Summary

Cuantificación de anticuerpos autorreactivos en ratones tras encefalomielitis autoinmune experimental

Published: December 01, 2023
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Summary

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal de esclerosis múltiple (EM), que comparte con la enfermedad humana una respuesta autoinmune humoral robusta. En este trabajo presentamos un protocolo ELISA sencillo y flexible para cuantificar autoanticuerpos en el suero de ratones inmunizados con EAE.

Abstract

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo de enfermedad que recapitula el trastorno autoinmune esclerosis múltiple (EM) a nivel histopatológico y molecular. La EAE se induce mediante la inmunización de animales de experimentación mediante inyección subcutánea de péptidos de mielina corta junto con adyuvantes específicos para impulsar la respuesta inmunitaria. Al igual que los humanos, los ratones EAE desarrollan lesiones desmielinizantes, infiltración de células inmunitarias en el sistema nervioso central (SNC), activación de la glía y lesión neuronal. Un cuerpo consistente de evidencia también apoya un papel mecanicista para la disfunción de las células B en la etiología tanto de la EM como de la EAE. Las células B pueden servir como células presentadoras de antígenos, así como una fuente principal de citocinas proinflamatorias y autoanticuerpos. En la EAE, se generan anticuerpos contra los péptidos de mielina que se emplearon para inducir la enfermedad. Se ha demostrado que estos autoanticuerpos median la pérdida de mielina o la reactivación patogénica de las células T en el SNC. Este artículo describe un protocolo eficiente basado en ELISA para cuantificar autoanticuerpos en el suero de ratones C57BL/6J inmunizados con el péptido glicoproteína de oligodendrocitos de mielina 35-55 (MOG35-55). El método propuesto sirve como una poderosa herramienta para investigar la especificidad y magnitud de la respuesta humoral aberrante en el contexto de la desmielinización autoinmune.

Introduction

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune crónica del sistema nervioso central (SNC) caracterizada por la infiltración focal de células inmunitarias en el parénquima cerebral, la ruptura de las vainas de mielina que envuelven los axones, la activación de la glía y la pérdida neuronal1. Además del papel bien establecido de las células T patógenas, múltiples líneas de evidencia han destacado la participación de las células B en la mediación de la respuesta autoinmune contra el SNC. Las células B experimentan una expansión clonal en el cerebro de la EM y se han detectado anticuerpos contra los componentes de la mielina dentro de las lesiones desmielinizadas 2,3. Recientemente se ha documentado la activación selectiva de las células B periféricas al inicio de la enfermedad, lo que sugiere un papel putativo de este compartimento de células inmunitarias también en el inicio de la enfermedad4. El éxito de las terapias de agotamiento de linfocitos B, como los anticuerpos monoclonales anti-CD20, corrobora aún más la conexión mecanicista entre el funcionamiento aberrante de los linfocitos B y la desmielinización autoinmune 5,6. Desde un punto de vista molecular, las células B pueden contribuir a la enfermedad a través de la presentación de autoantígenos, la secreción de citocinas proinflamatorias y la producción de anticuerpos autorreactivos.

Se han desarrollado múltiples modelos animales para recapitular las características específicas del complejo fenotipo de la EM. Entre ellos, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es el paradigma in vivo más utilizado y se basa en la inmunización de animales de experimentación con péptidos cortos derivados de proteínas de mielina como la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG) y la proteína básica de mielina (MBP)7. Los animales inmunizados con EAE desarrollan una patología desmielinizante que se asemeja a la EM en muchos aspectos, incluyendo una respuesta humoral robusta frente al péptido encefalogénico8. Por este motivo, los estudios de EAE han sido fundamentales para diseccionar la función de las células B y los autoanticuerpos en el contexto de la enfermedad. Por ejemplo, se demostró que los anticuerpos específicos de MOG aislados de pacientes con EM pueden agravar el curso clínico en modelos EAE9. En particular, se demostró que el residuo de prolina en la posición 42 en el MOG humano es crítico para determinar la patogenicidad de los autoanticuerpos10. Más recientemente, se ha descubierto que los autoanticuerpos específicos de MOG promueven la enfermedad no solo al mediar la pérdida de mielina, sino también al estimular la reactivación de las células T autorreactivas dentro del SNC11.

