3D打印细菌研究复杂3D多孔介质中的运动和生长

使用带有颗粒水凝胶基质的3D生物打印机扩展了生物打印机的功能，将细菌菌落打印成形状，当打印在平坦的基材上时，由于细菌悬浮液的低粘度，这些形状会坍塌。这里介绍的方法的分辨率取决于挤出速度、针头尺寸、打印头速度、针中的空气和细菌悬浮液的粘度。由于细菌悬浮液的体积小，在将细菌悬浮液装入注射器和针头的过程中，可能会无意中引入气泡。这可能导致气泡沉积在最终的打印结构中（图4）。将气泡引入打印的另一种方法是，如果在打印前不按下柱塞以在针尖处形成一小滴细菌悬浮液，并且针尖存在气隙。打印前不按下注射器柱塞也会导致在同一批次中打印不同体积的细胞。然而，随着时间的流逝，气泡会溶解到周围的介质中，如 图 4 所示。 对于校准挤出步骤，沉积的体积取决于打印头的线性执行器如何平移注射器柱塞，注射器的内径将直接影响体积。此外，细菌悬浮液的流变特性将影响它们通过针头收缩剪切以顺利打印的难易程度。因此，对于每个注射器/针头/细菌悬浮液设置，都应重做此校准程序。原则上，注射器校准可以自动化。然而，在实践中，编写这样一条广泛适用于许多用例的代码将具有挑战性。例如，如果用户打算校准 1 mL 注射器约 300 μL 的挤出量，则需要比在 30 μL 目标体积附近校准的用户更频繁地重新加载注射器。由于校准过程开始时 E 步进到体积的校准常数是未知的，因此用户可能无法准确预测实际需要重新加载的频率。此外，为了实现校准过程的自动化，需要指定每个预称量的 1.5 mL 试管的确切位置。为确保所有生物墨水都从针头沉积到管子中以进行精确校准，必须在针头和管底/壁之间进行精确接触。如果没有良好的接触，小液滴可能会保持湿润并附着在针头上。因此，管子之间的任何位置变化都可能极大地导致校准过程中的误差。出于这些原因，作者建议每个用户构建一个适合其独特需求的校准程序。 这里介绍的方法的一个关键特征是能够使用成像直接通过运动和生长可视化细菌在其环境中传播。在早期版本的成像方案中，6 孔板填充了 19 mL 颗粒状水凝胶基质。然而，即使成功地在倒置显微镜上观察到水平细胞线的3D打印，密集的菌落也会在培养基的顶面生长，从而限制了明场显微镜的可视化（图5）。顶面的菌落可能是由于在打印过程中将注射器针头放入介质中或从介质中取出时受到污染造成的。为了规避这个问题，在闪烁小瓶中打印了细胞的垂直线（图6A）。然而，圆柱形小瓶的曲率在成像过程中会导致失真。这导致选择平壁比色皿和组织培养瓶作为打印样品容器，从而实现不失真的成像（图6B-D）。组织培养瓶的一个局限性是小倾斜的颈部，这限制了可以打印的几何形状。 综上所述，该协议允许在长时间尺度上观察复杂多孔环境中的细菌运动和生长。图6B-G显示了使用明场显微镜形成生物膜的霍乱弧菌以及使用激光扫描荧光共聚焦显微镜的大肠杆菌浮游细胞的一些示例，证明了这种方法的多功能性。事实上，水凝胶基质的一个潜在问题是，当使用荧光显微镜成像时，它们可能会产生自发荧光;然而，图6F，G中显示的图像表明，在本文介绍的实验平台中，这种自发荧光是最小的。这种光学显微镜方法的另一个局限性是它们的空间分辨率，这是由~100 s纳米的衍射极限设定的;然而，这个长度尺度远小于单个细菌细胞的大小，因此，光学技术提供了从单个细胞的尺度（图6G）到更大的多细胞菌落的尺度30,31,32,33对细菌细胞进行成像的能力。下面将介绍其他示例。 如上所述，此处介绍的方法可用于对小 （1 mL） 和大 （20 mL） 基质体积中的细菌菌落进行 3D 打印和成像。因此，下面描述了使用不同体积获得的结果的差异，使用3D打印的运动 和非运动霍乱弧菌 菌落作为代表性示例。