Автоматизация скрининга криоэлектронной микроскопии в нескольких сетях с помощью Smart Leginon
Summary
Многосетчатый скрининг криоэлектронной микроскопии (криоЭМ) часто является утомительным процессом, требующим многочасового внимания. В этом протоколе показано, как настроить стандартную коллекцию Leginon и Smart Leginon Autoscreen для автоматизации этого процесса. Этот протокол может быть применен к большинству решеток из фольги с отверстиями в криоЭМ.
Abstract
Достижения в области криоэлектронной микроскопии (криоЭМ) за последнее десятилетие позволили структурным биологам регулярно разрешать высокомолекулярные белковые комплексы с почти атомным разрешением. Общий рабочий процесс всего конвейера cryoEM включает в себя итерацию между подготовкой образца, подготовкой криоЭМ-сетки и скринингом образца/сетки, прежде чем перейти к сбору данных с высоким разрешением. Итерация между подготовкой образца/сетки и скринингом, как правило, является основным узким местом для исследователей, поскольку каждый итеративный эксперимент должен быть оптимизирован с учетом концентрации образца, буферных условий, материала сетки, размера отверстия сетки, толщины льда и поведения белковых частиц во льду, а также других переменных. Кроме того, после того, как эти переменные удовлетворительно определены, сетки, подготовленные в одинаковых условиях, сильно различаются по тому, готовы ли они к сбору данных, поэтому рекомендуется провести дополнительные сеансы скрининга перед выбором оптимальных сеток для сбора данных с высоким разрешением. Этот процесс подготовки и скрининга образцов/сеток часто занимает несколько десятков сеток и дней рабочего времени оператора за микроскопом. Кроме того, процесс скрининга ограничен доступностью оператора/микроскопа и доступностью микроскопа. В этой статье мы продемонстрируем, как использовать Leginon и Smart Leginon Autoscreen для автоматизации большинства скринингов с криоEM-решеткой. Autoscreen сочетает в себе машинное обучение, алгоритмы компьютерного зрения и алгоритмы работы с микроскопом, чтобы устранить необходимость в постоянном ручном вводе данных оператором. Autoscreen может автономно загружать и отображать сетки с многомасштабной визуализацией с помощью автоматизированной кассетной системы обмена образцами, что приводит к автоматическому скринингу сетки для всей кассеты. В результате, время, затрачиваемое оператором на просеивание 12 сеток, может быть сокращено до ~10 мин при использовании Autoscreen по сравнению с ~6 ч при использовании предыдущих методов, которые затрудняются из-за неспособности учесть высокую вариабельность между сетками. Этот протокол сначала знакомит с базовой настройкой и функциональностью Leginon, а затем демонстрирует функциональность Autoscreen шаг за шагом от создания шаблонного сеанса до завершения сеанса автоматического скрининга с 12 сетками.
Introduction
Криоэлектронная микроскопия одиночных частиц (криоЭМ) позволяет определять структуру очищенных высокомолекулярных комплексов с близким к атомному разрешению. КриоЭМ-эксперимент с одной частицей требует только одной или двух хорошо подобранных сеток, выбранных из гораздо большего набора сеток с различными условиями образца и сетки. Скрининг под микроскопом для изучения этих сеток включает в себя визуализацию каждой сетки с несколькими увеличениями, чтобы определить, какая сетка удовлетворяет большинству ключевых требований для сбора данных с высоким разрешением, включая толщину льда, достаточные площади для полного сбора данных, чистоту белка, концентрацию белка, стабильность белка и минимальные проблемы предпочтительной ориентации1. Оптимизация этих ключевых требований часто включает в себя обратную связь между просеиванием под микроскопом и условиями приготовления, такими как производство белка, выбор буфера, потенциальные детергенты и тип сетки 2,3,4 (рис. 1). Обычное сетчатое просеивание выполняется вручную или полувручную с помощью такого программного обеспечения, как Leginon5, SerialEM6 и EPU7. Обычный скрининг требует, чтобы оператор микроскопа часами сидел за микроскопом для скрининга нескольких сеток, что создает значительное узкое место в рабочем процессе с одним частицей с высоким разрешением, занимая оператора механическими операциями, а не оптимизацией образца/сетки.
Ранее были представлены Smart Leginon Autoscreen и лежащее в его основе программное обеспечение для машинного обучения Ptolemy, и были описаны лежащие в их основе методы и алгоритмы вместе с примерами 8,9. Несколько других программных пакетов либо способны, либо работают в направлении полностью автоматизированного многосетчатого скрининга10, включая SmartScope11, Smart EPU12 и CryoRL13,14. Чтобы устранить узкое место скрининга, Smart Leginon позволяет пользователю сначала настроить параметры скрининга в сеансе микроскопа шаблона, а затем использовать параметры этого сеанса в качестве шаблона для скрининга полной кассеты сеток в автозагрузчике микроскопа. Исключается вся ручная работа во время кассетного грохочения, что позволяет значительно эффективнее работать в контуре обратной связи оптимизации.
