القياس الكمي للشوكميبة spp. الحركه
Summary
يصف هذا الإجراء كيفية تصور وتتبع وقياس Acanthamoeba spp. الحركه.
Abstract
التهاب القرنية الشوكميبي هو عدوى عينية حادة تشكل تحديات علاجية ويمكن أن تؤدي إلى العمى. على الرغم من انتشاره في كل مكان والتلوث المحتمل للعدسات اللاصقة بعد التعرض للماء ، فإن السلوك الطبيعي لهذا العامل الممرض لا يزال بعيد المنال. يمكن أن يخبرنا فهم أنماط حركة Acanthamoeba عن كيفية استعمار العدسات اللاصقة وتلويث قرنية المريض. من حسن الحظ أن أكانثاميبا النيابة. مرئية عبر مجهر برايت فيلد بدءا من تكبير 4x. تم تطوير تقنيات سابقة لتحديد حركة الشوكميبة فيما يتعلق بتأثيرات الاعتلال الخلوي أو التعرض الناقص للمجال الكهربائي. هنا ، نصف طريقة لتتبع وقياس Acanthamoeba spp. الحركة طويلة الأجل (من ساعات إلى أيام) ، وهو بروتوكول ينطبق على سلالات الأميبا المتعددة والأسطح والحالة التغذوية للأميبا. هذا الإجراء وثيق الصلة بتحديد العديد من الكميات الحركية الأساسية ، مثل المسافة والسرعة والحبس والاتجاه ، وهي ضرورية لمراقبة المراحل المختلفة للعدوى أو الانتشار أو التغيير السلوكي.
Introduction
زادت أبحاث الشوكميبة بشكل كبير في السنوات الأخيرة بسبب زيادة انتشار التهاب القرنية الشوكميبي (AK) ، وهو عدوى طفيلية بعد ارتباط الشوكميبة بالقرنية1. في حين أن تفشي AK يمكن أن يعزى إلى العناية غير المناسبة بالعدسات اللاصقة أو حلول العناية بالعدسات اللاصقة غير الفعالة2،3،4،5 ، لا توجد حاليا متطلبات لإثبات فعالية تطهير Acanthamoeba لأي منتج في السوق. ومع ذلك ، هناك جهد مستمر في المجتمع العلمي وداخل منظمات المعايير لفحص البروتوكولات اللازمة لتحديد فعالية تطهير منتجات العناية بالعدسات اللاصقة 6,7. علاوة على ذلك ، نظرا لتشابهه في الجوانب الخلوية والوظيفية مع الضامة البشرية ، فقد لوحظ أن Acanthamoeba له دور مهم في استضافة ونشر مسببات الأمراض البشرية الأخرى8 ، بالإضافة إلى الإمراضية التي تجلبها الأميبا نفسها.
تم وصف التقنيات الحديثة التي كانت قادرة على تحديد حركة Acanthamoeba – والتي لا تخضع بشكل عام للحركة البراونية 9,10 – فيما يتعلق بتأثيرات الاعتلال الخلوي أو التعرض الناقص للمجال الكهربائي 9,11 ، بالإضافة إلى التقدم في تحليل الحركة في أبحاث الفيروسات العملاقة باستخدام Acanthamoeba كناقل فيروسي قابل للتتبع12 ، 13. كانت هناك أيضا تحسينات مستمرة وكبيرة في تتبع الخلايا والجسيمات التي حدثت على مدار ال 20 عاما الماضية باستخدام برامج جديدة مثل برامج التصوير المستخدمة هنا ، والخوارزميات الجديدة وتقنيات التعلم العميق14. ومع ذلك ، يعد هذا مجالا علميا جديدا ومتناميا نسبيا فيما يتعلق بأبحاث الطاولة والتطبيق السريري والمعايير الصناعية ، وكان هناك ندرة في البيانات المنشورة فيما يتعلق بطرق تصور وتتبع هذه الأميبا ، لا سيما من أجل قياس