Представлено изготовление двухслойного устройства на основе полидиметилсилоксана (PDMS) для получения комбинаторных библиотек в водомасляных эмульсиях (пробках). Необходимое аппаратное и программное обеспечение, необходимое для автоматизации производства свечей, подробно описано в протоколе, а также демонстрируется производство количественной библиотеки флуоресцентных свечей.
Капельная микрофлюидика — это универсальный инструмент, который позволяет выполнять большое количество реакций в химически различных нанолитровых отсеках. Такие системы используются для инкапсуляции самых разных биохимических реакций – от инкубации одиночных клеток до проведения ПЦР-реакций, от геномики до химического синтеза. Соединение микрофлюидных каналов с регулирующими клапанами позволяет контролировать их открытие и закрытие, тем самым обеспечивая быстрое производство крупномасштабных комбинаторных библиотек, состоящих из популяции капель с уникальным составом. В этой статье представлены протоколы изготовления и эксплуатации двухслойного микрофлюидного устройства на основе PDMS под давлением, которое может быть использовано для создания комбинаторных библиотек эмульсий типа «вода в масле», называемых пробками. Благодаря включению программного обеспечения и микрофлюидного оборудования, поток желаемых жидкостей в устройстве можно контролировать и манипулировать им для создания комбинаторных библиотек свечей и для контроля состава и количества составляющих популяций пробок. Эти протоколы ускорят процесс создания комбинаторных скринингов, особенно для изучения реакции на лекарственные препараты в клетках биопсии онкологических больных.
Микрофлюидика позволяет манипулировать небольшими количествами жидкостей в микроканалах1. Масштаб работы типичных микрофлюидных устройств составляет от десятков до сотен микрометров, что позволяет миниатюризировать химические и биологические реакции, тем самым позволяя проводить такие реакции с относительно небольшими количествами реагентов. Первоначально микрофлюидные устройства изготавливались из таких материалов, как кремний2 и стекло3. Несмотря на то, что они все еще используются4, они создают определенные проблемы, такие как совместимость с растворителями, высокая стоимость производства и трудности с интеграцией средств управления потоком жидкости 5,6. Методики изготовления на основе PDMS, называемые мягкой литографией, предлагают недорогую альтернативу быстрому прототипированию устройств7 и возможность изготовления сложных многослойных устройств8. Добавление клапанов и насосов к устройствам PDMS позволяет управлять маршрутизацией и скоростью текучих сред в устройствах 9,10. Было разработано несколько способов проектирования и приведения в действие микроклапанов обратимым или необратимым образом, например, биметаллические клапаны, изготовленные из кремния и алюминия, которые имеют термический привод11 или используют газ, образующийся в результате электрохимической реакции, для отклонения мембраны из нитрида кремния12. Gu et al. демонстрируют использование механических выводов дисплея Брайля для давления на микроканалы для регулирования потока13. Одним из наборов микроклапанов, который приобрел популярность, являются пневматические клапаны на основе PDMS, впервые предложенные группой Stephen Quake14. Обычно такие клапаны состоят из двух ортогональных микроканалов – проточного и управляющего. При нагнетании давления в канале управления тонкая мембрана PDMS отклоняется от проточного канала, перекрывая его и тем самым прерывая поток жидкости. После сброса давления мембрана расслабляется, тем самым открывая канал потока и позволяя возобновить поток жидкости. Таким образом, клапаны PDMS позволяют регулировать расход надежным и реверсивным образом, поскольку канал управления может подвергаться давлению и сбросу давления несколько раз15. Кроме того, поскольку такие клапаны могут приводиться в действие приложением давления, они открывают возможности для цифрового управления и автоматизации16. Кроме того, поскольку они изготовлены из одного и того же материала, они могут быть легко интегрированы в производство устройств на основе PDMS с использованием методов мягкой литографии 8,17,18. Эти особенности делают клапаны PDMS привлекательным выбором для регулирования потока в микрофлюидных устройствах. Торсен и др. использовали принцип таких клапанов для разработки жидкостного мультиплексора — комбинаторного массива пневматических клапанов — для работы с почти тысячей входных каналов потока с двадцатью каналами управления19. Этот принцип был расширен для селективного направления текучих сред в микрофлюидные хемостаты таким образом, что уникальные реакции могут быть проведены одновременно в каждом реакторе 20,21,22,23. Однако такие микрореакторы, хотя и полезны для оптимизации использования ограниченного количества реагентов, не могут распараллеливать несколько реакций и недостаточны для высокопроизводительных исследований.
