Mevcut protokol, retinal organoidlerin yapışmasını ve füzyonunu yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilikle azaltan optimize edilmiş bir 3D nöral retina indüksiyon sistemini tanımlamaktadır.
Retinopati, dünya çapında körlüğün ana nedenlerinden biridir. Retinopatinin erken tanısı ve zamanında tedavisi için patogenezinin araştırılması esastır. Ne yazık ki, etik engeller insanlardan kanıt toplanmasını engellemektedir. Son zamanlarda, çok sayıda çalışma, insan pluripotent kök hücrelerinin (PSC’ler), hastalık modellemesi, ilaç taraması ve kök hücre bazlı tedaviler için retinopatide muazzam potansiyele sahip olan farklı indüksiyon protokolleri kullanılarak retinal organoidlere (RO’lar) farklılaştırılabileceğini göstermiştir. Bu çalışma, vezikülasyon ve füzyon olasılığını önemli ölçüde azaltan ve 60. güne kadar üretimin başarı oranını artıran nöral retina (NR) oluşturmak için optimize edilmiş bir indüksiyon protokolünü açıklamaktadır. PSC’lerin ayrışmadan sonra kendi kendini yeniden düzenleme yeteneğine dayanarak, bazı tamamlayıcı faktörlerle birlikte, bu yeni yöntem özellikle NR farklılaşmasını sağlayabilir. Ayrıca, yaklaşım karmaşık değildir, uygun maliyetlidir, kayda değer tekrarlanabilirlik ve verimlilik sergiler, kişiselleştirilmiş retina hastalıkları modelleri için cesaret verici beklentiler sunar ve hücre tedavisi, ilaç taraması ve gen terapisi testi gibi uygulamalar için bol miktarda hücre rezervuarı sağlar.
Göz, insan duyu organları arasında birincil bilgi kaynağı olarak hizmet eder ve retina, memeli gözlerinde başlıca görsel duyu dokusudur1. Retinopati, körlüğe yol açan göz hastalıklarının başlıca küresel nedenlerinden biridir2. Dünya çapında yaklaşık 2,85 milyon insan retinopati nedeniyle çeşitli derecelerde görme bozukluğundan muzdariptir3. Sonuç olarak, patogenezinin araştırılması erken tanı ve zamanında tedavi için çok önemlidir. İnsan retinopatisi üzerine yapılan çalışmaların çoğu öncelikle hayvan modellerine odaklanmıştır 4,5,6. Bununla birlikte, insan retinası, çeşitli hücre tiplerini içeren karmaşık, çok katmanlı bir dokudur. Geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültürü ve hayvan modeli sistemleri tipik olarak doğal insan retinasının normal uzay-zamansal gelişimini ve ilaç metabolizmasını aslına uygun olarak özetlemekte başarısızolur 7,8.
Son zamanlarda, pluripotent kök hücrelerden (PSC’ler) doku benzeri organlar üretmek için 3D kültür teknikleri gelişmiştir9,10. Bir 3D süspansiyon kültürü sisteminde insan PSC’lerinden üretilen retinal organoidler (RO’lar) sadece yedi retinal hücre tipi içermekle kalmaz, aynı zamanda insan retinasına benzer farklı bir tabakalı yapı sergiler in vivo 11,12,13. İnsan PSC’den türetilen RO’lar popülerlik ve yaygın kullanılabilirlik kazanmıştır ve şu anda insan retinasının gelişimini ve hastalığını incelemek için en iyi in vitro modellerdir14,15. Son birkaç on yılda, çok sayıda araştırmacı, embriyonik kök hücreler (ESC’ler) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC’ler) dahil olmak üzere insan PSC’lerinin çeşitli indüksiyon protokolleri kullanarak RO’lara farklılaşabileceğini göstermiştir. Bu gelişmeler, hastalık modellemesi, ilaç taraması ve kök hücre bazlı tedaviler için retinopatide muazzam bir potansiyele sahiptir 16,17,18.
