Automação de triagem por microscopia crioeletrônica em várias redes usando o Smart Leginon
Summary
A triagem multigrade da microscopia crioeletrônica (cryoEM) é muitas vezes um processo tedioso que demanda horas de atenção. Este protocolo mostra como configurar uma coleção Leginon padrão e Smart Leginon Autoscreen para automatizar esse processo. Este protocolo pode ser aplicado à maioria das grades de folha de holey cryoEM.
Abstract
Os avanços nas técnicas de microscopia crioeletrônica (crioEM) na última década permitiram que biólogos estruturais resolvessem rotineiramente complexos de proteínas macromoleculares com resolução quase atômica. O fluxo de trabalho geral de todo o pipeline cryoEM envolve a iteração entre a preparação da amostra, a preparação da grade do cryoEM e a triagem da amostra/grade antes de passar para a coleta de dados de alta resolução. A iteração entre a preparação da amostra/grade e a triagem é tipicamente um grande gargalo para os pesquisadores, pois cada experimento iterativo deve ser otimizado para concentração da amostra, condições de tampão, material da grade, tamanho do furo da grade, espessura do gelo e comportamento das partículas de proteína no gelo, entre outras variáveis. Além disso, uma vez que essas variáveis são determinadas satisfatoriamente, as grades preparadas sob condições idênticas variam amplamente se estão prontas para a coleta de dados, portanto, sessões de triagem adicionais antes da seleção de grades ideais para coleta de dados de alta resolução são recomendadas. Este processo de preparação e triagem de amostras/grades geralmente consome várias dezenas de grades e dias de tempo do operador no microscópio. Além disso, o processo de triagem é limitado à disponibilidade do operador/microscópio e à acessibilidade ao microscópio. Aqui, demonstramos como usar o Leginon e o Smart Leginon Autoscreen para automatizar a maioria das peneiras de grade crioEM. O Autoscreen combina aprendizado de máquina, algoritmos de visão computacional e algoritmos de manuseio de microscópio para eliminar a necessidade de entrada manual constante do operador. A tela automática pode carregar e criar imagens de grades de forma autônoma com imagens em várias escalas usando um sistema automatizado de de troca de amostras, resultando em triagem de grade autônoma para um inteiro. Como resultado, o tempo do operador para a triagem de 12 grades pode ser reduzido para ~10 min com o Autoscreen em comparação com ~6 h usando métodos anteriores que são prejudicados por sua incapacidade de explicar a alta variabilidade entre grades. Esse protocolo primeiro introduz a configuração e a funcionalidade básicas do Leginon e, em seguida, demonstra a funcionalidade do Autoscreen passo a passo, desde a criação de uma sessão de modelo até o final de uma sessão de triagem automatizada de 12 grades.
Introduction
A microscopia crio-eletrônica de partícula única (cryoEM) permite a determinação da estrutura de resolução quase atômica de complexos macromoleculares purificados. Um experimento crioEM de uma única partícula requer apenas uma ou duas grades bem escolhidas selecionadas de um conjunto muito maior de grades com condições variadas de amostra e grade. A triagem ao microscópio para examinar essas grades envolve a obtenção de imagens de cada grade em várias ampliações para determinar qual grade satisfaz a maioria dos requisitos essenciais para a coleta de dados de alta resolução, incluindo espessura do gelo, áreas suficientes para a coleta completa de dados, pureza da proteína, concentração de proteína, estabilidade da proteína e questões mínimas de orientação preferencial1. A otimização para esses requisitos-chave geralmente envolve feedback entre a triagem no microscópio e as condições de preparação, como produção de proteínas, seleção de tampão, detergentes potenciais e tipode grade 2,3,4 (Figura 1). A triagem convencional da grade é realizada manualmente ou semi-manualmente com softwares como Leginon5, SerialEM6 e EPU7. A triagem convencional requer que o operador do microscópio passe horas no microscópio para filtrar várias grades, o que cria um gargalo significativo no fluxo de trabalho de partícula única de alta resolução, ocupando o operador com operações rotativas em vez de otimização de amostra/grade.
Anteriormente, o Smart Leginon Autoscreen e o software de aprendizado de máquina subjacente, Ptolomeu, foram introduzidos, e seus métodos e algoritmos subjacentes, juntamente com exemplos, foram descritos 8,9. Vários outros pacotes de software são capazes ou trabalham para a triagem multi-grid totalmente automatizada10, incluindo SmartScope11, Smart EPU12 e CryoRL13,14. Para resolver o gargalo de triagem, o Smart Leginon permite que o usuário primeiro configure os parâmetros de triagem em uma sessão de microscópio de modelo e, em seguida, use os parâmetros dessa sessão de modelo como um modelo para examinar o completo de grades no carregador automático do microscópio. Todo o trabalho manual durante a triagem do é eliminado, o que permite que o ciclo de feedback de otimização prossiga de forma significativamente mais eficiente.