التغيرات السلوكية بعد الالتزام بالعدسات اللاصقة أو أثناء أو بعد تطهير العدسات اللاصقة. وقد دعمت المجالات الأخرى التي تتوسع في المراقبة البصرية طويلة الأجل هذا الجهد15،16،17. نظرا لطبيعة Acanthamoeba الصعبة بطبيعتها – بما في ذلك المقاومة العامة للبلازميدات (التي يمكن أن تمنح مضان) ، وقدرة الأميبا على استهلاك وتدمير أصباغ الخلايا القياسية ، وتركيب البروتين الخارجي الفريد – مما يجعل وضع علامات على الأجسام المضادة أمرا صعبا – كانت الطرق المتاحة للخلايا الأخرى التي تجعلها مرئية في أماكن أخرى غير تصوير برايت فيلد غير صالحة للاستعمال في هذا الكائن الحي. وبالتالي ، فإن تحديد حركة هذه الأميبا أظهر إضافة مهمة إلى هذا المجال. باستخدام الطريقة الموضحة هنا ، تمكنا من التأكد من أن الأميبا تظل متحركة لمدة 12 ساعة على الأقل بدون مغذيات18 وأن الأميبا التي يتم تحديها من خلال عملية التطهير وتتوقف عن الحركة أثناء التطهير يمكن أن تستعيد حركتها بعد التطهير إذا لم يتم تحليلها بالكامل19.
يوضح هذا البروتوكول كيفية تتبع حركة الأميبا وقياسها بصريا مجهريا. تتمثل الخطوات الأساسية في تسجيل الأميبا في برايت فيلد باستخدام التركيز والتوقيت المناسبين بين الصور ، وتحويل الصور إلى ثنائية باستخدام برنامج التصوير ، ثم استخدام المكون الإضافي لتتبع برنامج التصوير لتعيين المعلمات التجريبية ومتابعة كل أميبا لتحديد القياسات المطلوبة مثل السرعة والمسافة والحبس. بعد ذلك ، من الممكن تحديد الانجذاب الكيميائي للأميبا أو مجموعة الأميبا من أجل تحديد الاتجاه. تتمثل المساهمة الرئيسية لهذه الطريقة في تصور سلوك الأميبا وقياسه خلال حالات مختلفة من الدعم الغذائي ، أو الالتزام السطحي ، أو تحدي التطهير ، أو التغيرات البيئية الأخرى مثل التعايش مع زراعة خلايا الثدييات.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن القدرة على تتبع وقياس حركة الأميبا مثل Acanthamoeba ، وهي كائنات مجهرية ملتصقة لا تتأثر بالحركة البراونية منخفضة السرعة 9,10 ، تكشف عن قدر كبير من المعلومات حول سلوك الأميبا ويمكن أن تعزز بشكل كبير التنوير فيما يتعلق بطرق الوقاية من AK. تم تفصيل هذا البروتوكول في المنشورات الحديثة ، وتم تأكيد البيانات أو دمجها مع تحليلات بيانات أخرىمماثلة 18,19. ونلاحظ هنا أن سرعة الأميبا المفصلة باستخدام هذه الطريقة تشبه ما تم نشره من قبل مجموعات أخرى. يتميز هذا البروتوكول بقدرته على استخدامه بشكل أساسي على أي علاج سطحي أو أميبا ، وهو شفاف للضوء ، ولكن من المهم ملاحظة أنه في حين يمكن تعديل هذا البروتوكول للعمل مع الكائنات الحية الأخرى ، فقد تم تحسينه فقط حتى الآن ل Acanthamoeba. لقد عمل البروتوكول أعلاه بشكل جيد باستمرار في المختبر ، ولكن يتم توفير التعديلات التالية لتغيير الطريقة لتناسب الاحتياجات الأخرى أو استكشاف الأخطاء وإصلاحها في المواقف الصعبة.
