Summary

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Nöral Retina Üretimi

Published: December 22, 2023
doi:

Summary

Mevcut protokol, retinal organoidlerin yapışmasını ve füzyonunu yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilikle azaltan optimize edilmiş bir 3D nöral retina indüksiyon sistemini tanımlamaktadır.

Abstract

Retinopati, dünya çapında körlüğün ana nedenlerinden biridir. Retinopatinin erken tanısı ve zamanında tedavisi için patogenezinin araştırılması esastır. Ne yazık ki, etik engeller insanlardan kanıt toplanmasını engellemektedir. Son zamanlarda, çok sayıda çalışma, insan pluripotent kök hücrelerinin (PSC’ler), hastalık modellemesi, ilaç taraması ve kök hücre bazlı tedaviler için retinopatide muazzam potansiyele sahip olan farklı indüksiyon protokolleri kullanılarak retinal organoidlere (RO’lar) farklılaştırılabileceğini göstermiştir. Bu çalışma, vezikülasyon ve füzyon olasılığını önemli ölçüde azaltan ve 60. güne kadar üretimin başarı oranını artıran nöral retina (NR) oluşturmak için optimize edilmiş bir indüksiyon protokolünü açıklamaktadır. PSC’lerin ayrışmadan sonra kendi kendini yeniden düzenleme yeteneğine dayanarak, bazı tamamlayıcı faktörlerle birlikte, bu yeni yöntem özellikle NR farklılaşmasını sağlayabilir. Ayrıca, yaklaşım karmaşık değildir, uygun maliyetlidir, kayda değer tekrarlanabilirlik ve verimlilik sergiler, kişiselleştirilmiş retina hastalıkları modelleri için cesaret verici beklentiler sunar ve hücre tedavisi, ilaç taraması ve gen terapisi testi gibi uygulamalar için bol miktarda hücre rezervuarı sağlar.

Introduction

Göz, insan duyu organları arasında birincil bilgi kaynağı olarak hizmet eder ve retina, memeli gözlerinde başlıca görsel duyu dokusudur1. Retinopati, körlüğe yol açan göz hastalıklarının başlıca küresel nedenlerinden biridir2. Dünya çapında yaklaşık 2,85 milyon insan retinopati nedeniyle çeşitli derecelerde görme bozukluğundan muzdariptir3. Sonuç olarak, patogenezinin araştırılması erken tanı ve zamanında tedavi için çok önemlidir. İnsan retinopatisi üzerine yapılan çalışmaların çoğu öncelikle hayvan modellerine odaklanmıştır 4,5,6. Bununla birlikte, insan retinası, çeşitli hücre tiplerini içeren karmaşık, çok katmanlı bir dokudur. Geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültürü ve hayvan modeli sistemleri tipik olarak doğal insan retinasının normal uzay-zamansal gelişimini ve ilaç metabolizmasını aslına uygun olarak özetlemekte başarısızolur 7,8.

Son zamanlarda, pluripotent kök hücrelerden (PSC’ler) doku benzeri organlar üretmek için 3D kültür teknikleri gelişmiştir9,10. Bir 3D süspansiyon kültürü sisteminde insan PSC’lerinden üretilen retinal organoidler (RO’lar) sadece yedi retinal hücre tipi içermekle kalmaz, aynı zamanda insan retinasına benzer farklı bir tabakalı yapı sergiler in vivo 11,12,13. İnsan PSC’den türetilen RO’lar popülerlik ve yaygın kullanılabilirlik kazanmıştır ve şu anda insan retinasının gelişimini ve hastalığını incelemek için en iyi in vitro modellerdir14,15. Son birkaç on yılda, çok sayıda araştırmacı, embriyonik kök hücreler (ESC’ler) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC’ler) dahil olmak üzere insan PSC’lerinin çeşitli indüksiyon protokolleri kullanarak RO’lara farklılaşabileceğini göstermiştir. Bu gelişmeler, hastalık modellemesi, ilaç taraması ve kök hücre bazlı tedaviler için retinopatide muazzam bir potansiyele sahiptir 16,17,18.