Bununla birlikte, insan pluripotent kök hücrelerinden (PSC’ler) nöral retina (NR) üretimi karmaşık, zahmetli ve zaman alıcı bir süreçtir. Ayrıca, doku organoidlerindeki partiden partiye varyasyonlar, sonuçların daha düşük tekrarlanabilirliğine yol açabilir19,20. Başlangıç hücrelerinin sayısı veya türü ve transkripsiyon faktörlerinin ve küçük moleküllü bileşiklerinkullanımı gibi çok sayıda içsel ve dışsal faktör retinal organoidlerin (RO’lar) verimini etkileyebilir 21,22,23. İlk insan RO’su Sasai laboratuvarı11 tarafından üretildiğinden beri, indüksiyon işleminin 13,21,24,25 kolaylığını ve etkinliğini artırmak için yıllar içinde çok sayıda modifikasyon önerilmiştir. Ne yazık ki, bugüne kadar, tüm laboratuvarlarda RO üretmek için altın standart bir protokol oluşturulmamıştır. Gerçekten de, farklı indüksiyon yöntemlerinden kaynaklanan RO’larda belirli bir derecede tutarsızlık ve ayrıca retinal belirteçlerin ekspresyonunda ve yapılarının sağlamlığında geniş farklılıklar vardır22,26. Bu sorunlar, örneklem toplamayı ve çalışma bulgularının yorumlanmasını ciddi şekilde zorlaştırabilir. Bu nedenle, RO üretiminin minimum heterojenliği ile verimliliği en üst düzeye çıkarmak için daha konsolide ve sağlam bir farklılaşma protokolüne ihtiyaç vardır.
Bu çalışma, Kuwahara ve ark.12 ve Döpper ve ark.27’nin ayrıntılı talimatlarla bir kombinasyonuna dayanan optimize edilmiş bir indüksiyon protokolünü açıklamaktadır. Yeni yöntem, organoid vezikülasyon ve füzyon olasılığını önemli ölçüde azaltarak NR üretme başarı oranını artırır. Bu gelişme, retina bozuklukları için hastalık modellemesi, ilaç taraması ve hücre tedavisi uygulamaları için büyük umut vaat ediyor.
İnsan RO’ları, fetal retinanın gelişimini uzamsal ve zamansal olarak özetleyebilir ve erken RO’lar, gelişimin eşdeğer aşamalarında fetal retinaya yüksek derecede benzerlik gösterir15. Doku morfolojisi ve moleküler ekspresyon açısından, insan RO’su retina dokusunun gerçek büyüme durumunu yakından yansıtır ve hastalık modellemesi, ilaç taraması ve rejeneratif tıp alanlarında muazzam ve benzeri görülmemiş fırsatlar sunar. Şu anda, in vitro insan PSC’lerinden R…
The authors have nothing to disclose.
Hiç kimse.
0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Washing slices |
4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | Fix retinal organoids |
5 mL Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318516 | Pipette retinal organoids |
96 V-bottomed conical wells | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | Fix slices |
AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
Anhydrous ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Primary antibody |
Antifade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Primary antibody |
Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Primary antibody |
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | Primary antibody |
Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Primary antibody |
Cell dissociation solution(CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Cell dissociation |
CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inhibitor |
Cholesterol Lipid Concentrate | Gibco | 12531018 | 250× |
Citrate Antigen Retrieval Solution | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Freezing Medium |
DAPI | Roche | 10236276001 | Nuclear counterstain |
Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma | D2650 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Secondary Antibody |
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Secondary Antibody |
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation |
Extracellular matrix (ECM) | Corning | 354277 | Coating plates |
F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Scan sections |
IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inhibitor |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inhibitor |
Low-adhesion 24-well Plates | Corning | 3473 | |
Low-adhesion 6-well Plates | Corning | 3471 | |
Maintenance medium (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Medium |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking buffer |
Paraplast | Leica | 39601006 | Tissue embedding |
PBS pH 7.4 basic (1x) | Gibco | C10010500BT | Without Ca+,Mg+ |
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) | R&D | 314-BP | Key protein factor |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | Powder, keep out of light |
SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-inhibitor |
SU5402 | Selleckchem | S7667 | Tyrosine kinase inhibitor |
Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
Taurine | Sigma | T0625-10G | |
Thioglycerol | Sigma | M1753 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilization |
WA09 embryonic stem cell line | WiCell Research Institute | Cell line | |
Xylene | SINOPHARM | 10023418 | Dewaxing |
Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibitor |