Protocolos de treinamento envolvendo reforço positivo para procedimentos de criação de rotina em coelhos foram desenvolvidos e provaram ser bem-sucedidos, pois os coelhos mostraram de forma confiável os comportamentos treinados no exame geral semanal. Pegar os coelhos com a caixa de transporte foi menos aversivo do que a técnica de manuseio convencional.
Técnicas de manejo e treinamento não aversivas para animais de laboratório são necessárias para facilitar os procedimentos experimentais e de rotina de criação, melhorando o bem-estar animal e a qualidade científica. O treinamento com clicker foi utilizado para desenvolver protocolos de treinamento para coelhos para refinar os procedimentos estressantes de criação de rotina geralmente associados a levantá-los (ou seja, ser pego do chão) / contê-los (ou seja, ser segurado nos braços de um humano). Treze fêmeas de coelhos brancos da Nova Zelândia foram treinadas ao longo de três semanas. Todos os coelhos aprenderam os comportamentos de objetivo predefinidos: eles seguiram o bastão alvo, pularam na balança, entraram em uma caixa de transporte e empinaram enquanto colocavam as patas dianteiras na mão do treinador. Além disso, dez animais pularam do chão para o colo do treinador sentado e permitiram que o treinador levantasse as patas da superfície enquanto estava sentado no colo do treinador. Para alguns indivíduos, os protocolos tiveram que ser adaptados por etapas intermediárias adicionais. No final do treinamento, os coelhos mostraram de forma confiável os comportamentos de meta esperados, mesmo após intervalos de treinamento curtos e longos. Com poucas exceções, uma pessoa familiar que não seja o treinador poderia obter os comportamentos objetivos dos coelhos (generalização), embora mais sessões fossem necessárias para a generalização. No teste de abordagem voluntária, os coelhos preferiram interagir com o treinador na1ª tentativa, mas passaram tanto tempo com uma pessoa desconhecida quanto com o treinador na2ª tentativa. As observações comportamentais sugeriram que pegar os coelhos com a caixa de transporte, conforme descrito no protocolo, em vez de prendê-los com a nuca e levantá-los no braço, era menos aversivo. Em suma, os protocolos de treinamento foram viáveis e podem servir como uma estratégia de refinamento em instalações de animais de laboratório. No interesse do bem-estar dos animais, os protocolos de treino devem ser aplicados sempre que possível.
Entre 2015 e 2019, mais de 49 milhões de animais foram utilizados para fins científicos na União Europeia (e na Noruega); 1.745.037 (3,5%) deles eram coelhos1. Os coelhos são usados principalmente para pesquisa regulatória (por exemplo, controle de qualidade, toxicidade e outros testes de segurança, incluindo farmacologia) e produção de rotina de substâncias biológicas (por exemplo, produtos à base de sangue)2. Embora sejam feitos esforços para substituir experimentos com animais por métodos sem animais, o uso de animais ainda é necessário para alguns desses propósitos. Sempre que um experimento com animais não puder ser substituído, é crucial reduzir o número de animais e refinar as condições experimentais, bem como as condições de alojamento e criação para minimizar o sofrimento. Russel e Burch descreveram essa estratégia como o princípio dos 3R (substituir, reduzir, refinar) em 19593 e, em 2010, foi transposta para a Diretiva 2010/63/UE relativa à proteção dos animais de laboratório utilizados para fins científicos4. O papel do refinamento, às vezes chamado de ‘Cinderela’ dos 3Rs5, ganhou importância crescente. Embora a substituição e a redução sejam estratégias a longo prazo para atingir o objetivo final da diretiva de substituir totalmente as experiências com animais, o aperfeiçoamento permite a melhoria imediata do bem-estar dos animais5, o que, por sua vez, tem potencial para melhorar a qualidade científica6. As partes essenciais do refinamento são o manuseamento e a formação dos animais, tal como referido no anexo III da Diretiva 2010/63/UE. A Diretiva estipula que as instalações para animais devem projetar programas de habituação e treinamento para os animais de laboratório adaptados à espécie, procedimento e projeto4. O Apêndice A do ETS nº 123 sugere que o pessoal dos animais de laboratório gasta tempo “conversando, manuseando, treinando e cuidando dos animais”7.
Alguns procedimentos de manuseio causam estresse, especialmente para presas terrestres, como coelhos. Exemplos são ser encurralado, contido (ou seja, agarrado por um humano, segurado nos braços de um humano ou imobilizado por um dispositivo) e levantado (ou seja, levantado do chão) para uma inspeção de saúde ou procedimentos experimentais8. Uma pesquisa com foco em coelhos de estimação revelou que 57-61% deles lutaram ao serem levantados 9,10 e alguns até mostraram agressão relacionada ao medo (ou seja, morder)11. Isso enfatiza a necessidade de técnicas suaves de manuseio e treinamento. Já foi demonstrado para outros pequenos mamíferos, como camundongos, que técnicas de manuseio suave diminuem a ansiedade12. Além disso, o manuseio suave em combinação com o treinamento reduz o estresse, a ansiedade e o comportamento semelhante à depressão em camundongos13. Em macacos rhesus e chimpanzés, as medidas fisiológicas relacionadas ao estresse foram menos afetadas quando eles foram previamente treinados em um procedimento14,15. Pode-se supor que, se um animal pode optar por participar voluntariamente do treinamento, ele pode se envolver ativamente e controlar a situação, o que melhora o bem-estar do animal e também pode contribuir para dados científicos mais robustos e confiáveis16.
