用于组合塞生产的双层微流控装置

1. 软光刻 注：微流控器件由两层组成，流动层和控制层（图1A），每层分别使用正极和负极光刻胶由单独图案的晶圆模制而成（有关光刻胶和显影剂的详细信息，请参阅 材料表 ）。 如下所述执行流动层的晶圆制造。将硅晶片（直径100mm，方向，525）在250°C下脱水过夜（12-16小时）。 让晶圆冷却，然后再进行旋涂。将 3-4 mL 的正极光刻胶涂在晶圆中心。 以 1400 rpm （344 rpm/s） 旋转 40 秒，以获得 45 μm 的特征高度。 使用温度斜坡在加热板上进行软烘烤，以 450 °C /h 的速度从 35 °C 增加到 105 °C。 此步骤也可以在超细纤维组织上进行，以防止直接接触并最大限度地减少光刻胶的冒泡。从加热板中取出晶圆，让它在超细纤维组织上冷却。 将与流动层（乳液面朝下）相对应的光掩模（商业生产）放在抗蚀涂层硅片上，并在紫外线灯下以 10 mW/cm 2 的速率曝光，直到总曝光达到 200 mJ/cm2 。 使用两个加热板 – 一个在65°C，另一个在95°C – 在板上进行暴露后烘烤 – 分别为1分钟和7分钟。 通过将晶圆转移到装有正性光刻胶显影剂的培养皿中来显影晶圆。在台式振荡器上摇晃培养皿，使晶圆完全浸没，搅拌培养皿，并定期刷新显影液，直到晶圆完全显影，并且可以清楚地看到特征。 使用软化水冲洗掉晶圆上的残留光刻胶，并在立体显微镜下检查通道内是否有任何残留物。通过将晶圆返回到显影液中或使用微量移液管小心地将显影剂添加到晶圆中来去除残留物。完成后，使用氮气喷枪干燥晶圆。 通过将晶圆放在设置为110°C的加热板上25分钟来回流焊晶圆。此过程会产生圆形特征。 按照步骤 1.3 中所述进行晶圆的硅烷化。注意：六甲基二硅氮烷 （HMDS） 气相沉积也可以在应用光刻胶之前在硅晶圆上进行，以提高光刻胶和晶圆之间的粘附力。 如下所述，为控制层执行晶圆制造。取另一个硅晶片，将其置于设置在110°C的加热板上脱水15分钟。 取出晶圆并让其冷却至室温，然后再进行旋涂。 将 5 mL 的负极光刻胶涂在晶圆的中心。 使用以下自旋协议获得 40 μm 的特征高度：500 rpm（100 rpm/s 加速度）为 5 s，1400 rpm（300 rpm/s）为 33 s，最后以 300 rpm/s 减速至 0 rpm 5 s。 使用两个分别设置为 65 °C 和 95 °C 的独立加热板进行软烘烤 1 分钟和 15 分钟。从加热板中取出晶圆，让它在超细纤维组织上冷却。 将与控制层（乳液面朝下）相对应的光掩模（商业生产）放在抗蚀剂涂层的晶圆上，并将晶圆暴露在紫外灯下，设置为 15 mW/cm2，直到总曝光达到 250 mJ/cm2 。 使用两个加热板 – 一个在65°C，另一个在95°C – 并分别对晶圆进行2分钟和5分钟的曝光后烘烤。从加热板中取出晶圆，让它在超细纤维组织上冷却。 通过将晶圆转移到装有负性光刻胶显影剂的培养皿中来显影晶圆 4 分钟。刷新开发人员并继续该过程 4 分钟以上。 用异丙醇冲洗晶圆以去除残留的光刻胶，并使用立体显微镜检查晶圆沟道内是否有任何残留物。 通过将晶圆返回到显影液中或使用微量移液管小心地将显影剂添加到晶圆中来去除残留物。完成后，使用氮气喷枪干燥晶圆。 一旦完全显影，通过将晶圆放在设置为95°C的加热板上10分钟来硬烘烤光刻胶。 按照步骤 1.3 中所述进行硅烷化。 如下所述进行硅烷化。将晶圆放入干燥器中。将一个玻璃瓶放入干燥器中，加入 4-5 滴 1,1,3,3-四甲基二硅氧烷。注意：1,1,3,3-四甲基二硅氧烷无毒，但易燃。可以使用其他硅烷，但它们可能有毒。建议在穿着必要的个人防护设备 （PPE） （如实验室外套、眼镜和丁腈手套）的情况下在通风橱中进行硅烷化。 拉真空 15 分钟，将干燥器密封 12-16 小时，让硅烷沉积在晶圆上。 打开干燥器并处理掉玻璃瓶。将晶圆放入干净的培养皿中。 如下所述进行微流控设备制造。注意：以下协议改编自以前的作品23。准备两个单独的PDMS解决方案 – 一个用于流动层，另一个用于控制层。对于每种溶液，将PDMS套件的基础剂和固化剂混合在烧杯中，并使用混合棒搅拌。控制层需要10 g基础剂和0.5 g固化剂（20：1比例），而流动层需要40 g基础剂和8 g固化剂（5：1比例）。 在干燥器中对PDMS溶液进行脱气，直到溶液无气体。 