Капельная микрофлюидика — это подкатегория микрофлюидики, которая включает в себя производство капель путем манипулирования несмешивающимся, многофазным потоком жидкости в микрофлюидных устройствах24. Образование капель включает в себя разрушение непрерывной текучей среды путем введения несмешивающейся жидкости, что приводит к защемлению из-за нестабильности межфазной энергии и образованию эмульсии25. Поверхностно-активные вещества способствуют образованию округлых капель, когда эмульсии покидают микроканал, стабилизируя межфазные энергии26. Более крупные капли, называемые пробками, менее стабильны и могут собираться в удерживающем отсеке (например, по длине трубки) в виде массива водных отсеков, расположенных с обеих сторон одной или несколькими несмешивающимися жидкостями27. В дополнение к миниатюризации и компартментализации, капельная микрофлюидика также обеспечивает повышенную пропускную способность биологических реакций, поскольку может быть получено большое количество монодисперсных капель, каждая из которых служит нанореактором28. Капли, однажды сгенерированные, также могут быть подвергнуты дальнейшим манипуляциям, таким как расщепление 29,30, слияние31,32, сортировка33,34 и сборка в структуры более высокого порядка35,36. Капельная микрофлюидика произвела революцию в нескольких научных областях и технологиях – от ПЦР37 до транскриптомики одиночных клеток38, от открытия лекарств39,40 до вирусологии41, от секвенирования следующего поколения42 до химического синтеза43.
Интеграция мягкой литографии и микроклапанов на основе PDMS с капельной технологией представляет собой мощную комбинацию, которая позволяет регулировать поток жидкости в микроканалах и последующий контроль содержимого капель. В зависимости от открытия и закрытия каналов можно получить отдельные популяции капель, каждая из которых имеет определенный состав. Такая платформа могла бы миниатюризировать, разделять и распараллеливать биохимические реакции и, следовательно, быть полезной техникой для комбинаторногоскрининга. Комбинаторный скрининг — это высокопроизводительный метод генерации десятков тысяч комбинаций выбранных реагентов для получения библиотек, состоящих из отдельных популяций известного состава. Комбинаторный скрининг был использован для обнаружения синергетических эффектов между лекарственными препаратами и антибиотиками для ингибирования роста бактерий45. В области терапии рака комбинаторный скрининг использовался для тестирования комбинаций противораковых препаратов для данного пациента, тем самым продвигая персонализированную терапию46,47. Mathur et al. развили эту технологию, интегрировав комбинаторный подход к штрихкодированию ДНК для оценки изменений транскриптома при высокопроизводительном скрининге лекарств48. Таким образом, комбинаторный скрининг является мощной, но зарождающейся технологией, и существует необходимость в разработке различных микрофлюидных технологий для выполнения и облегчения таких процедур скрининга.
Целью данной рукописи является представление полного набора протоколов для изготовления двухслойного микрофлюидного устройства, способного генерировать комбинаторную библиотеку водомасляных пробок, и описание аппаратного и программного обеспечения, необходимого для работы такого устройства. Поток жидкости регулируется с помощью пневматических клапанов на основе PDMS с регулируемым давлением, которые, в свою очередь, управляются специальной программой LabVIEW. Расход реагентов в аппарате достигается с помощью имеющихся в продаже нагнетательных насосов. Представлен прототип с восемью входами, в котором пробка образована содержимым трех входных отверстий, каждое из которых содержит водный реагент. Водная фаза встречается с непрерывной масляной фазой, а пробки производятся на Т-образном переходе с частотой 0,33 Гц. Функционирование системы демонстрируется путем создания количественной библиотеки, содержащей три различные популяции флуоресцентных свечей. Эта технология и набор протоколов помогут ускорить создание комбинаторных библиотек для целей высокопроизводительного скрининга.
В данной работе представлен набор протоколов для изготовления и эксплуатации микрофлюидного устройства на основе PDMS для автоматизированной генерации комбинаторных библиотек в отсеках типа «вода в масле», называемых заглушками. Сочетание микрофлюидики с капельной технологией обеспечивает мощный метод инкапсуляции небольшого количества реагентов в большое количество отсеков, тем самым открывая возможности для крупномасштабного комбинаторного скрининга.
