מערכת צנצנות זכוכית רב-תכליתית ליצירת פרופיל הפרשה סמי-הידרופוני של שורשים

1. הכנת שתילים: עיקור פני השטח של זרעים הערה: עיקור פני השטח של זרעים וכל השלבים הבאים חייבים להיעשות בתנאים סטריליים אלא אם כן צוין אחרת. שלבים 1.1 עד 1.4 ספציפיים לעיקור פני השטח של זרעי A. thaliana . למיני צמחים אחרים יש שינויים חלופיים בגודל הצינור (בהתאם למספר הזרעים וגודל הזרעים), זמן בתמיסות ופתרונות עיקור (טבלה 1). מוסיפים זרעים לצינור מיקרוצנטריפוגה (מקסימום 20 מ”ג זרעים) ומכסים את הזרעים באתנול 70%.אזהרה: אתנול דליק. אין להשתמש ליד להבה גלויה. מעבירים את צינורות המיקרוצנטריפוגות הסגורות לשייקר למשך 15 דקות, ומכוונים את הסיבוב כך שהזרעים יהיו נסערים בעדינות. בזהירות להסיר 70% אתנול עם פיפטה ולהחליף אותו עם 100% אתנול. חזור על שלב 1.2. הסר 100% אתנול וייבש את הזרעים על ידי השארת מכסי צינור מיקרוצנטריפוגה פתוחים בזרימת אוויר סטרילית. לאחר שהזרעים יבשים, פזרו אותם באופן שווה על מדיום 0.5x Murashige ו-Skoog (MS) עם 0.7% פיטו אגר על ידי הזזת הצינור או שימוש במלקחיים סטריליים. סגרו את צלחות האגר ואטמו אותן בסרט מיקרו-נקבוביות בקוטר 1.25 ס”מ. מניחים את הלוחות אופקית על מדף בתא הגידול (16 שעות בהיר / 8 שעות כהות, 22 ° C יום / 18 ° C לילה, 150-160 μmol m-2 s-1). 2. הכנת שתילים: העברת זרעים מונבטים לצלחות טריות הערה: השלבים הבאים ספציפיים עבור A. thaliana ואינם נחוצים עבור מינים אחרים. לאחר הנביטה, העבירו 5 עד 6 שתילים לצלחות פיטו אגר חדשות של 0.7% עם מדיום 0.5x MS על-ידי מיקום השתילים באופן ליניארי, כ-3 ס”מ מלמעלה (ראו את מיקום הרוזטה באיור 2D). אטמו צלחות אגר עם סרט מיקרו-נקבוביות בקוטר 1.25 ס”מ וגדלו במאונך בתא הגידול (איור 2D) עד שהשתילים מוכנים להעברה לצנצנות 15-18 יום לאחר הנביטה (טבלה 2). 3. הכנת מערכת הידרופונית: התקנת צנצנת הוסיפו 150 מ”ל של חרוזי זכוכית נקיים בקוטר 5 מ”מ לכל צנצנת נקייה וסגרו עם המכסה (איור 1A).הערה: בפרוטוקול זה, חרוזי זכוכית 5 מ”מ מתאימים לרוב המינים22, אך ניתן להתאים את גודל החרוז במידת הצורך. הניחו מספיק נייר אלומיניום על הצנצנות הסגורות כדי לכסות את צומת המכסה לצנצנת ואת האוטוקלאבה (121°C למשך 20 דקות) (איור 1B). שמרו את הצנצנות המוכנות מכוסות עד שהצמחים מוכנים להעברה (טבלה 2). 4. הכנת מערכת הידרופונית: הוספת שתילים כאשר השתילים מוכנים להעברה לצנצנות (טבלה 2), הסירו את רדיד האלומיניום ואת מכסי הצנצנות בספסל הסטרילי. אם יש לחסן את הצנצנות בחיידקים, בצע את השלבים הבאים לפני המעבר לשלב 4.3; אחרת, דלג על שלב 4.2.