Muitos procedimentos de treinamento de animais dependem de princípios de condicionamento operante, particularmente o uso de reforço positivo e modelagem 17,18,19. O condicionamento operante requer que um animal provoque comportamentos que podem ser aumentados ou diminuídos20. Existem quatro contingências comuns que são usadas para descrever o condicionamento operante: reforço positivo e negativo, bem como punição positiva e negativa21,22. Em coelhos, a punição positiva é usada quando uma pessoa se aproxima (estímulo indesejado) de um animal para afastá-lo ou em direção a um determinado local23. No contexto do manuseio de um coelho na mesa de exame, um exemplo de reforço negativo é a remoção da pressão (estímulo indesejado) no corpo do coelho quando o coelho fica parado; Um exemplo de punição negativa é retirar uma recompensa alimentar (estímulo desejado) quando o coelho começa a lutar. Nem punição positiva/negativa nem reforço negativo são recomendados no treinamento de animais. A punição causa efeitos emocionais negativos24, como angústia como mostrado em cães25. Em vez disso, o reforço positivo deve ser o método de escolha no treinamento de animais25,26. O treinamento de reforço positivo (PRT) significa que um estímulo desejável (por exemplo, uma recompensa alimentar) é fornecido depois que o animal mostrou um comportamento desejado, o que aumenta a probabilidade de que o animal exiba o comportamento desejado novamente no futuro27. O PRT geralmente envolve a aplicação de um reforçador condicionado. Um reforçador condicionado (reforçador secundário) geralmente é um estímulo neutro, como um som, que o animal aprende a associar a um reforçador incondicionado (reforçador primário, por exemplo, recompensa alimentar)28. Após o animal apresentar o comportamento desejado, o reforçador condicionado é imediatamente apresentado, seguido da apresentação da recompensa alimentar26. Um exemplo bem conhecido de PRT é o treinamento com clicker, onde um clicker é usado para produzir um clique como um reforçador secundário26.
O treinamento deve seguir padrões previsíveis, o que é alcançado através da criação de um protocolo de treinamento. O protocolo de treinamento descreve como um comportamento objetivo pode ser alcançado passo a passo (ou seja, modelagem comportamental), enquanto cada etapa é definida por critérios objetivos e deve ser facilmente realizada26. Se o treinamento seguir um protocolo específico, é possível que a equipe de animais de laboratório alterne com o treinamento dos animais. É importante notar que o pessoal precisa conhecer os princípios das técnicas de aprendizagem e treinamento para aplicá-los corretamente26. O treinamento de animais geralmente incorpora modelagem comportamental. A modelagem comportamental à mão foi deliberadamente usada pela primeira vez por Skinner e colegas no início dos anos 194029. Em contraste, em trabalhos anteriores, Skinner se concentrou em “fazer pequenas mudanças no ambiente físico para implementar um programa de aproximação sucessiva”29. Em um artigo publicado na Scientific American, ele explicou que reforçar um comportamento aumenta a probabilidade de que o comportamento seja repetido, o que “torna possível moldar o comportamento de um animal quase como um escultor molda um pedaço de argila”30. Desde então, a modelagem tem experimentado uma importância crescente para animais em cativeiro 29,30,31,32. Para reproduzir e aprimorar protocolos de modelagem, é fundamental avaliar os protocolos de forma sistemática e objetiva 33,34,35,36.
Uma revisão sistemática e meta-análise publicada recentemente por Pfaller-Sadovsky et al. descobriu que o reforço condicionado foi mais frequentemente estudado em cavalos e cães, embora gatos, gado, peixes, cabras e primatas não humanos também tenham sido investigados37. Na ciência de animais de laboratório, o PRT é amplamente utilizado para primatas não humanos 38,39,40 e cães41,42. Além disso, porcos43, cabras44 e até pequenos mamíferos, como camundongos13 e ratos 45,46,47, foram treinados com sucesso usando um clicker em laboratório. Até onde sabemos, a introdução de PRT para coelhos de laboratório ainda não foi relatada48; A literatura revisada por pares existente publicada há várias décadas está desatualizada e não atende aos critérios da pesquisa ética moderna. Embora poucas informações não revisadas por pares sugiram que os coelhos possam ser treinados com sucesso usando o PRT49, parece haver uma falta de conhecimento sobre protocolos de treinamento adequados para coelhos alojados em instalações para animais de laboratório. As razões subjacentes podem variar. Por exemplo, as técnicas de treinamento usadas podem não ser descritas em detalhes em artigos de pesquisa ou os dados são gerados para pesquisa regulatória e, portanto, não são publicados. Além disso, os coelhos podem não ser o foco principal da pesquisa de refinamento, uma vez que outras espécies, como camundongos e ratos, são usadas com mais frequência em pesquisas. Como os coelhos podem mascarar o estresse e o desconforto extremamente bem, seu estado emocional negativo ao serem manuseados pode muitas vezes não ser reconhecido. O tamanho de um coelho permite que os humanos contenham esses animais para procedimentos, enquanto outras espécies, como primatas não humanos, não podem ser seguradas com as mãos para intervenções semelhantes sem serem gravemente feridas50. No entanto, esses fatos não devem impedir o desenvolvimento ou compartilhamento de protocolos de PRT para coelhos de laboratório.
