実験的自己免疫性脳脊髄炎に対するマウスにおける自己反応性抗体の定量化
Summary
実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症(MS)の動物モデルであり、ヒトの疾患と強力な体液性自己免疫応答を共有しています。ここでは、EAE免疫マウスの血清中の自己抗体を定量するためのシンプルで柔軟なELISAプロトコルを報告します。
Abstract
実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) は、組織病理学的および分子レベルで自己免疫疾患である多発性硬化症 (MS) を再現する疾患モデルです。EAEは、短いミエリンペプチドと特異的なアジュバントを皮下注射 して 実験動物に免疫を与え、免疫応答を高めることによって誘導されます。ヒトマウスと同様に、EAEマウスは脱髄病変、中枢神経系(CNS)への免疫細胞浸潤、グリア活性化、および神経細胞損傷を発症します。一貫した一連の証拠は、MSとEAEの両方の病因におけるB細胞機能障害の機構的役割も支持しています。B細胞は、抗原提示細胞としてだけでなく、炎症誘発性サイトカインや自己抗体の主要な供給源としても機能します。EAEでは、病気を誘発するために使用されたミエリンペプチドに対する抗体が生成されます。このような自己抗体は、ミエリン喪失または病原性T細胞のCNSへの再活性化のいずれかを媒介することが示されています。この記事では、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質35-55(MOG35-55)ペプチドで免疫したC57BL/6Jマウスの血清中の自己抗体を定量するための効率的なELISAベースのプロトコルについて説明します。提案された方法は、自己免疫脱髄の文脈における異常な体液性応答の特異性と大きさを調査するための強力なツールとして機能します。
Introduction
多発性硬化症(MS)は、中枢神経系(CNS)の慢性自己免疫疾患で、脳実質への免疫細胞の限局浸潤、軸索を包むミエリン鞘の破壊、グリアの活性化、およびニューロンの喪失を特徴とする1。病原性T細胞の確立された役割に加えて、複数の証拠が、CNSに対する自己免疫応答の媒介におけるB細胞の関与を強調しています。B細胞はMS脳でクローン増殖を起こし、ミエリン成分に対する抗体が脱髄病変内で検出されています2,3。疾患発症時の末梢B細胞の選択的活性化が最近文書化されており、疾患開始におけるこの免疫細胞コンパートメントの推定上の役割も示唆されています4。抗CD20モノクローナル抗体などのB細胞枯渇療法の成功は、異常なB細胞機能と自己免疫性脱髄との間の機構的関係をさらに裏付けています5,6。分子の観点から、B細胞は、自己抗原の提示、炎症誘発性サイトカイン分泌、および自己反応性抗体産生を介して疾患に寄与する可能性があります。
複雑なMS表現型の特定の特徴を再現するために、複数の動物モデルが開発されています。その中でも、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、 最も広く使用されているin vivo パラダイムであり、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)やミエリン塩基性タンパク質(MBP)7などのミエリンタンパク質に由来する短いペプチドによる実験動物の免疫に依存しています。EAE免疫動物は、脳原性ペプチド8に対する強力な体液性応答を含む、多くの面でMSに似た脱髄性病理を発症します。このため、EAE研究は、疾患の状況におけるB細胞と自己抗体の機能を解剖するのに役立ちました。たとえば、MS患者から単離されたMOG特異的抗体は、EAEモデル9の臨床経過を悪化させる可能性があることが実証されました。 特に、ヒトMOGにおける42位のプロリン残基は、自己抗体病原性を決定するために重要であることが示された10。最近では、MOG特異的自己抗体は、ミエリン喪失を媒介するだけでなく、CNS内の自己反応性T細胞の再活性化を促進することによっても疾患を促進することがわかっています11。
CNS自己免疫における抗体応答の重要性を考慮して、この記事では、MOG35-55ペプチドで免疫したC57BL / 6JマウスEAEの自己反応性抗体の血清レベルを効率的に測定するためのELISAベースのプロトコルを紹介します。プロトコルの最初の部分では、心臓内穿刺 を介して 血清を採取する方法について説明します。その後、ELISAアッセイの設定とデータ取得の手順について詳しく説明します。最後に、データ分析と解釈について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、MS病理の関連する動物モデルにおける体液性反応を正確に定量化するために、シンプルで効率的なELISAベースのプロトコルが報告されました。この方法は、MOG35-55/C57BL6J EAEパラダイム12における自己抗体の血清レベルの制御におけるアタキシン-1タンパク質の新規の役割を説明するために最近採用されました。この点で、この方法で一貫した生物学的に意味のある結…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国国立衛生研究所(R03NS131908)および国防総省の多発性硬化症研究プログラムを通じて、賞番号W81XWH-22-1-0517の支援を受けました。意見、解釈、結論、および推奨事項は著者のものであり、必ずしも国防総省によって承認されているわけではありません。この研究は、イーストカロライナ大学のスタートアップファンドの支援も受けました。
Materials
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
References
- Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. Multiple sclerosis. N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).
- Baranzini, S. E., et al. B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions. J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).
- Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis. Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).
- Ma, Q., et al. Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118 (2021).
- Hauser, S. L., et al. Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).
- Montalban, X., et al. Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).
- Didonna, A. Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies. Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).
- Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
- Khare, P., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model. J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).
- Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).
- Flach, A. C., et al. Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).
- Didonna, A., et al. Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).
- Didonna, A., et al. Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation. J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).
- Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroinflammation. 17 (1), 297 (2020).
- Lanz, T. V., et al. Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam. Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).
