | VWR Tissue Culture Flask, 182.5 cm, Surface treated, Plug seal cap, Sterile |
References
- Randag, A. C., et al. The rising incidence of Acanthamoeba keratitis: A 7-year nationwide survey and clinical assessment of risk factors and functional outcomes. PLoS One. 14 (9), e0222092 (2019).
- Szentmary, N., et al. Acanthamoeba keratitis – Clinical signs, differential diagnosis and treatment. J Curr Ophthalmol. 31 (1), 16-23 (2019).
- Carnt, N., et al. Acanthamoeba keratitis: confirmation of the UK outbreak and a prospective case-control study identifying contributing risk factors. Br J Ophthalmol. 102 (12), 1621-1628 (2018).
- Verani, J. R., et al. National outbreak of Acanthamoeba keratitis associated with use of a contact lens solution, United States. Emerg Infect Dis. 15 (8), 1236-1242 (2009).
- Tu, E. Y., Joslin, C. E. Recent outbreaks of atypical contact lens-related keratitis: what have we learned. Am J Ophthalmol. 150 (5), 602-608.e2 (2010).
- . ISO 14729:2001/A1. Ophthalmic optics-Contact lens care products-Microbiological requirements and test methods for products and regimens for hygienic management of contact lenses. , (2010).
- . ASC Z80, Parent Committee Meeting, February 27 Available from: https://www.thevisioncouncil.org/sites/default/files/ASCZ80_ParentCommitteeMinutes_February_27_2018_FINALMar19-2018.pdf (2023)
- Rayamajhee, B., et al. Acanthamoeba, an environmental phagocyte enhancing survival and transmission of human pathogens. Trends Parasitol. 38 (11), 975-990 (2022).
- Reverey, J. F., et al. Superdiffusion dominates intracellular particle motion in the supercrowded cytoplasm of pathogenic Acanthamoeba castellanii. Sci Rep. 5, 11690 (2015).
- Thapa, S., Lukat, N., Selhuber-Unkel, C., Cherstvy, A. G., Metzler, R. Transient superdiffusion of polydisperse vacuoles in highly motile amoeboid cells. J Chem Phys. 150 (14), 144901 (2019).
- Rudell, J. C., et al. Acanthamoeba migration in an electric field. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (6), 4225-4233 (2013).
- Fukaya, S., Aoki, K., Kobayashi, M., Takemura, M. Kinetic analysis of the motility of giant virus-infected amoebae using phase-contrast microscopic images. Front Microbiol. 10, 3014 (2019).
- Fukaya, S., Takemura, M. Kinetic analysis of Acanthamoeba castellanii infected with giant viruses quantitatively revealed process of morphological and behavioral changes in host cells. Microbiol Spectr. 9 (1), e0036821 (2021).
- Cheng, H. J., Hsu, C. H., Hung, C. L., Lin, C. Y. A review for cell and particle tracking on microscopy images using algorithms and deep learning technologies. Biomed J. 45 (3), 465-471 (2022).
- Mathieu, E., et al. Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments. Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).
- Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry A. 93 (3), 357-370 (2018).
- Piltti, K. M., et al. Live-cell time-lapse imaging and single-cell tracking of in vitro cultured neural stem cells – Tools for analyzing dynamics of cell cycle, migration, and lineage selection. Methods. 133, 81-90 (2018).
- Campolo, A., et al. Continuous real-time motility analysis of Acanthamoeba reveals sustained movement in absence of nutrients. Pathogens. 10 (8), 995 (2021).
- Campolo, A., Patterson, B., Lara, E., Shannon, P., Crary, M. Complete recovery of Acanthamoeba motility among surviving organisms after contact lens care disinfection. Microorganisms. 11 (2), 299 (2023).
- Crary, M. J., Walters, R., Shannon, P., Gabriel, M. M. Variables affecting the recovery of Acanthamoeba trophozoites. Pathogens. 10 (2), 221 (2021).
- . Trackmate Available from: https://imagej.net/plugins/trackmate/tutorials/getting-started (2024)
- Cherstvy, A. G., Nagel, O., Beta, C., Metzler, R. Non-Gaussianity, population heterogeneity, and transient superdiffusion in the spreading dynamics of amoeboid cells. Phys Chem Chem Phys. 20 (35), 23034-23054 (2018).