Em relação aos benefícios potenciais do PRT, foram feitas primeiras tentativas para preencher a lacuna de conhecimento sobre protocolos de treinamento adequados para coelhos de laboratório. Para facilitar os procedimentos de rotina, como manuseio, inspeções sanitárias e pesagem, foram desenvolvidos protocolos de treinamento e avaliada sua viabilidade para coelhos brancos da raça Nova Zelândia. Comparações foram realizadas para avaliar se a técnica de manejo alternativo descrita nos protocolos de treinamento era menos aversiva do que a técnica de manejo convencional e se os protocolos de treinamento podem servir como medidas de refinamento. A Figura 1 demonstra o cronograma do presente estudo.
Manutenção de animais
Treze coelhos brancos da Nova Zelândia fêmeas foram obtidos de fontes comerciais (chegada ao biotério com aproximadamente sete semanas de idade). Os animais estavam livres de todos os patógenos virais, bacterianos e parasitários listados nas recomendações da FELASA51. Foram utilizadas roupas e equipamentos de proteção (luvas, máscaras, redes de cabelo) na condução das etapas do presente protocolo. Um grupo de seis e um grupo de sete animais foram alojados juntos em um curral de 2,8 m × 2,8 m (alojamento no chão), respectivamente. O chão foi coberto com material de cama de madeira fino e escamoso (autoclavado). Além disso, o material de nidificação e a lã de papel estavam espalhados em cima da cama. Três casas plásticas com duas aberturas cada (37 cm × 60 cm; altura 30 cm) e um túnel plástico (comprimento: 58 cm; diâmetro: 16 cm) serviram como abrigos. Além disso, foram fornecidos itens de enriquecimento, como blocos de madeira, bolas de feno e salgueiro e lanches cheios de pellets de comida, que caem ao mover a bola. Os coelhos tinham livre acesso a água da torneira, comida peletizada e feno autoclavado, bem como palha. Mais informações sobre alimentos e itens de enriquecimento estão listadas na Tabela de Materiais. A sala dos animais era limpa às quintas-feiras.
Os coelhos foram mantidos em condições padrão (temperatura ambiente e umidade relativa do ar dadas como média ± desvio padrão: 20,3 ± 0,4 °C e 50 ± 5%) em um ciclo claro:escuro de 12:12 h (luz artificial com incidência adicional de luz do dia). Um rádio foi ligado 30 minutos antes do início da fase de luz por aproximadamente 8 h para habituar os coelhos aos ruídos do ambiente.
Os protocolos de treinamento foram desenvolvidos para refinar procedimentos rotineiros, como manuseio, inspeções sanitárias e pesagem em coelhos de laboratório. Sua viabilidade foi avaliada neste estudo exploratório usando treze fêmeas de coelhos brancos da Nova Zelândia. Os protocolos de treinamento podem ser aplicados de forma confiável para treinar os coelhos com sucesso. A maioria dos coelhos foi capaz de aprender os comportamentos objetivos definidos nos protocolos de treinamento em menos de 3 semanas de treinamento, lembrou-se deles após intervalos de treinamento de 1 semana e os generalizou para outra pessoa que não o treinador. Poucas adaptações ao protocolo tiveram que ser feitas para atender às necessidades de animais individuais. O principal achado do presente estudo foi que a técnica de manuseio refinada para pegar coelhos, conforme descrito nos protocolos de treinamento, foi menos aversiva do que a técnica de manuseio convencional. Curiosamente, os coelhos treinados mostraram seu comportamento exploratório não apenas em relação ao treinador familiar, mas também a uma pessoa desconhecida em um teste de abordagem voluntária.
Significado do alvo
O objetivo serviu de base para o presente protocolo de treinamento. Ao introduzir o alvo, os animais aprenderam que seu comportamento afetava o meio ambiente e gerava consequências. A introdução do alvo cria confiança entre o humano e o animal, como demonstrado pelo coelho # 4, foram necessárias 7 sessões de treinamento antes de seguir o bastão alvo para a arena de treinamento, mas aprendeu os seguintes comportamentos de objetivo rapidamente (ou seja, dentro de 1-3 sessões de treinamento). Este coelho # 4 pareceu ganhar confiança no treinador durante a introdução do alvo, o que facilitou o treinamento dos outros comportamentos objetivos. No entanto, este coelho ainda não tinha confiança em outras pessoas e não estava disposto a mostrar a maioria dos comportamentos objetivos nas sessões de generalização.
Deve-se notar que o destino não foi definido como ponto final em algumas seções do protocolo. Em vez disso, por exemplo, os animais tiveram que seguir a meta por um número variável de saltos ou permanecer na balança por um número variável de segundos. O padrão de recompensa variável foi escolhido para aumentar e manter a atenção e motivação dos coelhos no treinamento.
Sinais
Depois que os coelhos executaram com sucesso a etapa 5.1, em todas as sessões de treinamento seguintes, o treinador colocou o alvo a uma curta distância do nariz do coelho para sinalizar ao coelho que o teste de treinamento começou. Se o coelho tocasse o alvo com o nariz/boca, a vontade de participar do treinamento era considerada e o treinamento começava.