Ранее было описано несколько технологий для создания химически различных компартментов с помощью микрофлюидики, каждая из которых имеет свои преимущества и ограничения. Kulesa et al.50 описали стратегию инкапсуляции клеток штрих-кодами в капли с использованием микротитровальных планшетов и слияния этих капель с помощью электрического поля для создания комбинаторной библиотеки. Хотя такой подход может генерировать множество комбинаций капель, он ограничен необходимостью ручных операций в рабочем процессе. Tomasi et al.51 разработали микрофлюидную платформу для слияния капли, содержащей сфероид (свободно плавающие клеточные агрегаты), со стимулирующей каплей, тем самым позволяя манипулировать микроокружением сфероида. Этот метод позволяет изучать такие важные явления, как межклеточные взаимодействия и действие лекарств, но он имеет относительно низкую пропускную способность. Eduati et al.46 и Utharala et al.47 разработали микрофлюидную платформу на основе клапанов, которая может автоматически генерировать высокопроизводительные комбинаторные библиотеки. Однако в этих исследованиях клапаны управляются с помощью устройства Брайля, что требует громоздких этапов выравнивания между микроклапаном и микрофлюидным чипом. Ключевой особенностью системы, описанной в данной работе, является реализация пневматических клапанов PDMS для регулирования потока жидкости во входных каналах. Поскольку эти клапаны основаны на PDMS, они могут быть довольно плавно включены в этапы изготовления микрофлюидного чипа. Кроме того, они являются относительно простым вариантом для управления потоком жидкостей во впускных каналах, поскольку они могут приводиться в действие путем подачи давления через внешний источник газа. Наконец, продолжительность и последовательность нагнетания и сброса давления в этих клапанах могут быть запрограммированы, тем самым автоматизируя производство отдельных групп плунжерей с высокой пропускной способностью. Еще одной важной особенностью является использование режимов постоянного давления для впрыска реагентов через входное отверстие, что позволяет отказаться от включения сливных каналов для сброса накопления давления, возникающего в режиме постоянного расхода. Это упрощает конструкцию устройства, снижает потребность в дополнительных клапанах и оборудовании для управления клапанами сливного канала, а также минимизирует потери реагентов.
В то время как изготовление устройств с PDMS относительно несложно, реализация таких устройств требует использования обширной аппаратной атрибутики, такой как пневматические электромагнитные клапаны (для управления приведением в действие клапанов PDMS), нагнетательные насосы (для управления потоком впускных и масляных реагентов) и программное обеспечение (для регулирования электромагнитных клапанов). Несмотря на то, что они представляют собой значительные инвестиции, такая установка обеспечивает стабильность и надежность для успешной работы устройства. Кроме того, аппаратные компоненты и архитектура, описанные в этом протоколе, настраиваются модульным образом. Поэтому для некоторых модулей можно использовать альтернативы, чтобы снизить затраты или адаптировать их к конкретным потребностям. Например, существует множество насосов, которые можно использовать в зависимости от полезности, бюджета, доступности и удобства 52,53,54. Дополнительные компоненты, такие как резервуары для жидкости и регуляторы температуры, могут быть включены для чувствительных входных реагентов23. Кроме того, эта конструкция может быть увеличена или уменьшена для удовлетворения конкретных научных потребностей. Например, в этой статье описан прототип с восемью входами, который позволяет комбинировать восемь уникальных реагентов для производства пробок. Это может быть увеличено до устройства с 16 входами, что позволяет использовать большее количество входов и их более крупные комбинации. Следовательно, потребуются дополнительные каналы управления и электромагнитные клапаны для работы с входными отверстиями, но такой прототип позволяет генерировать более крупные и разнообразные комбинаторные библиотеки. Наконец, в этой статье каждая популяция пробки образуется путем открытия трех из восьми водных входных отверстий микрофлюидного устройства. Было отмечено, что для такой конфигурации давление приблизительно 200 мбар для нефтяных реагентов и 400 мбар для водных реагентов соответствует режиму производства пробки, который приводится в действие исключительно приводом клапана. Когда к маслу (маслам) прикладывалось более высокое давление, наблюдалось разрушение свечей, а применение более низкого давления приводило к расплавлению свечей. Оптимальный режим давления для производства пробок зависит от широкого спектра факторов, таких как количество входов, способствующих образованию пробки, характер и вязкость жидкостей, а также размеры каналов, и должен быть оптимизирован по мере необходимости.
Одним из недостатков работы в режиме постоянного давления является то, что жидкости с разной вязкостью имеют разную скорость потока при постоянном давлении. Поэтому необходимо убедиться, что водные реагенты, протекающие через входные отверстия, имеют сопоставимую вязкость. Использование жидкостей различной вязкости повлияет не только на поток жидкости во входных каналах, но и на образование пробки на Т-образном переходе, тем самым ставя под угрозу состав популяций пробки. Еще одним недостатком является загрязнение популяции пробок остаточными реагентами на Т-образном переходе. Когда устройство переключается между производством различных популяций свечей, первая/последняя вилка в последовательности каждой популяции имеет тенденцию к загрязнению предыдущей или следующей популяцией. Это можно преодолеть, создав дополнительные реплики каждой популяции и не считая загрязненной пробки во время анализа. Наконец, существует также возможность различий между отдельными устройствами, возникающих из-за несоответствий в изготовлении и/или внешних источников (колебания давления). Эту проблему можно смягчить, повторно используя один микрофлюидный чип несколько раз и гарантируя, что полный запуск комбинаторной библиотеки выполняется на одном чипе, чтобы свести к минимуму влияние этих несоответствий.