تحديد معلمات التتبع: في البروتوكول أعلاه ، تم سرد الربط من إطار إلى إطار ، وإغلاق الفجوة ، وفجوة الإطار القصوى ، وعدد النقاط على المسار الصحيح ، والتي كانت الأكثر قابلية للتطبيق على المنشورات الحديثة. ومع ذلك ، من الممكن أن تكون المعلمات الأخرى أكثر ملاءمة للاحتياجات الأخرى. علاوة على ذلك ، قد تكون هناك معلمات يرغب الآخرون في استخدامها ولكن لم يتم استخدامها هنا (مثل المسافة القصوى للمسار ضمن مرشحات المسار). يمكن الوصول إلى مزيد من المعلومات حول كل معلمة وما تصفه هنا على موقع الويب (انظر المرجع21). عند تحديد المعلمات والمرشحات الأكثر صلة بالتجارب الأخرى وكيفية تعيينها ، فكر في ما هو منطقي إحصائيا لمشروع معين ؛ على سبيل المثال ، هل يريد المرء بيانات من الأميبا التي تنطلق ثم تعود إلى مجال الرؤية؟ أو هل يرغب المرء في الاحتفاظ بالبيانات من الأميبا التي لم تتحرك كثيرا على الإطلاق ولكن لا يزال يتم وضع علامة عليها كمسار؟ وما هو منطقي لعدد الإطارات وطول الفترة الزمنية بين الإطارات عند تسجيل الصور.
تغيير حجم النقطة: وجدنا أنه من الصعب للغاية مع أي برنامج أو أي إعداد مجهر – استنادا إلى التقنيات والبرامج الحالية المتاحة للمختبرات القياسية – تتبع عدد الأميبا بدقة في المجموع لأنها تتغير بمرور الوقت. إذا كنت تتبع حجم النقطة ومحاولة ربط هذا الحجم بعدد الكائنات الحية فيها ، فاستخدم منحنى قياسيا تم إنشاؤه بعد التجارب المتكررة للتنبؤ رياضيا بحجم الركام. على سبيل المثال ، تم إنشاء الركام عن طريق زرع الآبار بمجموعة من أعداد الأميبا ، مثل 8 و 16 و 32 و 125 و 250 و 500 و 1000 و 2000 خلية لكل بئر. تم إنشاء صور الفاصل الزمني في نقاط زمنية مختلفة لكل بئر لمدة 24 ساعة. تم تحليل كل كروي (الذي كان من عدد معروف من الأميبا) لمنطقة ثنائية الأبعاد ، وتم إنشاء منحنى قياسي كدالة لعدد الأميبا مقابل حجم كروي بمرور الوقت. تكررت هذه التجربة في ثلاث نسخ على الأقل لتعطينا الانحراف المعياري المناسب لأي منحنى ناتج.
تحديد اتجاه الأميبا: في حين أن هذا قد لا يكون ضروريا لدراسات معينة ، فقد يكون من المفيد فهم اتجاه الأميبا. هذا من شأنه أن يوفر بيانات حول الآثار الكيميائية للعلاج أو التجربة. يمكن أيضا استخدام هذه البيانات لإنشاء بيانات مرئية (رسومية) وكمية. يتوفر هذا عبر أداة الانجذاب الكيميائي والترحيل ، وهو مكون إضافي مجاني لبرامج التصوير. وهي متوفرة على الموقع الإلكتروني جنبا إلى جنب مع دليل التطبيق وعينة من الصور والأفلام (انظر جدول المواد).
ديناميكيات الحركة التفصيلية: درست مجموعات أخرى ديناميكيات الانتشار ومسارات الانتشار مع تحليلات إحصائية متقدمة ومتطورة للغاية تتجاوز ما تمت مناقشته هنا9،10،22. يمكن النظر في هذه بناء على احتياجات المستخدم.