Os protocolos atuais não incluíam mais sinais, por exemplo, a balança, a caixa de transporte ou a mão não eram considerados sinais. Em vez disso, o alvo foi usado para levar o animal para a arena de treinamento, para a balança, para a caixa de transporte, para o ar (criação) ou para o colo do treinador. Isso significa que os comportamentos de meta “pesar”, “entrar na caixa de transporte”, “empinar” e “pular no colo” foram modificações de “seguir o alvo”. A razão para isso foram os requisitos para o protocolo de treinamento: ele deve ser viável de ser realizado pela equipe de biotérios, que podem não ser especialistas em treinamento de animais, e facilmente integrado à rotina diária de trabalho. Portanto, os protocolos devem ser eficientes e atingir os comportamentos desejados rapidamente.
No entanto, a mão que é colocada na frente do coelho (passo 8.3), a balança ou a caixa de transporte também têm o potencial de se tornar um sinal e um alvo para as patas. Portanto, pode ser possível definir outras etapas que vão além dos protocolos atuais e não requerem o uso do bastão alvo. Por exemplo, assim que o coelho vê a balança, a balança sinaliza aos coelhos para pular nela com as quatro patas.
Adaptações dos protocolos
Embora se possa esperar que o fenótipo de animais de laboratório quase geneticamente idênticos seja muito semelhante, existem “diferenças comportamentais entre indivíduos que são consistentes ao longo do tempo e em todas as situações [e] são chamadas de personalidade”55, por exemplo, alguns animais são bastante tímidos e outros ousados56. Pode levar mais tempo para que animais tímidos e menos exploradores aprendam os comportamentos objetivos definidos do protocolo (por exemplo, coelho # 4). Mesmo que os protocolos de treinamento padrão possam ser adequados para a maioria, o treinamento deve considerar as necessidades de um animal individual e se adaptar a elas, quando necessário26. Assim, etapas intermediárias menores adicionais devem ser definidas para os coelhos que não conseguem aprender uma etapa de treinamento do protocolo. As etapas adicionais de treinamento intermediário devem ajudá-los a prosseguir com sucesso para a etapa seguinte. Especialmente porque os planos de treinamento são desenvolvidos em teoria e depois testados na prática, pode se tornar aparente que etapas adicionais de treinamento são necessárias para treinar um comportamento de objetivo específico.
Com relação aos protocolos de treinamento atuais, algumas etapas de treinamento intermediárias tiveram que ser adicionadas para os comportamentos objetivos “seguir o alvo”, “entrar na caixa de transporte”, “criar” e “pular no colo”, conforme descrito em detalhes na seção sobre os resultados representativos, uma vez que os animais individuais não continuaram com a etapa de treinamento seguinte. Curiosamente, as etapas intermediárias 8.2+ e 9.3+ foram exigidas pela maioria dos coelhos, enfatizando sua importância. Portanto, essas etapas foram adicionadas como uma nota aos protocolos de treinamento.
Alternativamente, para o passo definido 8.2+, o treinador pode colocar a mão no chão com a palma voltada para cima e deixar o coelho pisar na mão com uma e, eventualmente, ambas as patas dianteiras. Além disso, é concebível que um coelho exija etapas intermediárias adicionais antes da etapa 9.3+, por exemplo, primeiro o coelho coloca uma pata traseira e depois as duas patas traseiras no colo do treinador. Se um coelho não aceitar ser tocado nas etapas 9.5-9.9, a duração do toque nas diferentes partes do corpo pode ser aumentada gradualmente. Além disso, inicialmente apenas os dedos indicador e médio podiam ser usados para acariciar os animais com uma leve pressão como uma pena. Em seguida, o número de dedos usados para tocar e a pressão podem ser aumentados em várias etapas.
Refinamento das técnicas de manuseio
Pode-se supor que o manuseio é altamente aversivo, especialmente em coelhos com um traço de personalidade tímido. Os coelhos são presas terrestres e serem levantados (ou seja, levantados do chão) ou contidos (ou seja, segurados nos braços de um humano) para uma inspeção de saúde e procedimento experimental provavelmente causarão ansiedade e angústia. Uma opção para refinar os métodos de manuseio foi introduzida nos protocolos de treinamento: em vez de prender o coelho pela nuca e levantá-lo para o outro braço, o coelho pode ser conduzido com o bastão alvo para dentro da caixa e carregado na caixa para a mesa de exame, como sugerido anteriormente50, 57, onde o coelho é gentilmente transferido da caixa para a mesa. Alternativamente, a parte superior da caixa pode ser removida ou o coelho pode ser guiado com o bastão alvo para fora da caixa.