באמצעות לולאת חיסון סטרילית, בחר מושבות בודדות מתרביות חיידקים טהורות על צלחות אגר ותלה אותן ב 750 μL של סטרילי 10 mM MgCl2. חזור על הפעולה עד שהפתרון עכור. אופציונלי: יש לשטוף את המתלה 3x עם 750 μL של 10 mM MgCl2 סטרילי על ידי 5 דקות צנטריפוגה ב 1,000 × גרם ובטמפרטורת החדר ולאחר מכן הסרת supernatant ותרחיף של הגלולה ב 750 μL של 10 mM MgCl2. אופציונלי: אם מחסנים מספר זני חיידקים שונים, ערבבו את המתלים של זנים בודדים שהוכנו בשלבים 4.2.1-4.2.2 ביחסים שווים לפני שתמשיכו. כוונן את הצפיפות האופטית באורך גל 600 ננומטר (OD600) ל- 0.2-0.4 אינץ’ בתווך MS 0.5x (pH 5.7 עד 5.9, מותאם עם KOH) או אמצעי גידול אחר לפי בחירה (ראה שלב 4.3). מדוד שוב את OD600 כדי לבדוק אם התמיסה דוללה כראוי.זהירות: KOH הוא קורוזיבי; יש ללבוש כפפות ומעיל מעבדה. לדלל את המתלה עוד יותר OD600 0.002-0.004 באותו מדיום (דילול 1:100).הערה: צפיפות התאים הסופית תהיה תלויה בזן החיידקי בו נעשה שימוש, אך מניסיוננו, חיסון זה מתאים לכ 3-6 × 105 תאים mL-1. מוסיפים 35 מ”ל מהדילול הסופי לכל צנצנת. הוסף 35 מ”ל של מדיום גידול סטרילי כדי לשלוט בצנצנות. ערבבו את החרוזים לציפוי אחיד במדיה של 0.5x MS לפני העברת הצמח, כך שהשורשים לא יתייבשו. המשך לשלב 4.4. הוסף 35 מ”ל של 0.5x MS בינוני לכל צנצנת (pH 5.7 עד 5.9, להתאים עם KOH). ערבבו את החרוזים לציפוי אחיד עם מדיה של 0.5x MS לפני העברת הצמח כדי שהשורשים לא יתייבשו.הערה: ניתן לשנות את מדיום הגידול, לדוגמה, על ידי הסרת חומרים מזינים, תוספת של אוסמוליטים כדי לגרום ללחץ מלח, או שימוש בערכי pH שונים או אמצעי צמיחה. זהירות: KOH הוא קורוזיבי; יש ללבוש כפפות ומעיל מעבדה. מניחים 3-5 צמחי A. thaliana בצנצנת על ידי הנחת מערכות השורשים בין חרוזי הזכוכית.הערה: מספר הצמחים בכל צנצנת שונה עבור מינים אחרים (טבלה 2). הניעו את החרוזים בעזרת מלקחיים סטריליים או כפות כדי לכסות את השורשים ולהרים את העלים מחוץ למדיה (איור 1C).הערה: הזיזו בזהירות את הצמחים והחרוזים כדי למנוע שבירת שורשים ולחץ על הצמחים. הוסיפו 2 רצועות של סרט מיקרו-נקבוביות בקוטר 1.25 ס”מ לאורך החלק העליון של הצנצנות והניחו בעדינות את המכסה מעל (איור 1D-F).הערה: אין ללחוץ כלפי מטה על המכסה כדי למנוע הפרעה לחילוף האוויר. כסו את הרווח בין המכסה לצנצנת בסרט מיקרו-נקבוביות בקוטר 2.5 ס”מ כדי לשמור על סטריליות תוך מתן אפשרות לחילופי אוויר, והכניסו את הצנצנות לתא גדילה (איור 1G,H). הציבו 4-8 צנצנות לכל תנאי ניסוי, בהתאם לשאלה הביולוגית ולשונות הצפויה. הקפד לכלול בקרות ביולוגיות שליליות (למשל, צנצנות ללא צמחים) כדי להסביר את הרקע המטבוליטי של מערכת הניסוי. הגדר את אותו מספר משכפלים לבקרות שליליות כמו עבור טיפולים ניסיוניים (למשל, quadruplicates). לתקופות צמיחה ממושכות, החלף את מדיום הצמיחה מדי שבוע: הסר את שארית מדיום הגידול בפיפט נפחי של 25 מ”ל והוסף 35 מ”ל של מדיום טרי. 5. אוסף של הפרשות שורש כאשר הצמחים מגיעים לגיל הרצוי, הסירו את סרט המיקרו-נקבוביות בקוטר 2.5 ס”מ ואת המכסה בספסל הסטרילי.