Bununla birlikte, insan pluripotent kök hücrelerinden (PSC’ler) nöral retina (NR) üretimi karmaşık, zahmetli ve zaman alıcı bir süreçtir. Ayrıca, doku organoidlerindeki partiden partiye varyasyonlar, sonuçların daha düşük tekrarlanabilirliğine yol açabilir19,20. Başlangıç hücrelerinin sayısı veya türü ve transkripsiyon faktörlerinin ve küçük moleküllü bileşiklerinkullanımı gibi çok sayıda içsel ve dışsal faktör retinal organoidlerin (RO’lar) verimini etkileyebilir 21,22,23. İlk insan RO’su Sasai laboratuvarı11 tarafından üretildiğinden beri, indüksiyon işleminin 13,21,24,25 kolaylığını ve etkinliğini artırmak için yıllar içinde çok sayıda modifikasyon önerilmiştir. Ne yazık ki, bugüne kadar, tüm laboratuvarlarda RO üretmek için altın standart bir protokol oluşturulmamıştır. Gerçekten de, farklı indüksiyon yöntemlerinden kaynaklanan RO’larda belirli bir derecede tutarsızlık ve ayrıca retinal belirteçlerin ekspresyonunda ve yapılarının sağlamlığında geniş farklılıklar vardır22,26. Bu sorunlar, örneklem toplamayı ve çalışma bulgularının yorumlanmasını ciddi şekilde zorlaştırabilir. Bu nedenle, RO üretiminin minimum heterojenliği ile verimliliği en üst düzeye çıkarmak için daha konsolide ve sağlam bir farklılaşma protokolüne ihtiyaç vardır.

Bu çalışma, Kuwahara ve ark.12 ve Döpper ve ark.27’nin ayrıntılı talimatlarla bir kombinasyonuna dayanan optimize edilmiş bir indüksiyon protokolünü açıklamaktadır. Yeni yöntem, organoid vezikülasyon ve füzyon olasılığını önemli ölçüde azaltarak NR üretme başarı oranını artırır. Bu gelişme, retina bozuklukları için hastalık modellemesi, ilaç taraması ve hücre tedavisi uygulamaları için büyük umut vaat ediyor.

Protocol

Bu çalışma, Helsinki Bildirgesi’nin İlkelerine uygun olarak yürütülmüş ve Çin PLA Genel Hastanesi Kurumsal Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. WA09 (H9) ESC hattı, WiCell Araştırma Enstitüsü’nden alınmıştır. 1. Kültür ortamı ve reaktif hazırlama İnsan ESC kültür ortamı ve geçiş çözümüBakım ortamı (MM): Aseptik olarak 500 mL tam MM (Bazal Ortam + 5x ek; Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın. 5x ta…

Representative Results

Değiştirilen protokolün grafiksel bir özeti Şekil 1’de gösterilmektedir. H9-ESC’ler, hücreler -80’lik bir yoğunluğa büyütüldüğünde RO’ları üretmek için kullanıldı. 96 V tabanlı konik kuyuda H9-ESC’lerin tek hücreli süspansiyonları 1. günde toplandı ve 6. günde iyi sınırlandırılmış yuvarlak EB’ler oluşturdu. Kültür zamanı arttıkça, EB’lerin hacmi giderek arttı. 30. günde, uzun süreli NR farklılaşması sırasında nöroepitel benzeri yapılar aç?…

Discussion

İnsan RO’ları, fetal retinanın gelişimini uzamsal ve zamansal olarak özetleyebilir ve erken RO’lar, gelişimin eşdeğer aşamalarında fetal retinaya yüksek derecede benzerlik gösterir15. Doku morfolojisi ve moleküler ekspresyon açısından, insan RO’su retina dokusunun gerçek büyüme durumunu yakından yansıtır ve hastalık modellemesi, ilaç taraması ve rejeneratif tıp alanlarında muazzam ve benzeri görülmemiş fırsatlar sunar. Şu anda, in vitro insan PSC’lerinden R…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Hiç kimse.