As observações comportamentais realizadas após a coleta dos coelhos usando a técnica de manuseio convencional ou a caixa de transporte revelaram que a técnica de manuseio convencional estava associada a mais comportamento relacionado ao estresse e à ansiedade do que a técnica alternativa. Essa conclusão foi tirada do alto número de animais que recusaram a recompensa alimentar na mesa de exame e do aumento do tempo de permanência nos abrigos quando a técnica de manejo convencional foi aplicada. Curiosamente, a técnica de manuseio não afetou o tempo de interação com o treinador, indicando que o processo de manuseio pode não ter prejudicado a relação humano-animal. No entanto, além do treinador, a caixa de transporte também servia como “dispositivo de manuseio” (ou seja, o dispositivo de manuseio da técnica convencional era o treinador, os dispositivos de manuseio da técnica alternativa eram tanto o treinador quanto a caixa de transporte). Portanto, o tempo de interação com a caixa de transporte também foi analisado. Embora os coelhos tivessem acabado de ser apanhados com a caixa de transporte, eles passaram mais tempo interagindo com a caixa ou na caixa do que quando foram apanhados pela técnica convencional. Isso sugeriu que a caixa de transporte poderia estar associada a um afeto positivo. Ao comparar a duração da interação com os dois “dispositivos de manuseio” (ou seja, soma do tempo gasto interagindo com a caixa e o treinador), a técnica de manuseio da caixa aumentou a duração do tempo de interação com os “dispositivos de manuseio”, ou seja, essa técnica teve um claro efeito positivo na resposta comportamental dos coelhos em relação aos “dispositivos de manuseio” na expectativa de serem manuseados. Descobertas semelhantes foram feitas em camundongos de laboratório, demonstrando que técnicas de manuseio e treinamento suaves reduziram o estresse e a ansiedade: os animais que foram pegos usando um túnel ou as mãos em concha passaram mais tempo interagindo voluntariamente com o “dispositivo de manuseio” e mostraram menos comportamento relacionado à ansiedade do que os camundongos com cabo de cauda12. O treinamento pareceu fortalecer esse efeito. Leidinger et al. demonstraram que camundongos com manuseio suave (túnel / xícara) mostraram menos micção, defecação e vocalização quando foram contidos pela nuca e menos comportamento flutuante no Teste do Labirinto Aquático de Morris quando foram treinados usando PRT em comparação com camundongos não treinados13.
Viabilidade dos protocolos para o trabalho diário – duração, retenção e generalização do treinamento
O número de sessões de treinamento necessárias para aprender um comportamento objetivo dependia do animal individual e dos comportamentos objetivos, que compreendiam um número diferente de etapas que iam da seção 3 à seção 9 do protocolo apresentado acima.
De acordo com o número de animais que conseguiram aprender um comportamento objetivo e o número de adaptações que tiveram que ser feitas nos protocolos para os animais individuais, as etapas de treinamento tiveram diferentes níveis de dificuldade. O comportamento “seguir o alvo” foi a primeira experiência de treinamento dos coelhos e, portanto, demorou mais para alguns animais treinarem esse comportamento do que o outro comportamento objetivo, conforme discutido acima. Embora todos os animais pudessem ser treinados em “pesagem” de acordo com o presente protocolo, etapas intermediárias adicionais foram necessárias para “entrar na caixa de transporte” por dois animais e para “criar” e “pular no colo” por quase todos os coelhos. Isso pode ser explicado pelo grau de contato físico entre o animal e o treinador que foi necessário para a realização dos diferentes comportamentos objetivos. “Pesar” e “entrar na caixa de transporte” não envolveu nenhum contato físico entre animal e humano. A etapa final de “criação” (8.3) e as etapas 9.2-9.4 de “pular no colo” exigiam que os coelhos fizessem contato físico com o treinador. Além disso, o treinador tocou o ombro, costas, garupa, orelhas ou patas do coelho nas etapas 9.5-9.9 de “pular no colo”, aumentando o grau de contato físico entre o animal e o treinador. Aceitar ser tocado foi mais desafiador para alguns coelhos do que para outros. Conforme discutido acima, foi benéfico adaptar os protocolos de treinamento desses comportamentos de meta e adicionar etapas intermediárias.
No entanto, três coelhos precisaram de sessões de treinamento adicionais para completar o comportamento objetivo “pular no colo” (# 4, # 7, # 10). Deficiências físicas que impediam esses animais de pular no colo do treinador poderiam ser excluídas. Além disso, os coelhos foram capazes de pular em suas casas, as alturas destas eram mais altas do que o colo do treinador.
Foi perceptível que dois desses três coelhos (# 4 e # 10) precisaram de mais tempo para se acostumar com o treinador, bem como com a recompensa alimentar nas sessões de habituação e parcialmente precisaram de mais sessões de treinamento para alcançar a etapa final de outros comportamentos objetivos. Isso também foi verdade para o coelho # 7, que teve uma lesão na cauda devido a brigas dentro do grupo desde a quarta sessão de habituação. Portanto, o coelho #7 foi pego, transferido para a mesa de exame, tratado e inspecionado diariamente por 15 dias, o que pode ter resultado em maior cautela em relação aos humanos. Por um lado, é crucial observar que o desempenho do treinamento pode ser afetado, por exemplo, por um estado de saúde prejudicado, aumento dos níveis de estresse ou uma relação humano-animal perturbada devido a outras intervenções. Por outro lado, essas observações demonstraram a importância da habituação ao treinador e à recompensa alimentar. Alguns animais podem precisar de mais tempo para se familiarizar com a presença do treinador e aceitar a recompensa alimentar do treinador. Se sessões adicionais de habituação tivessem sido realizadas, os coelhos # 4 e # 10 poderiam ter tido um desempenho melhor nas sessões de treinamento. A relevância de habituar coelhos a humanos já foi relatada na literatura. O criador comercial, do qual os coelhos usados neste estudo foram comprados, introduziu recentemente sessões regulares de carícias, o que reduziu o comportamento relacionado ao estresse e eliminou as agressões58. Em um estudo anterior, acariciar e manusear coelhos jovens demonstrou diminuir o comportamento relacionado à ansiedade, aumentar o ganho de peso e reduzir a taxa de mortalidade59.