В этом протоколе описан полный рабочий процесс Smart Leginon Autoscreen, чтобы считыватель мог самостоятельно выполнять полностью автоматизированный многосетчатый криоЭМ-скрининг. Для тех, кто не знаком с Leginon, первый раздел протокола описывает традиционное использование Legunon. Эти знания складываются из многолетнего опыта работы с несколькими микроскопами с автозагрузкой, которые затем используются в последующем разделе протокола Smart Leginon. Дополнительные обучающие видео можно найти на https://memc.nysbc.org.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе мы опишем конвейер для Smart Leginon Autoscreen, а также основы использования Leginon для тех, кто не знаком с программным обеспечением для сбора данных. Ожидается, что к концу 2024 г. криоЭМ с одной частицей станет самым продуктивным трехмерным (3D) методом разрешения структуры белков17. Конвейер криоЭМ с одной частицей состоит из нескольких этапов, которые постоянно оптимизируются для повышения качества данных и пропускной способности. На рисунке 2 показаны наиболее распространенные этапы (подготовка образца, подготовка сетки, время и трудозатраты на просеивание, время сбора данных с высоким разрешением, обработка в реальном времени и полная постобработка), а также другие компоненты конвейера, которые могут быть улучшены (доступ к скрининговому микроскопу, скорость и точность стола, скорость камеры и доступ к микроскопу высокого разрешения). Результаты большинства шагов становятся петлями обратной связи с предыдущими шагами (синие стрелки на рисунке 2), что делает весь конвейер сильно взаимозависимым. Каждый шаг на рисунке 2 выделен цветом, чтобы приблизительно показать, насколько узким местом является этот шаг по сравнению с другими. Smart Leginon Autoscreen значительно сокращает время и усилия оператора при просеивании 12 сеток с 6 часов до менее чем 10 минут, тем самым устраняя это узкое место и обеспечивая более быструю обратную связь при подготовке пробы/сетки (рис. 3).
Протокол состоит из нескольких критических этапов, показанных на рисунке 1. Очень важно, чтобы сетка, используемая для создания сеанса шаблона, была репрезентативной по отношению к остальным сеткам, подлежащим скринингу. Важно отметить, что Leginon запоминает все настройки на протяжении всего процесса настройки для создания шаблонного сеанса (синие шаги на рисунке 1), что позволяет каждый раз быстрее настраивать повторяющиеся сеансы шаблона. При создании шаблона сеанса наиболее важным шагом является настройка таргетинга на все увеличения, чтобы параметры и пороговые значения отражали ожидаемое изменение по экранируемым сеткам. Различные кнопки «Тест» обеспечивают эффективность процесса настройки. Во время сеанса Autoscreen очень важно следить за первыми несколькими сетками в Appion, чтобы быстро обнаружить любые проблемы и исправить их в Leginon как можно скорее.
Типичный рабочий процесс в SEMC заключается в передаче данных Autoscreen в CryoSPARC Live18 и использовании этой дополнительной информации для информирования циклов обратной связи при подготовке образца/сетки. Во время интенсивных дней оптимизации криоЭМ для исследователей и операторов информация о состоянии образца и сетки возвращается в подготовку образца и сетки, в то время как Autoscreen по-прежнему просеивает сетки. Это позволяет замораживать и просеивать несколько десятков сеток занеделю 8.
Smart Leginon Autoscreen работает для большинства (80%-90%) дырявых сеток и условий, наблюдаемых в SEMC. Остальные 10%-20% сеток включают в себя те, которые иногда плохо работают – сетки с минимальной разницей контрастов между отверстиями и подложкой; сетки с меньшими отверстиями и интервалами (например, 0,6/0,8) – и сетки, где нацеливание на несколько сеток часто непрактично – сетки Spotiton/Chameleon19,20, состоящие из полос выборки по всей сетке; Кружевные сетки. Обратите внимание, что коллекция наклонной сетки с автоэкраном находится в разработке, но пока недоступна. Возможно, можно модифицировать протокол для работы с сетками Spotiton/Chameleon, сначала визуализируя области полосы вручную для определения узких пороговых значений параметров, затем пытаясь сгруппировать большие и меньшие квадраты вместе, соответственно, на шаге 2.1.7.4, а затем выбирая цели из группы с помощью льда. Цель этой модификации состоит в том, чтобы Smart Leginon разделил пустые и непустые квадраты на две группы. Если параметры найдены, они могут плохо распространяться на остальные сетки, подлежащие экранированию. Также можно модифицировать протокол для работы с сетками Лейси, удалив сценарий hl_finding.sh на шаге 2.1.9.1 и настроив параметры для более светлых/темных областей по желанию. Успешность этой модификации может варьироваться от сетки к сетке в зависимости от толщины льда и материала сетки.