将硅烷化流动层晶圆放入覆盖有箔纸的培养皿中，并将相应的PDMS溶液倒在晶圆上。将培养皿放回干燥器中，并拉动真空以进一步脱气（约20分钟）。 用相应的PDMS溶液旋涂硅烷化控制层晶圆。将 3-4 mL 溶液倒在晶圆中心，以 1500 rpm 和 408 rpm/s 的速度旋转 20 秒。将晶圆放在封闭培养皿中的水平表面上 20 分钟。 将流动层和对照层置于80°C的烤箱中18-20分钟。定期监测两层，检查它们是否固化。当它们足够坚韧以具有延展性但略带粘性时，这些层就准备好了，因为这改善了两层之间的粘合。 用手术刀在流态层晶圆上的每个器件周围切出PDMS。确保不要切得离特征太近，并在特征和 PDMS 的边缘之间留出大约 2 厘米的空间。从硅晶圆上分离后，在特征侧用胶带覆盖 PDMS 模块，以避免任何灰尘污染。 一旦所有PDMS模块都被切下，将它们一个一个地放在相应的控制层晶圆上，通过肉眼进行粗略对准。 在将所有模块放置在控制层上的相应区域后，调整每个模块的位置，使控制阀重叠在相应的流道上以完成对准。这也可以在体视显微镜的帮助下进行。 通过施加压力去除两层之间的气穴。如果气穴位于要素上或附近，请注意在施加压力时不要塌陷通道。 将设备放入80°C烤箱中，并让它们粘合12-16小时。在每个设备上放置 100 克重物，以改善两层之间的粘合。 取出晶圆并切下每个单独的设备。将器件从控制层晶圆上剥离，并用胶带覆盖特征侧。 将每个单独的设备放在切割垫上，特征面朝上，并使用 0.75 毫米活检打孔器为八个流层入口、八个控制层通道入口、进油口和出口中的每一个打孔，特征面朝上。 用显微镜载玻片和单个设备装入等离子离子分析仪，取下胶带，特征面朝上。以 30 W 的功率进行氧等离子灰化，持续时间为 20 秒。 灰化完成后，立即取出设备和载玻片，并将设备的特征面朝下放在载玻片上。PDMS和玻璃之间的粘附力应该立即用肉眼看到。对任何有气穴的区域施加压力，以将空气挤出。 将设备放在设置为110°C的加热板上60分钟，顶部放一个重物，以改善PDMS与玻璃的粘合。 2. 硬件设置 注：与微流体设备的连接示意图如图 1B 所示，使用必要硬件实现此类方案如图 2 所示。 如下所述设置气动阀。注意：调节芯片上的PDMS阀的每个控制通道又由单个电磁阀控制。这里展示的原型由八个控制通道组成（图1A），因此需要八个电磁阀。电磁阀使用定制的LabVIEW软件程序（主接口程序; 图3 和 补充文件1、补充文件2、补充文件3、补充文件4）。该程序通过TCP连接（补充文件5、补充文件6）向WAGO控制器发送MODBUS命令。使用以太网电缆将WAGO设备连接到带有LabVIEW程序的计算机。继续将电磁阀按顺序连接到WAGO控制器上的端口。有关更详细的描述，请参阅先前描述的协议23。 使用 1/4 英寸管将电磁阀阵列连接到压缩空气源，并将阀阵列的压力设置为 3.5 bar。在该系统中，使用了标记为 9-16 的八个阀门。 如下所述设置压力调节器。注意：市售的压力泵用于控制流体流量（图 2）。一个八端口和一个四端口泵组用于容纳设备中的八个进水口和两个进油口。每个端口的压力都通过制造商提供的软件进行调节。将压力泵连接到压缩空气源，确保提供的压力不超过泵允许的最大压力（八端口和四端口控制器均为 2.2 bar）。 使用 USB 连接器将压力泵连接到计算机。 一旦泵打开，它们应该在相应的软件中可见。设置泵时将压力设置为零。 将公鲁尔器连接到 3/32 英寸倒钩连接器，连接到控制器上的 12 个母鲁尔锁输出端口中的每一个。 将一根软管（外径：3 毫米，内径：1 毫米，长：15 厘米）连接到倒钩。将另一个公鲁尔连接到 3/32 in 倒钩连接器到软管的另一端。 将鲁尔短截线（23 G，0.5 in）连接到倒钩连接器。此时，压力调节器已设置好并可以使用。 3. 微流控装置设置 如下所述连接控制通道管道（图 2）。对于每个控制通道，切割一段聚四氟乙烯 （PTFE） 管（外径：0.042 英寸，内径：0.022 英寸）。将 23 G， 0.5 的引脚插入鲁尔短管的一端。 将鲁尔短管连接到公鲁尔到 3/32 倒钩尼龙连接器。将连接器的倒钩插入一段聚氨酯管（外径：4 毫米，内径：2.5 毫米）。将聚氨酯管的另一端直接连接到电磁阀。 将注射器装满水，并在末端连接一个 23 G、0.5 英寸的鲁尔短管。 将PTFE管的自由端连接到该注射器，并注入水，直到大约穿过管子的一半。 