Uma vez que os coelhos aprenderam os diferentes comportamentos de objetivo, eles ainda foram capazes de exibi-los após dois intervalos de treinamento curtos (uma semana) e longos (aproximadamente 7,5-9,5 semanas), exceto em exceções individuais. Essas observações podem indicar que é suficiente pedir aos coelhos que realizem os comportamentos de meta treinados uma vez por semana quando o exame geral é realizado e a sala / curral é limpo.
Para a viabilidade do protocolo para a vida diária no trabalho, também é crucial que os coelhos generalizem os comportamentos objetivos treinados para outras pessoas que não o treinador. Em caso de férias ou doença, outra pessoa tem que continuar o treinamento e cuidar dos animais. A maioria dos coelhos (doze de treze) generalizou os comportamentos objetivos “pesar”, “entrar na caixa de transporte” e “empinar” para o cuidador do animal, embora, em alguns casos, os coelhos tenham levado mais de uma sessão de treinamento para mostrar o comportamento desejado. “Pesar” parecia generalizar melhor; seguido por “entrando na caixa de transporte” e “criação”. No entanto, “pular no colo” parecia ser mais difícil de generalizar para outra pessoa. Os animais levaram mais tempo para demonstrar o comportamento desejado (9.9.) e dois coelhos, que aprenderam anteriormente a etapa final 9.9, não conseguiram mostrar esse comportamento objetivo, possivelmente devido ao maior contato físico necessário (veja acima). Um coelho (# 4) não apresentou nenhuma etapa dos comportamentos objetivos “pesar”, “entrar na caixa de transporte” e “criar” e não estava interessado em interagir com o cuidador do animal. O coelho #4 foi um dos animais que precisou de mais tempo para se acostumar com o treinador e a recompensa alimentar nas sessões de habituação. Isso pode indicar que, para alguns indivíduos, sessões adicionais nas quais os cuidadores de animais passam tempo com os coelhos, habituam-nos a aceitar a recompensa alimentar deles e constroem um vínculo positivo são benéficas23. Os coelhos podem ser capazes de distinguir entre pessoas diferentes, como demonstrado para ratos60. Outros fatores que têm o potencial de afetar o desempenho dos coelhos nas sessões com o treinador e o cuidador do animal podem ser sinais inconscientes que o treinador deu aos animais durante as sessões de treinamento, por exemplo, a posição do bastão alvo ou da tigela de recompensa, a posição do corpo ou movimento. Se o treinador não estiver ciente desses sinais, eles não serão documentados e as outras pessoas não imitarão esses sinais.
Além disso, as habilidades de treinamento das pessoas que trabalham com os animais, incluindo a rotina de manuseio do bastão alvo e a apresentação da recompensa, podem influenciar o comportamento dos animais. Além do conhecimento dos princípios de aprendizagem e da comunicação animal, são necessárias experiências práticas para treinar com sucesso um animal61 e recuperar um comportamento objetivo. Como as sessões de generalização envolvendo uma pessoa qualificada e uma não qualificada não foram comparadas, a relevância do fator “habilidades de treinamento” não pode ser determinada. No entanto, até onde os autores sabem, uma grande proporção da equipe de animais de laboratório não é treinada em treinamento de animais e, portanto, as condições sob as quais as sessões de generalização foram realizadas (ou seja, envolvendo um cuidador de animais com poucas experiências anteriores em treinamento com clicker) representaram um cenário realista em instalações de animais de laboratório.
Os dados representativos dos protocolos fornecem às biotabilizações uma ideia da carga de trabalho associada ao treinamento dos diferentes comportamentos-alvo. Os dados podem ajudar as instalações de animais a criar seus próprios horários de trabalho ao implementar (partes do) protocolo. Dependendo do animal individual e dos comportamentos objetivos, algum tempo adicional deve ser reservado para o processo de generalização. No entanto, a duração do tempo pode variar ao trabalhar com coelhos machos ou outra raça de coelho. Nas instalações para animais, deve-se discutir se existe tempo apropriado e o que precisa ser alterado para permitir tempo para o treinamento dos animais.
Além do tempo necessário para treinar os animais, deve-se considerar que o treinamento precisa de treinadores qualificados e ensinar a equipe a treinar animais também pode ser demorado. Se o treinamento fosse uma parte obrigatória da educação do pessoal de animais de laboratório, ou seja, cuidadores de animais, veterinários e pesquisadores, a implementação do treinamento de animais nas instalações seria facilitada e levaria menos tempo. De acordo com o Anexo III da Diretiva 2010/63/UE, “os estabelecimentos devem estabelecer programas de habituação e treinamento adequados aos animais, aos procedimentos e à duração do projeto”, ou seja, o treinamento dos animais é exigido por lei. Na Alemanha, esses programas devem ser enviados ao solicitar uma licença de teste em animais. Isso requer que as pessoas que planejam experimentos com animais e trabalham com animais de laboratório sejam qualificadas em treinamento animal. No entanto, pelo menos na Alemanha, o treinamento de animais não faz parte do cronograma de treinamento de cuidadores de animais no campo da pesquisa e clínica 62,63,64. Além disso, não é explicitamente mencionado nas recomendações da UE para o quadro da educação e da formação65. Portanto, enquanto o treinamento não for implementado nesses regulamentos, o desenvolvimento profissional contínuo com foco no treinamento de reforço positivo precisa de mais atenção. O pessoal de animais de laboratório precisa aprender os princípios de técnicas de aprendizado e treinamento, os critérios necessários, a transferência de procedimentos entre treinadores, manutenção de registros e como responder a animais que não estão participando da maneira desejada para garantir consistência e previsibilidade.