Микрофлюидное устройство и сопутствующий набор операционных протоколов, представленных в этой статье, были использованы для демонстрации создания количественной комбинаторной библиотеки свечей. Таким образом, эта платформа может быстро генерировать комбинаторные библиотеки различных популяций плагинов с высокой пропускной способностью. В результате, такие технологии могут быть использованы для различных целей скрининга, включая, но не ограничиваясь этим, комбинаторный скрининг лекарственного препарата на образцах биопсии пациента, посредством чего небольшое количество клеток, извлеченных из биопсии, может быть распределено в большом количестве капель и обработано большой комбинацией противоракового препарата для оптимизации индивидуальной терапии для данного образца пациента и, таким образом, ускорить персонализированнуютерапию рака. 48,55.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Стейси Мартина из NanoLab TuE за помощь в осаждении паров HMDS. Это исследование финансировалось Институтом сложных молекулярных систем (ICMS) при TU/e и Нидерландской организацией научных исследований (NWO) Программа гравитации IMAGINE! (номер проекта 24.005.009).
1,1,3,3 tetramethyldisiloxane | Merck Life Science NV | MFCD00008256 | |
4 channel digital input/output module | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-504 | |
Acetone | Boom Labs | BOOMSKEUZW3 | |
Analysis Software | Eindhoven University of Technology | https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE | |
AZ 40XT 11D | Merck Life Science NV | 212299 | Positive photoresist |
AZ 726 MIF developer | Merck Life Science NV | 10055824960 | Developer for positive photoresist |
Biopsy Punch, Rapid Core | World Precision Instruments Germany, GMBH | 504529 | 0.75 mm ID, W/Plunge |
Blue food dye | PME | FC1036 | |
Controller end module | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-600 | |
Ethernet Controller | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-881 | |
FC-40 | Merck Millipore | F9755-100ML | |
Fluigent flow unit | Fluigent | FLU-S-D | |
Fluigent pressure system | Fluigent | MFCS-EZ | 0 – 2 bar |
Fluorescein | Merck Life Science NV | MFCD00005050 | |
Hot plate | Torrey Pines Scientific | HP61 | |
Inverted microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti-E | |
Isopropanol | Boom Labs | BOOMSKEUZE3 | |
LabVIEW (Software Version 20) | Eindhoven University of Technology | https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/tree/main/LabVIEW_8_inlet_device_ VERSION_1 |
All files have been saved for LabVIEW version 20. It is advised to use this version or higher to open the files. |
Luer stubs | Instech Laboratories, Inc. | LS23 | 23 ga, 0.5" |
Male Luer to barb connectors | Cole Parmer | 45505-32 | 3/32" ID |
MasterFlex PTFE tubing | Avator/VWR | 48634 | |
Microscope Slides | VWR | 470150-480 | |
Microscope slides, Plain | Corning | 2947-75X50 | |
Mineral Oil | Merck Millipore | 330760-1L | |
mr DEV 600 | Micro resist Technology | R815100 | Developer for negative photoresist |
Oven | Thermo Scientific | Heraeus T6P 50045757 | |
Oxygen plasma asher | Quorum Technologies | K1050X | |
Photomask | CAD/Art Services, Inc. | ||
Photomask Design | Eindhoven University of Technology (Adapted from Merten Lab, EPFL) | https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/blob/main/8_inlet_JoVE_device_design.dwg | |
Pneumatic valve array | FESTO | 1x 8 valve array, Normally closed valves | |
Silicon Wafers | Silicon Materials | <1-0-0>, 100 mm diameter, 525 μm thickness | |
Single edge blades | GEM Scientific | ||
Soft tubing | Fluigent | 1 mm ID, 3 mm OD | |
Spin coater | Laurell Technologies Corporation | WS-650MZ-23NPPB | |
Stereo microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
SU-8 3050 | Kayakli Advanced Materials | Y311075 1000L1GL | Negative photoresist |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow | 1317318 | |
Syringe | B Braun Injekt – F Fine Dosage Syringe | 10303002 | |
UV-LED exposure system | Idonus | UV-EXP150S-SYS | |
Vacuum pump | Vacuumbrand GmbH | MD1C | |
Weighing scales | Sartorius | M-prove |