从注射器上断开管子，并将管子的自由端插入相应控制通道的冲孔中（图1A-C 1-8）。重复上述步骤，直到每个控制通道都连接到其相应的电磁阀。注：本文中，电磁阀 9-16 分别连接到对应于 C1 至 C8 的控制通道。虽然这些可以以任何方式连接，但重要的是要记住连接的顺序和顺序，尤其是在操作主接口程序时。 使用主接口程序（图 3）打开所有电磁阀 （对所有控制通道加压）。这会将流体从管道中推入微流体装置的控制通道，从而将其填充。加压阀和减压阀的示例如图 4 所示。 如下所述连接试剂并灌注设备。通过在主接口程序中按下 Pressurize all Control Channels 按钮，确保所有控制通道都已加压（图 3）。 对于每种水性试剂，切一段 PTFE 管（外径：0.042 英寸，内径：0.022 英寸），以将泵连接到微流体装置入口的入口。将其中一个管道连接到步骤 2.2.6 中的鲁尔短管。 用所需的试剂填充注射器，并在末端连接一个 23 G， 0.5 英寸的鲁尔短管。 将试剂注入相应的 PTFE 管中，直到管子装满。注意试剂不要进入泵组的输出端口。 将管道的自由端插入微流控芯片中的相应入口。 使用提供的软件对每个入口水试剂施加 400 mbar 的压力。 使用主接口程序（图 3）按顺序对控制通道进行减压，以确保所有试剂都已到达设备的 T 形接头。如果需要，通过按下盒子中程序上的相应按钮来启动各个阀门 控制通道 手动加压。 对油试剂重复步骤 3.2.3 至 3.2.5。对每种进油试剂施加 400 mbar 的压力。 通过按下减 压所有控制通道 （图 3）同时对所有控制通道进行减压，直到从设备中排出所有空气。这可以通过肉眼或显微镜观察到。 按 Pressureize All Control Channels 按钮对所有控制通道加压（图 3）。在此阶段，所有试剂均已连接，设备已启动并可以使用。 如下所述对实验进行编程和执行。将要生成的每个插件群的组成、序列和重复编码到一个.csv文件中，如 补充文件 7 所示，该文件用作主接口程序中 自动实验 的输入（图 3）。如果对应于需要打开的入口，则用 0 标记必要的控制通道，如果需要关闭，则用 1 标记。.csv文件中的每一行对应于一个不同的插头组。 通过单击“实验文件”选项卡中的“文件夹”按钮，将.csv加载到“主界面”程序上。 在程序中输入相关字段，例如实验迭代次数（以确定给定的塞子序列产生多少次）、减压时间（确定入口通道需要打开多长时间以及相应的控制通道需要以毫秒为单位减压）、加压时间（以确定入口需要在塞子组序列之间关闭多长时间（以毫秒为单位）。 在 条形码入口 （最多 3 个通道）部分中选择与条形码生产相对应的入口通道以及它们需要打开的持续时间（条形码时间（毫秒））。或者，这些条形码也可以硬编码到输入.csv文件中，如 补充文件 7 所示。 将进油试剂的压力降低到 200 mbar。 在出口处连接所需长度的 PTFE 管（外径：0.042 英寸，内径：0.022 英寸）以收集塞子。为确保均匀的塞子生产，请使用大约 100 厘米的管子预填充塞子进行收集。这是为了中和出口处的压力差，这种压力差是由管道中的塞子收集所施加的。 按 Run Experiment 启动程序并插入生产。 如下所述执行数据记录和分析（见 图 5）。注意：本节专门概述了一种分析荧光插头的方法。根据生成的插头的性质，可以根据需要更改此部分。在注射器中注入油（矿物油或氟化油），并在末端连接 23 G 0.5 鲁尔短管。将注射器固定在泵上。 将填充的收集管的一端连接到注射器上的鲁尔管。将填充的收集管的另一端固定在显微镜的物镜上方。 在靠近物镜的管道末端下方放置一个废物储存器。 将显微镜聚焦在管子的给定区域，并将其设置为在所需通道中记录荧光。 将泵的流速设置为 50 μL/min。 将荧光通道的视频录制为.avi文件。 使用提供的 python 脚本（补充文件 8）分析 .avi 文件，以提取 .avi 文件每帧预定义感兴趣区域 （ROI） 的平均荧光（补充 文件 9 中给出了示例）。 使用提供的自定义 R 脚本（补充文件 10）提取条件并绘制原始数据和峰值高度。注：本文使用补充文件 10 中的 R 脚本进行分析。 补充文件 11 中提供了此脚本中用于切割数据、使用条形码检测条件以及分析单个插头和绘图的峰高的定制 R 函数。