Устранение неполадок во время сеанса автоэкрана возможно, а иногда и целесообразно. Изменения в предустановленных (например, расфокусировка) и целевых параметрах (например, пороговые значения Hole Target) могут быть внесены во время автоматического сбора. Во время сбора данных сеанс Autoscreen сеанс сетки не может быть отменен, так как он завершит autoscreen.py. Однако кнопки «Прервать» в узлах «Нацеливание» можно использовать для пропуска любой части сетки или всей сетки. Иногда autoscreen.py может использовать слишком много памяти и замораживать, предлагая два варианта: «принудительный выход» или «ожидание». Если выбран параметр «Принудительный выход», весь сценарий завершится, что потребует от пользователя повторного запуска сценария, который будет применен к оставшимся сеткам для скрининга. Если выбрано ‘wait’, сценарий продолжится, и настройки могут быть изменены для предотвращения зависания в будущем, например, отключение отображения изображения в узле Exposure, уменьшение размера пикселя в атласе или запуск скрипта очистки памяти. Если программа зависает, не предлагая двух вариантов, ошибки памяти могут не разрешиться сами по себе, что приведет к паузе в сборе данных. В этом случае может быть полезна опция «принудительного выхода».
Smart Leginon Autoscreen регулярно используется в SEMC. По мере того, как узкие места в конвейере одночастичных криоЭМ продолжают сокращаться, внедрение криоЭМ будет продолжать расти, чтобы помочь ответить на биологические вопросы. Данный протокол является шагом в направлении оптимизации всего пайплайна, предоставляя четкий путь для значительного сокращения циклов обратной связи.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Некоторые из этих работ были выполнены в Центре электронной микроскопии Саймонса в Нью-Йоркском центре структурной биологии при поддержке Фонда Саймонса (SF349247), NIH (U24 GM129539) и Ассамблеи штата Нью-Йорк.
Materials
| Glacios cryoTEM | Thermo Fisher Scientific | GLACIOSTEM | FEG, 200 keV, Falcon 3EC camera |
| Krios cryoTEM | Thermo Fisher Scientific | KRIOSG4TEM | XFEG, 300 keV, Gatan BioQuantum energy filter, Gatan K3 camera |
| Leginon | Simons Electron Microscopy Center | http://leginon.org | |
| Ptolemy | Simons Machine Learning Center | https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy |
References
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, e34257 (2018).
- Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM. Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing ‘standard’ sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Kampjut, D., Steiner, J., Sazanov, L. A. Cryo-EM grid optimization for membrane proteins. iScience. 24 (3), 102139 (2021).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Koh, A., et al. Routine collection of high-resolution cryo-EM datasets using 200 KV transmission electron microscope. Journal of Visualized Experiments. 181, 63519 (2022).
- Cheng, A., et al. Fully automated multi-grid cryoEM screening using Smart Leginon. IUCrJ. 10 (1), 77-89 (2023).
- Kim, P. T., Noble, A. J., Cheng, A., Bepler, T. Learning to automate cryo-electron microscopy data collection with Ptolemy. IUCrJ. 10 (1), 90-102 (2023).
- Bepler, T., et al. Smart data collection for CryoEM. Journal of Structural Biology. 214 (4), 107913 (2022).
- Bouvette, J., Huang, Q., Riccio, A. A., Copeland, W. C., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J. Automated systematic evaluation of cryo-EM specimens with SmartScope. eLife. 11, e80047 (2022).
- Deng, Y., Grollios, F., Kohr, H., van Knippenberg, B., Janus, M., Caglar, F. Smart EPU: SPA Getting Intelligent. Microscopy and Microanalysis. 27 (S1), 454-455 (2021).
- Fan, Q., et al. CryoRL: Reinforcement learning enables efficient cryo-EM data collection. arXiv. , (2022).
- Li, Y., et al. Optimized path planning surpasses human efficiency in cryo-EM imaging. bioRxiv. Biophysics. , (2022).
- Lander, G. C., et al. Appion: An integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
- Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
- Russo, C. J. The potential for seeing molecules in cells, CZ Imaging Institute’s Hardware Frontiers for CryoET Workshop. CZ Imaging Institute’s Hardware Frontiers for CryoET Workshop. , (2023).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Budell, W. C., Allegri, L., Dandey, V., Potter, C. S., Carragher, B. Cryo-electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, Spotiton. Journal of Visualized Experiments. 168, 62271 (2021).
- Darrow, M. C., Booth, T., Moore, J. P., Doering, K., Thaw, P., King, R. S. Enabling a paradigm shift in CryoEM sample preparation with chameleon. Microscopy and Microanalysis. 27 (S1), 524-525 (2021).