كما هو الحال مع أي طريقة ناجحة ، مر البروتوكول المفصل في هذه المخطوطة بالعديد من جولات استكشاف الأخطاء وإصلاحها لتحقيق الاتساق. بينما يمكن إنشاء مقاطع فيديو ممتازة عالية الجودة قابلة للتتبع عن طريق التقاط صورة كل ثانية (أو بأسرع ما يستطيع المجهر ، قد يكون أقل من ثانية) ، فإن هذا يخلق ملفات كبيرة للغاية ، والتي قد يكون من الصعب التعامل معها. هذا مناسب بشكل واقعي فقط لمقاطع الفيديو قصيرة المدى المسجلة لمدة أقصاها بضع دقائق. على العكس من ذلك ، من خلال التقاط صورة كل بضع ثوان ، وجدنا أن سلوك الأميبا لا يزال قابلا للتتبع بناء على سرعة هذا النوع ، ومن الممكن إنشاء مقاطع فيديو قابلة للتطبيق على مدار ساعات أو أيام. لقد وجدنا أن الحد الأقصى لمقدار الوقت بين الصور هو 30 ثانية ، وهو الوقت المطلوب لتتبع الأميبا بدقة بواسطة برنامج التصوير. يجب مراعاة الفاصل الزمني الذي يختاره المستخدم باستخدام القيود المعروفة لمدى سرعة المجهر في تسجيل الصور ، وعدد الصور المطلوبة لكل بئر ، وعدد الآبار التي يتم تسجيلها في كل فترة زمنية. وبالمثل ، تم تحديد المعلمات المذكورة في هذا البروتوكول فيما يتعلق بالحد الأقصى للإزاحة ، وفجوات الإطار المسموح بها ، والحد الأدنى من الإطارات المطلوبة ، وما إلى ذلك ، من خلال التجربة والخطأ من قبل هذا المختبر لإنشاء معلومات المسار التي تتضمن مسارات الأميبا الأكثر اكتمالا وتجاهل الضوضاء الناتجة عن المسارات غير المكتملة ، الأميبا التي تنضم أو تغادر المرحلة في منتصف الفيديو ، أو الأخطاء الناتجة عن ارتباك برامج التصوير مثل عندما تلتقي أميبا في منتصف المسار ثم تنفصل. هذه الأنواع من الأخطاء والمسارات غير المكتملة عالية بشكل مفهوم عند إنشاء مقاطع فيديو طويلة للغاية (من ساعات إلى أيام) للكائنات البيولوجية المجهرية التي تتفاعل باستمرار مع بعضها البعض وهي السبب في أنه يجب رفض جزء كبير جدا من المسارات الخاطئة. تجدر الإشارة إلى أن خطوة ملء الثقوب في البروتوكول ، في تجربة هذا المختبر ، مهمة لتقليل الخطأ في كيفية تتبع برنامج التصوير للأميبا. من خلال التأكد من أن كل أميبا عبارة عن دائرة صلبة بدلا من ، في بعض الأحيان ، دونات أو شكل c ، من المرجح أن يكون البرنامج قادرا على تتبع كل أميبا بنجاح.
علاوة على ذلك ، كما تمت مناقشته ، هناك العديد من المعلمات المتاحة للمستخدم لتحليل صورة أو مقطع فيديو. بناء على الاحتياجات التجريبية ، استفدنا باستمرار أكثر من تحليل المسافة الإجمالية والمسافة القصوى والسرعة والإزاحة. تمت مناقشتها بعمق (بما في ذلك استخدام سلالات وأسطح مختلفة) مع تفسيرات رسومية في المنشورات السابقة18،19. تسمح هذه المعلمات الأربعة للمستخدم باستقراء قدرة الأميبا على السفر لمسافات خطية والمدة التي يستغرقها للقيام بذلك ، مما يساعد في فهم سلوكهم من حيث صلته بتلوث العدسات اللاصقة. يعد استرداد هذه المعلمات وتحليلها مهمة كبيرة ، كما هو مفصل في أرقامنا. أثناء العمل مع جداول بيانات كبيرة ومتعددة من مخرجات برامج التصوير ، قمنا بالحد من الأخطاء غير المقصودة عن طريق إنشاء قوالب جداول بيانات مقفلة تحسب تلقائيا جميع التحليلات المطلوبة. ومع ذلك ، فإن التحسين المحتمل لهذه الطريقة هو كتابة برنامج نصي يمكنه التعامل مع هذه البيانات وفرزها وتحليلها.