Interação humano-animal
O tempo intensivo de interação humano-animal durante as sessões de treinamento fornece um cenário ideal para fortalecer o relacionamento entre os coelhos individuais e o treinador26,66. Uma relação positiva entre humanos e animais é benéfica para o bem-estar dos animais, pois pode reduzir seus níveis de estresse em ambientes de criação e experimentais67. Nos presentes protocolos de treinamento, o treinador considera a agência dos coelhos e eles podem decidir participar (ou não) do treinamento de forma voluntária. Fornecer agência aos animais é benéfico para seu bem-estar 16 e, portanto, deve ser buscado em experimentos, bem como em alojamento e criação. Existem diferentes níveis de agência comportamental68; a participação no PRT pode ser atribuída ao nível de agência orientada para a ação, ou seja, “comportar-se ativamente para alcançar os resultados atuais [por exemplo, adquirir alimentos]“68.
Ao analisar a abordagem voluntária dos coelhos em relação ao treinador e a uma pessoa desconhecida, observou-se uma intensa interação humano-animal. Os resultados revelaram que todos os coelhos, exceto de um animal no1º ensaio (# 12), interagiram tanto com o treinador quanto com a pessoa desconhecida. Eles pareciam reconhecer o treinador, pois mostraram uma clara preferência por interagir com o treinador na1ª tentativa e alguns deles pularam com as quatro patas no colo do treinador; um comportamento que não foi exibido em relação à pessoa desconhecida. Embora os coelhos tenham passado mais tempo interagindo com o treinador do que a pessoa desconhecida na1ª tentativa, o tempo de interação não diferiu mais na2ª tentativa. Uma razão para esta observação pode ser que os coelhos esperavam receber uma recompensa alimentar do treinador na1ª tentativa e, devido à falta de recompensas alimentares no teste de aproximação voluntária, eles não passaram mais mais tempo com o treinador na2ª tentativa. Esses dados, no entanto, enfatizaram que os coelhos treinados rapidamente se habituaram à presença de uma pessoa desconhecida e nenhum deles era tímido demais para interagir. Em contraste, eles eram muito exploradores e interessados na pessoa desconhecida. No entanto, como um grupo de controle não treinado não foi investigado, o efeito do treinamento no comportamento de abordagem voluntária dos coelhos não é claro.
Uma hipótese que explica o comportamento do coelho #12 na1ª tentativa é que esse indivíduo ainda teve que se habituar à presença da pessoa desconhecida na1ª tentativa e estava mais interessado em interagir tanto com o treinador (70 segundos) quanto com a pessoa desconhecida (9 segundos) na2ª tentativa. Os coelhos têm diferentes traços de personalidade que podem afetar o nível de conforto em torno de pessoas desconhecidas e, por sua vez, a latência para se aproximar ou a duração do tempo de interação com uma pessoa69,70.
Limitações
Estamos cientes de que todos os coelhos no curral/sala, não apenas aquele que participa do treinamento, podem ouvir o clique (ou seja, o reforçador condicionado) durante uma sessão de treinamento e seu efeito de reforço pode ser enfraquecido, uma vez que a recompensa alimentar (ou seja, reforçador natural/incondicionado) não é apresentada. Se um coelho fora da arena de treinamento mostrar um comportamento treinado e ouvir o clique, mas nenhum alimento for apresentado (e esse cenário ocorre várias vezes), o comportamento treinado pode ser extinto. Esse fenômeno é chamado de extinção64,71. No entanto, uma vez que todos os comportamentos objetivos dos protocolos atuais dependem do alvo apresentado pelo treinador, é improvável que a extinção ocorra em nosso ambiente de treinamento.
Como as paredes da arena de treinamento eram transparentes e a arena de treinamento estava localizada no curral, os coelhos podiam ver, ouvir e cheirar uns aos outros durante o treinamento, o que é uma clara vantagem relacionada ao bem-estar. Além disso, os coelhos podem ter observado os membros do grupo durante as sessões de treinamento e aprendido uns com os outros. Em ratos, foi demonstrado anteriormente que os indivíduos aprenderam a realizar um comportamento de objetivo observando seu companheiro de gaiola sendo treinado pelo PRT45. Este fato pode ser considerado uma vantagem e uma desvantagem. O progresso do aprendizado dos animais pode ser mais rápido quando eles podem observar uns aos outros. No entanto, os dados de cada animal podem ser influenciados pelo desempenho dos membros do grupo e não podem ser atribuídos apenas ao treinamento do animal individual. Assim, treinar animais sem qualquer contato com os membros do grupo ou coelhos alojados individualmente pode levar mais tempo.