הערה: עבור A. thaliana בתנאי הצמיחה שלנו, 21 יום לאחר הנביטה מייצג שלב וגטטיבי בוגר לפני תחילת הפריחה. שלב ההתפתחות הווגטטיבית הוא ספציפי למיני הצמחים, ועיתוי תקופת הצמיחה משתנה עם מיני הצמחים; עיתוי זה ניתן לשינוי בהתאם לשאלת המחקר. לבדיקת סטריליות, aliquot 20 μL של מדיום צמיחה ו pipet על לוחות אגר LB.עבור צנצנות מחוסנות, aliquot 100 μL של מדיום גידול לשימוש עבור ספירת יחידה יוצרת-מושבה (CFU) (למשל, בסדרת דילול23).הערה: מניסיוננו, צפיפות החיידקים נעה בטווח של 105-10 8 תאים חיים mL-1 של מדיום גידול. הסר כמה שיותר מדיום צמיחה עם צינור נפח 25 מ”ל, הימנעות נזק לשורשים. הוסף 50 מ”ל של אמצעי איסוף (למשל, 20 מ”מ אמוניום אצטט; pH 5.7-5.9 מותאם עם HCl) על ידי פיפטוף לאורך דפנות הצנצנת כדי למנוע הרטבת העלים. סוגרים את הצנצנות עם מכסים ודגרים עליהן בתנאים סטריליים לזמן הרצוי של איסוף exudate. עבור ניסויים תלויי זמן, שעתיים הן חלון איסוף טוב.אזהרה: HCl הוא קורוזיבי; יש ללבוש כפפות ומעיל מעבדה. לזמני איסוף שורשים ארוכים יותר, עטפו שוב את העפעפיים בנייר דבק והעבירו את הצנצנות לתא הצמיחה. לאחר שעתיים, הסר את הכמות הרצויה של אמצעי איסוף לתוך צינורות (למשל, 50 מ”ל עבור בדיקות או ניתוחים באמצעות exudates מרוכז, או 2 מ”ל לשימוש ישיר). אחסן את הפרשת השורש שנאספה ב -80 °C עד לעיבוד או ניתוח נוספים.כאשר עובדים עם צנצנות מחוסנות, צנטריפוגו את ההפרשים שנאספו במשך 10 דקות ב 5,000 × גרם ו 4 ° C ורק להשתמש supernatants עבור הניתוח. לחלופין, יש לעקר את ההפרשה באמצעות מסנן של 0.22 מיקרומטר או 0.45 מיקרומטר. אם הניסוי הוא חלק מסדרת זמן, הסר את כל אמצעי האיסוף הנותרים מהצנצנות והוסף 35 מ”ל של מדיום 0.5x MS. החליפו את המכסה ואת סרט הדבק בקוטר 2.5 ס”מ לפני החזרת הצנצנות לתא הגידול. מדדו את השורש וירו במשקל טרי של כל הצמחים בצנצנת אחת כדי לנרמל מאוחר יותר את הפרשת השורש לפי משקל הצמח.הערה: ניתן לדגום רקמות צמח בנוסף במידת הצורך. 6. עיבוד הפרשות שורש עבור ספקטרומטריית מסות בהתאם לשיטה האנליטית, יבש בהקפאה את השורש מפריש כדי להתרכז ולהסיר את מדיום האיסוף (-80 ° C ב 0.37 mbar עד שאין נוזל). יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לניתוח מוכן.הערה: הנתונים המוצגים כאן נוצרו באמצעות ניתוח TOF-MS בהזרקת זרימה במכשיר זמן טיסה מרובע בעל מסה מדויקת. לפני ההזרקה למכשיר האנליטי, יש ליצור מחדש הפרשים מיובשים בהקפאה או לדלל הפרשי שורש לא מעובדים באמצעי איסוף בהתאם למשקל הטרי של השורש.הערה: מדיום האיסוף נבחר כך שיתאים לספקטרומטר המסות. עם זאת, בהתאם לשיטה האנליטית, ייתכן שיהיה צורך בשלבי התפלה לפני ההזרקה.