في الختام ، يتم وصف طريقة دقيقة وسهلة الوصول لقياس حجم Acanthamoeba وحركتها في العديد من الظروف المختلفة هنا. لقد أثبتنا أنه يمكن تطبيق هذه الطريقة على العديد من سلالات الأميبا المختلفة وأوضحنا أنه في حين قد تكون هناك معلمات مباشرة للحصول على معلومات الحركة ، يمكن أن يكون هذا الإعداد التجريبي مصمما بشكل كبير لأي احتياجات محددة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل Alcon Research، LLC.
Materials
| ¼ Ringer’s solution | ThermoFisher Scientific | BR0052G | Oxoid Ringers Solution Tablets. Follow directions to make one-quarter strength instead of full strength Ringers. |
| 10 µL pipette | Eppendorf Research | 3123000039 | 2 µL-20 µL single channel |
| 10 µL pipette tips | Neptune Scientific, San Diego, CA, USA | BT10.N | 10 µL Universal Barrier Tip |
| 48 well plate | Millipore Sigma, | CLS3548 | Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid |
| 50 mL conical tubes (1 for each sample, 1 for each pass 2 sample) | Fisher Scientific | Falcon 352098 | Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge Tubes, polypropylene |
| 96-well plate | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | CLS3596 | Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid |
| Acanthamoeba | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | ATCC 30461 | This protocol has been verified for ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115, and PRA-411 |
| Axenic culture media (AC6) | Made in house | n/a | Containing 20 g biosate peptone, 5 g glucose, 0.3 g KH2PO4, 10 µg vitamin B12, and 1 glass5 mg l-methionine per liter of distilled deionized water. Adjust pH to 6.6-6.95 with 1 M NaOH and autoclave at 121 °C for 20 min, store at room temperature for up to 3 months. |
| Centrifuge and appropriate rotor | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Sorvall ST 40R | Any equivalent centrifuge and rotor are acceptable so long as it can spin 50 mL conical tubes at 500 x g for 5 min |
| Chemotaxis and Migration Tool | Free software based on ImageJ, available at https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html | ||
| Disposable hemocytometer | Bulldog Bio, Portsmouth, NH, USA | DHC-N01 | Neubauer Improved 2-Chip Disposable Hemocytometer, Individually packaged, Nonpyrogenic |
| ImageJ software with Trackmate plugin (this protocol written with Trackmate version 6.0.2.) | Free software developed by the National Institutes of Health, available at imagej.net. Trackmate plugin available at https://imagej.net/plugins/trackmate/ | ||
| Microscope, preferably with automated moveable stage | Nikon, Tokyo, Japan | A Nikon Eclipse Ti-U Microscope was used in this study and the automated moveable stage was utilized to be able to record images in multiple wells at a time. | |
| NIS-Elements software | Nikon | ||
| Serological pipette | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | BrandTech 26331 | BrandTech accu-jet pro Pipet Controller |
| Serological pipette tips | VWR | 5 mL: 76201-710 10 mL: 170356 25 mL: 89130-900 50 mL: 75816-088 |
VWR Serological Pipette, Non-Pyrogenic |
| Sterile aluminum transmission flow cell | Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT, USA | FC 81-AL | Anodized aluminum single channel transmission flow cell with 96-well plate footprint for use with an inverted microscope |
| T75 Flasks | VWR, Radnor, PA, USA | 734-2316 | VWR Tissue Culture Flask, 182.5 cm, Surface treated, Plug seal cap, Sterile |
References
- Randag, A. C., et al. The rising incidence of Acanthamoeba keratitis: A 7-year nationwide survey and clinical assessment of risk factors and functional outcomes. PLoS One. 14 (9), e0222092 (2019).