As observações comportamentais dos indivíduos (no teste de abordagem voluntária e após a aplicação das diferentes técnicas de manuseio) foram realizadas em seu ambiente social familiar e grupo para evitar estresse e distração causados por um novo ambiente e separação de seu grupo, o que por sua vez teria afetado as observações comportamentais. A desvantagem é, no entanto, que os coelhos podem ter influenciado o comportamento uns dos outros durante as sessões de observação.
Os efeitos das técnicas de manejo foram investigados apenas em sete animais envolvendo o treinador como pessoa que manuseia os animais. Os autores estão planejando um estudo de acompanhamento, incluindo um cálculo do tamanho da amostra a priori para reproduzir os achados com outros manipuladores e examinar melhor as diferenças entre as técnicas de manuseio.
Todos os humanos envolvidos no treinamento, manuseio e teste de aproximação voluntária eram mulheres. Não foi investigado se o desempenho de treinamento dos coelhos ou seu comportamento variaria se indivíduos do sexo masculino estivessem envolvidos.
Os protocolos de treinamento atuais devem dar ao leitor uma ideia do que pode ser treinado em coelhos, mas não compreendem todos os comportamentos potenciais que seriam benéficos para treinar em um coelho de laboratório. Por exemplo, marcar um coelho conforme sugerido na seção de protocolo sobre requisitos gerais também valeria a pena treinar usando o PRT.
Como apontado mais acima, a escolha da recompensa certa não é trivial. Devido a restrições de higiene, o uso de ervas frescas como recompensas alimentares não é permitido em algumas instalações de animais de laboratório e, portanto, recompensas alimentares menos apropriadas, como sementes de girassol ou guloseimas de forrageamento à base de grãos, devem ser usadas. No que diz respeito à decisão sobre a recompensa alimentar, algumas regras e regulamentos das práticas laboratoriais atuais são prejudiciais ao bem-estar animal e ao treinamento eficaz e, portanto, podem precisar ser reconsiderados caso a caso. Também pode ser possível usar alternativas para recompensas alimentares, por exemplo, toques suaves ou interações com o treinador ou itens de enriquecimento. No entanto, o treinador deve certificar-se de que para cada animal individual a alternativa é recompensar o animal, porque uma recompensa só é uma recompensa se o coelho realmente a favorecer. Especialmente os toques podem não ser recebidos como recompensadores por todos os coelhos.
Conclusões
Em resumo, o presente estudo foi um primeiro passo para preencher a lacuna de conhecimento sobre protocolos de treinamento adequados para coelhos de laboratório. Coelhos brancos da Nova Zelândia fêmeas podem ser treinados para procedimentos de criação de rotina usando PRT e generalizar os comportamentos de objetivo aprendidos para outras pessoas, embora tempo adicional deva ser reservado para o processo de generalização. Comportamentos objetivos sem contato físico pareciam ser mais fáceis de aprender do que comportamentos que exigiam contato físico com humanos. Depois que os animais concluíram com sucesso o treinamento de um comportamento objetivo, foi suficiente recuperá-los uma vez por semana no contexto do exame geral e limpeza do curral. Os protocolos de treinamento considerados geralmente aplicados a todos os coelhos são convenientes, mas o treinador deve estar ciente de que, em alguns casos, deve ser adaptado às necessidades do animal. Os resultados das técnicas de manuseio sugeriram que pegar os coelhos com a caixa de transporte em vez de prendê-los pela nuca e levantá-los no braço era menos aversivo. Em suma, os protocolos atuais fornecem instruções viáveis para o processo de habituação e treinamento de coelhos e podem servir como refinamento em instalações de animais de laboratório.
Os animais não devem sofrer devido à economia de trabalho, tempo ou dinheiro (pelo menos de acordo com a Lei Alemã de Bem-Estar Animal72). É importante cuidar e lidar com todos os animais da maneira mais gentil possível. Como os animais não treinados sofrem em maior grau de ansiedade e angústia causados por procedimentos experimentais e rotineiros de criação do que seus colegas treinados13, o treinamento é uma medida simples de refinamento para evitá-los efetivamente de experimentar estados afetivos negativos.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem aos cuidadores dos animais por cuidarem dos coelhos e seu trabalho compassivo e dedicado. Obrigado a Kai Diederich pela revisão do manuscrito.
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Finger Clicker | ASCO | https://ascoshop.de/products/fingerclicker | |
G*Power | version 3.1.9.7 | ||
Heu-Proppen | Ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Germany | The successful implementation of the protocol does not depend on this particular product. You could use comparable products by other companies. | |
IBM Corp. Released 2020. IBM SPSS Statistics for Windows, Armonk, NY: IBM Corp | IBM Corp | Version 27.0. | in the manuscript referred to as "software for advanced statistical analysis" |
Kaninchen Haltung + 25 mg/kg Salinomycin-Natrium-Sondermischung | Ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Germany | The successful implementation of the protocol does not depend on this particular product. You could use comparable products by other companies. | |
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Lillebro geschälte Sonnenblumenkerne”, Martina GmbH, München, Germany) and Rainbow Foraging Bits (Bio-Serv, Flemington, USA) | Martina GmbH, München, Germany | The successful implementation of the protocol does not depend on this particular product. You could use comparable products by other companies. | |
Microsoft Excel for Microsoft 365 MSO | Microsoft Corporation | Version 2305 | in the manuscript referred to as "spread sheet" |
New Zealand White rabbits | Charles River Laboratories France | ||
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