打印件的空间分辨率（线条宽度）由喷嘴的内径决定。在下面描述的示例中，内径为 0.6 mm 的针会产生 0.6 mm 的初始圆柱形菌落。先前的研究表明，通过使用内径为 ~100-200 μm33 的拉动玻璃毛细管，可以进一步降低打印分辨率。 对于小体积，使用具有两种不同孔径分布的两种不同的颗粒水凝胶基质：一种的平均孔径大于霍乱弧菌细胞的平均直径，0.2-0.4μm36，另一种平均孔径小于该直径。通过对菌落随时间扩展的图像分析，对12天内的样品进行成像和测量（图7和图8）。对于只能通过细胞生长在周围环境中扩散的非运动细胞，所研究的不同基质之间的区域扩张速率相似（图7），表明基质孔径的差异不会影响细胞通过生长的扩散 – 正如预期的那样。相比之下，对于通过主动运动在周围环境中扩散的运动细胞，霍乱弧菌的面扩展速率对于具有较大孔隙的水凝胶基质更高 – 水凝胶颗粒的限制对细胞运动的阻碍较小。细菌传播的这些差异在菌落形态中也很明显（图8）。霍乱弧菌在具有较大孔隙的水凝胶基质中的菌落通过光滑的弥漫羽流扩散（图8A），反映了通过先前观察到的主动运动传播32。事实上，与这种解释一致，在非运动细胞的情况下没有观察到这些弥漫性羽流（图8C）。此外，孔隙足够大，以至于细胞在游过孔隙时不会推动珠子。此外，游泳施加的粘性应力小于1 Pa，不足以使周围的水凝胶基质明显变形。相比之下，具有较小孔隙的水凝胶基质中的菌落仅通过运动和非运动细胞的粗糙分形状羽流扩散（图8B，D），反映仅通过细胞生长扩散，而细胞生长时它们瞬时变形并产生周围的基质。事实上，鉴于水凝胶基质的屈服应力远小于细胞的膨胀压力，在这种小孔径的限制下，基质仅提供微弱的细胞生长抵抗力，并且似乎不会强烈影响3D打印结构，正如我们之前的工作37所验证的那样。 在大体积样品中进行的实验也观察到类似的结果;然而，鉴于这些样品中营养物质的丰度更高，实验可以在更长的时间尺度上维持细胞生长。例如，使用平均孔径小于细胞大小的颗粒水凝胶基质的结果显示 – 因此，细胞扩散主要是由于生长。将样品在颗粒水凝胶基质中成像~30天，并在前150小时内观察到非运动细胞和运动细胞的相似区域扩张;然而，在更长的时间内，观察到样品之间的强烈变异性，一些样品表现出更快的扩散速率（图9 和 图10）。有趣的是，在实验后对水凝胶基质重新取样时（水凝胶基质体积大的一个好处），测量到屈服应力、储存模量和损耗模量的降低（图11），表明基质变得更软。这种变化可能是由于 霍乱弧菌 产生的分子正在改变水凝胶基质的性质并长时间促进细胞扩散，这将在未来的研究中进行有趣的测试。 图 10 显示了导致这些实验的粗糙、分形状菌落形态的示例。 图 1：定制 3D 生物打印机的图像。 （A） 带有改进的注射泵挤出机头的生物打印机，带有一次性鲁尔锁注射器和针头。生物打印机的宽度为 ~46 厘米。（B）在装满卡住水凝胶基质的烧瓶中3D打印细胞的图像。图像的宽度为 87 毫米。 请点击这里查看此图的较大版本. 图2：颗粒水凝胶基质流变特性的表征。 （A） 剪切应力与外加剪切速率的函数关系。（B） 存储模量和损耗模量， 分别为G’ 和 G”，作为振荡频率的函数。图例表示用于制备每个水凝胶基质的水凝胶质量分数。 请点击这里查看此图的较大版本. 图 3：两种代表性颗粒水凝胶基质的孔径测量。 通过跟踪示踪剂，确定每个水凝胶基质的特征孔尺寸分布。数据用 1-CDF 表示，其中 CDF 是累积分布函数。图例表示用于制备每个基质的水凝胶质量分数。 请点击这里查看此图的较大版本. 图4：细菌3D打印过程中形成的气泡示例。 （A） 成像装置示意图。（B） 霍 乱弧菌 生长的快照，在 LB 中肿胀的 1.2% 水凝胶基质中，打印底部（红框）有一个气泡。在37°C下生长59小时后，气泡完全溶解，并且由于水凝胶基质的弹性，菌落塌陷。比例尺 = 2 毫米。 请点击这里查看此图的较大版本. 图5：在6孔板中打印的活态霍乱弧菌水平线的图像，该平板填充了1.2%水凝胶基质，在LB中膨胀，并在37°C下孵育48小时后在顶表面上形成的生物膜。 （A） 成像设置示意图。（B）在3D打印过程中由于污染而在顶面形成的生物膜降低了不透明度，并且无法对水平线进行清晰成像。顶面形成皱纹，可能是由于生长差异造成的。比例尺 = 5 mm. 请点击这里查看此图的较大版本. 图 6：可用于此方法的不同样品容器的示例。（A）在470小时后在装有1.2%颗粒水凝胶基质的玻璃小瓶中打印霍乱弧菌。小瓶的曲率使生长成像变得困难。比例尺 = 5 mm。 （B） 霍 乱弧菌 打印在填充有 1.2% 颗粒水凝胶基质的微比色皿中。平坦的侧面允许清晰的成像，然而，小体积限制了细胞用完生长底物之前的实验时间。（C） 使用变焦镜头成像装置，以在填充有 1.2% 颗粒水凝胶基质的组织培养瓶中打印霍 乱弧菌 。与微型比色皿盒类似，平坦的侧面可以实现清晰的成像。组织培养瓶可以填充更大体积的颗粒状水凝胶基质，从而延长实验时间跨度。（D）在37°C下孵育100小时后，打印在1.2%颗粒水凝胶基质内的 霍乱弧菌 变焦镜头的图像。 比例尺 = 1 mm。 （E） 使用共聚焦显微镜对荧光细胞进行成像设置。（F）在37°C孵育10天后，1.2%颗粒水凝胶基质内荧光 大肠杆 菌共聚焦显微照片的3D投影。 比例尺 = 50 μm。 （G） 水凝胶基质内荧光 大肠杆菌 的单细胞分辨率共聚焦显微照片。比例尺 = 10 μm。 请点击这里查看此图的较大版本. 图 7：打印在 1 mL 颗粒水凝胶支持基质中的 霍乱弧菌 菌落随时间变化的面积扩展。 图上的数据来自 图8的图像分析。观察到运动细胞（闭合的红色圆圈和正方形）比非运动细胞以更快的速度扩散，反映了生长和运动的扩散。此外，具有大孔径（红色方块）的水凝胶基质中的运动细胞比具有0.3μm孔（红色圆圈）的水凝胶基质中的细胞以更快的速度扩散。非运动细胞在两种孔径之间的面膨胀率没有差异，因为它们只是在生长。 请点击这里查看此图的较大版本. 图 8：打印在 1 mL 颗粒水凝胶支持基质中的 霍乱弧 菌菌落。 （A） 0.9%颗粒水凝胶基质中运动 霍乱弧 菌的生长和运动快照，其中孔径大于平均细胞直径。箭头表示由于细胞在水凝胶基质中移动而形成的弥漫羽流。（B） 在孔径小于平均细胞直径的 1.2% 颗粒水凝胶基质中运动霍 乱弧 菌的生长和运动快照。箭头表示由于细胞生长而形成的粗糙的分形状羽流。（C） 0.9%颗粒状水凝胶基质中非运动 霍乱弧 菌的时间演变快照，其中孔径大于平均细胞直径。在这种情况下，无法观察到反映运动的漫射羽流。（D） 在孔径小于平均细胞直径的 1.2% 颗粒水凝胶支持基质中非运动霍 乱弧 菌生长的快照。在这种情况下，再次可以观察到反映生长的粗糙的分形羽流。比例尺 = 1 mm. 请点击这里查看此图的较大版本. 图 9：在 20 mL 1.2% 颗粒水凝胶支持基质中打印的 霍乱弧菌 菌落随时间变化的面积扩展。 观察到非运动细胞（开放圈）和运动细胞（闭圈）在前 100 小时内以相似的速率扩散。100小时后，观察到面膨胀率的差异，这可能是由于长时间变化的演变。 请点击这里查看此图的较大版本. 图10：在37°C下生长的22 mL 1.2%颗粒水凝胶基质中打印的 霍乱弧菌 菌落。 （顶部）运动 霍乱弧菌生长的快照。（底部）非运动 霍乱弧菌生长的快照。在这两种情况下，都可以观察到反映生长的粗糙的分形状羽流。比例尺 = 2 mm. 请点击这里查看此图的较大版本. 图11：实验前（0小时）和实验后（397小时）1.2%颗粒水凝胶基质的流变特性表征。 （A） 剪切应力与外加剪切速率的函数关系。（B） 存储模量和损耗模量，分别为 G’和 G”，作为外加振荡频率的函数。 请点击这里查看此图的较大版本. Gcode 命令 任务 M82型 绝对挤出模式 M302 S0 启用冷挤压 M92 E14575 设置每毫米的挤出步长 G92 X35.61 Y81 Z0 E0.0 将 z 轴和挤出位置设置为零，将 x，y- 位置设置为 35.71 mm 和 y 88 mm，其中 g 代码启动时打印头所在的位置 M221 S100 T0 将流速设置为 100% 货号 M107 关闭风扇 G1 F1 X35.61 Y81 E0.1 将 20 μL 生物墨水以 50 μL/min 的进料速率挤出到基质中，其中设置了当前位置 G0 F200 Z60型 将针从基质中拉出，并以 200 mm/min 的速度对样品进行采样 G0 F500 X65.81 Y81.0 以 500 mm/min 的速度将针头移动到下一个样品连接器 G0 F100 Z0 将针头降低到下一个样品中，使其以100 mm / min的速度开始打印的相同z位置 G1 F1 X65.81 Y81.0 E0.2 将 20 μL 生物墨水以 50 μL/min 的进料速率挤出到基质中，其中设置了当前位置 G0 F200 Z60型 将针从基质中拉出，并以 200 mm/min 的速度对样品进行采样 G0 F500 X96.01 Y81.0 以 500 mm/min 的速度将针头移动到下一个样品连接器 G0 F100 Z0 将针头放入样品连接器中，以100 mm / min的速度开始打印的相同z位置 G1 F1 X96.01 Y81.0 E0.3 将 20 μL 生物墨水以 50 μL/min 的进料速率挤出到基质中，其中设置了当前位置 G0 F200 Z60型 将针从基质中拉出，并以 200 mm/min 的速度对样品进行采样 G0 F500 X126.21 Y81.0 以 500 mm/min 的速度将针头移动到下一个样品连接器 G0 F100 Z0 将针头降低到下一个样品中，使其以100 mm / min的速度开始打印的相同z位置 G1 F1 X126.21 Y81.0 E0.4 将 20 μL 生物墨水以 50 μL/min 的进料速率挤出到基质中，其中设置了当前位置 G0 F200 Z80系列 将针从基质中拉出，并以 200 mm/min 的速度对样品进行采样 表 1：用于打印细菌悬浮液垂直线的 G 代码编程。 补充文件 1：用于注射器挤出机的底部夹 1 mL 一次性鲁尔锁注射器的 STL 文件。请点击此处下载此文件。 补充文件 2：用于注射器挤出机的 1 mL 一次性鲁尔锁注射器顶部夹具的 STL 文件。请点击此处下载此文件。 补充文件 3：用于注射器挤出机的 1 mL 一次性鲁尔锁注射器的注射器适配器的 STL 文件。请点击此处下载此文件。 补充文件4：比色皿样品架的STL文件。请点击此处下载此文件。 补充文件 5：用于组织烧瓶样品架的 STL 文件。请点击此处下载此文件。 补充文件6：用于6孔板和35 mm培养皿打印床的STL文件。请点击此处下载此文件。 补充文件 7：用于粒子跟踪的自定义脚本。请点击此处下载此文件。