Teniendo en cuenta la importancia de las respuestas de anticuerpos en la autoinmunidad del SNC, este artículo presenta un protocolo basado en ELISA para medir de manera eficiente los niveles séricos de anticuerpos autorreactivos en ratones C57BL/6J EAE inmunizados con el péptido MOG35-55. En la primera parte del protocolo se describirá el método de recogida de suero mediante punción intracardíaca. Posteriormente, se detallarán los procedimientos para configurar el ensayo ELISA y adquirir los datos. Por último, se discutirá el análisis e interpretación de los datos.

Protocol

Todos los procedimientos con ratones se realizaron de acuerdo con las pautas experimentales aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Este (IACUC). En este estudio se utilizaron ratones hembra de tipo salvaje C57BL/6J de entre 8 y 10 semanas de edad. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). La EAE fue inducida a partir de los reportes previamente publicados 12,13,14.<sup cla…

Representative Results

Para demostrar la robustez del presente ensayo ELISA, el método se probó en muestras de suero aisladas de una cohorte de ratones hembra C57BL/6J a los 20 días después de la inmunización (dpi) con 100 μg del péptido MOG35-55 en adyuvante de Freund completo (CFA) siguiendo un protocolo de inducción EAE validado 12,13,14. Los animales también recibieron 400 ng de toxina para la tos ferina los días 0 y 2. Las muestras de s…

Discussion

Aquí, se informó de un protocolo simple y eficiente basado en ELISA para cuantificar con precisión la respuesta humoral en un modelo animal relevante de patología de EM. Este método se ha empleado recientemente para describir el nuevo papel de la proteína ataxina-1 en el control de los niveles séricos de autoanticuerpos en el paradigma MOG35-55/C57BL6J EAE12. En este sentido, se deben tener en cuenta una serie de factores para obtener resultados consistentes y biológicamente significativos…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R03NS131908) y el Departamento de Defensa a través del Programa de Investigación de Esclerosis Múltiple bajo el Premio No. W81XWH-22-1-0517. Las opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son del autor y no están necesariamente respaldadas por el Departamento de Defensa. Este estudio también contó con el apoyo de fondos iniciales de la Universidad de Carolina del Este.

Materials

1 mL syringes BD Biosciences 309628
1.5 mL microcentrifuge tubes Fisher 05-408-129
25 G needles BD Biosciences 305122
3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate Thermo Fisher N301 Store at 4 °C
Adhesive seals Thermo Fisher AB0558
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7906 Store at 4 °C
C57BL/6J female mice The Jackson Laboratory 000664 Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments
Cryogenic tubes Fisher 10-500-25
Dissection tray Fisher S111022
Dissector scissors Fine Science Tools 14082-09
ELISA coating buffer BioLegend 421701 Store at 4°C
Excel software Microsoft Analysis spreadsheet
Forceps Fine Science Tools 11152-10
Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP SouthernBiotech 1030-05 Store at 4 °C
LED light source Fisher AMPSILED21
Microplate reader Fisher 14-377-575 
Molecular biology grade water Corning 46-000-Cl
Mouse MOG35-55 peptide EZBiolab cp7203 Store at -80 °C
Multichannel pipette Axygen AP-12-200-P
Noyes spring scissors Fine Science Tools 15011-12
Nunc MaxiSorp 96-well plates BioLegend 423501
Orbital shaker Fisher 88-861-023
Oven VWR 445-0024
Phosphate buffer saline (PBS) Thermo Fisher 14190144
Refrigerated tabletop centrifuge Thermo Fisher 75002441
Stop solution Thermo Fisher N600
Tween 20 Bio-Rad 1706531

References

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Cite This Article
Carver, J. J., Didonna, A. Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice upon Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (202), e66218, doi:10.3791/66218 (2023).

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