Materials

0.01 M TPBS Servicebio G0002 Washing slices
4% Paraformaldehyde Servicebio G1101-500ML Fix retinal organoids
5 mL Pasteur pipette NEST Biotechnology 318516 Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wells Sumitomo Bakelit MS-9096VZ
Adhesion Microscope Slides CITOTEST 188105 Fix slices
AggreWell medium STEMCELL Technologies 5893 Medium
Anhydrous ethanol SINOPHARM 10009218 Dehydrate 
Anti-CHX10 Santa Cruz sc-365519 Primary antibody
Antifade Solution ZSGB-BIO ZLI-9556
Anti-KI67 Abcam ab16667 Primary antibody
Anti-NESTIN Sigma N5413 Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) Beyotime AT809 Primary antibody
Anti-PAX6 Abcam ab195045 Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS) STEMCELL Technologies 7922 Cell dissociation
CHIR99021 Selleckchem S2924 GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid Concentrate Gibco 12531018 250×
Citrate Antigen Retrieval Solution Servicebio G1202-250ML 20×, pH 6.0
CS10 STEMCELL Technologies 1001061 Cell Freezing Medium
DAPI Roche 10236276001 Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO) Sigma D2650
DMEM/F12 Gibco 11330032 Medium
DMEM/F12-GlutaMAX Gibco 10565018 Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 Invitrogen A32766 Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Invitrogen A10042 Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) Biosharp BL518A 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM) Corning 354277 Coating plates
F12-Glutamax Gibco 31765035 Medium
Fetal Bovine Serum Gibco A5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzer TissueGnostics TissueFAXS Plus Scan sections
IMDM-GlutaMAX Gibco 31980030 Medium
IWR1-endo Selleckchem S7086 Wnt-inhibitor
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828028
LDN-193189 2HCl Selleckchem S7507 BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well Plates Corning 3473
Low-adhesion 6-well Plates Corning 3471
Maintenance medium (MM) STEMCELL Technologies 85850 Medium
N2 supplement Gibco 17502048
Normal Donkey Serum Solarbio SL050 Blocking buffer
Paraplast Leica 39601006 Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x) Gibco C10010500BT Without Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) R&D 314-BP Key protein factor
Retinoic acid Sigma R2625 Powder, keep out of light
SB431542 Selleckchem S1067 ALK5-inhibitor
SU5402 Selleckchem S7667 Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP Pen ZSGB-BIO ZLI-9305
Taurine Sigma T0625-10G
Thioglycerol Sigma M1753
Triton X-100 Sigma X100 Permeabilization
WA09 embryonic stem cell line WiCell Research Institute Cell line
Xylene SINOPHARM 10023418 Dewaxing
Y-27632 2HCL Selleckchem S1049 ROCK-inhibitor

References

  1. Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, ., Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
  2. Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
  3. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
  4. Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
  5. Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
  6. Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
  7. Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022 (2021).
  8. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  9. Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
  10. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
  11. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  12. Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286 (2015).
  13. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047 (2014).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  16. Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
  17. Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
  18. Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
  19. Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39 (2022).
  20. Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212 (2021).
  21. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
  22. Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478 (2022).
  23. Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439 (2021).
  24. Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
  25. Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
  26. Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
  27. Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120 (2020).
  28. Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).

Play Video

Cite This Article
Li, W., Li, H., Yan, H., Gao, L., Wang, X., Zhao, L., Yan, Y., Ye, Z., Xi, J., Yue, W., Li, Z. Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (202), e66246, doi:10.3791/66246 (2023).

View Video