- Szentmary, N., et al. Acanthamoeba keratitis – Clinical signs, differential diagnosis and treatment. J Curr Ophthalmol. 31 (1), 16-23 (2019).
- Carnt, N., et al. Acanthamoeba keratitis: confirmation of the UK outbreak and a prospective case-control study identifying contributing risk factors. Br J Ophthalmol. 102 (12), 1621-1628 (2018).
- Verani, J. R., et al. National outbreak of Acanthamoeba keratitis associated with use of a contact lens solution, United States. Emerg Infect Dis. 15 (8), 1236-1242 (2009).
- Tu, E. Y., Joslin, C. E. Recent outbreaks of atypical contact lens-related keratitis: what have we learned. Am J Ophthalmol. 150 (5), 602-608.e2 (2010).
- . ISO 14729:2001/A1. Ophthalmic optics-Contact lens care products-Microbiological requirements and test methods for products and regimens for hygienic management of contact lenses. , (2010).
- . ASC Z80, Parent Committee Meeting, February 27 Available from: https://www.thevisioncouncil.org/sites/default/files/ASCZ80_ParentCommitteeMinutes_February_27_2018_FINALMar19-2018.pdf (2023)
- Rayamajhee, B., et al. Acanthamoeba, an environmental phagocyte enhancing survival and transmission of human pathogens. Trends Parasitol. 38 (11), 975-990 (2022).
- Reverey, J. F., et al. Superdiffusion dominates intracellular particle motion in the supercrowded cytoplasm of pathogenic Acanthamoeba castellanii. Sci Rep. 5, 11690 (2015).
- Thapa, S., Lukat, N., Selhuber-Unkel, C., Cherstvy, A. G., Metzler, R. Transient superdiffusion of polydisperse vacuoles in highly motile amoeboid cells. J Chem Phys. 150 (14), 144901 (2019).
- Rudell, J. C., et al. Acanthamoeba migration in an electric field. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (6), 4225-4233 (2013).
- Fukaya, S., Aoki, K., Kobayashi, M., Takemura, M. Kinetic analysis of the motility of giant virus-infected amoebae using phase-contrast microscopic images. Front Microbiol. 10, 3014 (2019).
- Fukaya, S., Takemura, M. Kinetic analysis of Acanthamoeba castellanii infected with giant viruses quantitatively revealed process of morphological and behavioral changes in host cells. Microbiol Spectr. 9 (1), e0036821 (2021).
- Cheng, H. J., Hsu, C. H., Hung, C. L., Lin, C. Y. A review for cell and particle tracking on microscopy images using algorithms and deep learning technologies. Biomed J. 45 (3), 465-471 (2022).
- Mathieu, E., et al. Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments. Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).
- Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry A. 93 (3), 357-370 (2018).
- Piltti, K. M., et al. Live-cell time-lapse imaging and single-cell tracking of in vitro cultured neural stem cells – Tools for analyzing dynamics of cell cycle, migration, and lineage selection. Methods. 133, 81-90 (2018).
- Campolo, A., et al. Continuous real-time motility analysis of Acanthamoeba reveals sustained movement in absence of nutrients. Pathogens. 10 (8), 995 (2021).
- Campolo, A., Patterson, B., Lara, E., Shannon, P., Crary, M. Complete recovery of Acanthamoeba motility among surviving organisms after contact lens care disinfection. Microorganisms. 11 (2), 299 (2023).
- Crary, M. J., Walters, R., Shannon, P., Gabriel, M. M. Variables affecting the recovery of Acanthamoeba trophozoites. Pathogens. 10 (2), 221 (2021).
- . Trackmate Available from: https://imagej.net/plugins/trackmate/tutorials/getting-started (2024)
- Cherstvy, A. G., Nagel, O., Beta, C., Metzler, R. Non-Gaussianity, population heterogeneity, and transient superdiffusion in the spreading dynamics of amoeboid cells. Phys Chem Chem Phys. 20 (35), 23034-23054 (2018).