Neste protocolo, o fluxo de trabalho completo do Smart Leginon Autoscreen é descrito para que o leitor possa executar a triagem crioEM multi-grid totalmente automatizada de forma independente. Para aqueles novos no Leginon, a primeira seção do protocolo descreve o uso convencional do Leginon . Esse conhecimento é composto por vários anos de experiência em vários microscópios de carregador automático, que é então construído na seção Smart Leginon subsequente do protocolo. Vídeos tutoriais adicionais podem ser encontrados em https://memc.nysbc.org.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, descrevemos o pipeline para Smart Leginon Autoscreen e, adicionalmente, o uso básico do Leginon para aqueles novos no software de coleta. O crioEM de partícula única está prestes a se tornar a técnica de resolução de estrutura de proteína tridimensional (3D) mais produtiva até o final de 202417. O pipeline cryoEM de partícula única consiste em várias etapas que estão constantemente sendo otimizadas para aumentar a qualidade e a taxa de transferência dos dados. A Figura 2 mostra as etapas mais comuns (preparação da amostra, preparação da grade, tempo e esforço de triagem, tempo de coleta de alta resolução, processamento ao vivo e pós-processamento completo), juntamente com outros componentes da tubulação que podem ser melhorados (acesso ao microscópio de triagem, velocidade e precisão do estágio, velocidade da câmera e acesso ao microscópio de alta resolução). Os resultados da maioria das etapas tornam-se loops de feedback para as etapas anteriores (setas azuis na Figura 2), tornando todo o pipeline altamente interdependente. Cada etapa na Figura 2 é colorida para aproximar o quanto de um gargalo a etapa é em relação a outras. O Smart Leginon Autoscreen reduz significativamente o tempo e o esforço do operador para a triagem de 12 grades de 6 h para menos de 10 min, aliviando esse gargalo e permitindo um feedback mais rápido para a preparação da amostra/grade (Figura 3).
Há várias etapas críticas no Protocolo, descritas na Figura 1. É fundamental que a grade usada para criar a sessão de modelo seja representativa das grades restantes a serem examinadas. É importante ressaltar que o Leginon se lembra de todas as configurações em todo o processo de configuração para criar uma sessão de modelo (etapas azuis na Figura 1), o que permite que sessões de modelo recorrentes sejam configuradas mais rapidamente a cada vez. Ao criar uma sessão de modelo, a etapa mais crítica é configurar a segmentação em todas as ampliações para que os parâmetros e limites reflitam a variação esperada nas grades a serem examinadas. Os vários botões ‘Test’ permitem eficiência neste processo de configuração. Durante uma sessão de tela automática, é fundamental monitorar as primeiras grades no Appion para detectar rapidamente quaisquer problemas e corrigi-los dentro do Leginon o mais rápido possível.
O fluxo de trabalho típico no SEMC é alimentar dados de tela automática no CryoSPARC Live18 e usar essas informações adicionais para informar os loops de feedback na preparação de amostra/grade. Durante os dias intensivos de otimização crioEM do pesquisador-operador, as informações sobre as condições da amostra e da grade são realimentadas na preparação da amostra e da grade, enquanto o Autoscreen ainda está rastreando as grades. Isso permite que várias dezenas de grades sejam congeladas e rastreadas por semana8.
O Smart Leginon Autoscreen funciona para a maioria (80%-90%) das redes e condições observadas no SEMC. Os restantes 10%-20% das grelhas incluem aquelas que por vezes não funcionam bem – grelhas com mínima diferença de contraste entre furos e substrato; grades com furos e espaçamento menores (por exemplo, 0,6/0,8) – e grades onde o direcionamento através de várias grades é muitas vezes impraticável – Spotiton/Chameleon19,20 grades que consistem em faixas de amostra em toda a grade; grades rendilhadas. Observe que a coleção de grade inclinada com Autoscreen está em desenvolvimento, mas ainda não está disponível. Pode ser possível modificar o protocolo para trabalhar com grades Spotiton/Chameleon primeiro imageando áreas da faixa manualmente para determinar limiares de parâmetros estreitos, depois tentando agrupar quadrados maiores e menores, respectivamente, na etapa 2.1.7.4 e, em seguida, selecionando alvos do grupo com gelo. O objetivo desta modificação é fazer com que o Smart Leginon separe os quadrados vazios e não vazios em dois grupos. Se os parâmetros forem encontrados, eles podem não se estender bem para as grades restantes a serem examinadas. Também pode ser possível modificar o protocolo para trabalhar com grades lacey removendo o script hl_finding.sh na etapa 2.1.9.1 e configurando os parâmetros para direcionar áreas mais claras/escuras conforme desejado. A taxa de sucesso desta modificação pode variar de grade para grade com base nas espessuras do gelo e no material da grade.
A solução de problemas durante uma sessão de tela automática é possível e, às vezes, apropriada. Alterações nos parâmetros predefinidos (por exemplo, desfocagem) e de segmentação (por exemplo, limites de segmentação de furos) podem ser feitas durante a coleta automatizada. Enquanto uma sessão de tela automática estiver sendo coletada, uma sessão de grade não poderá ser cancelada porque encerrará autoscreen.py. No entanto, os botões Anular nos nós de Direcionamento podem ser usados para ignorar qualquer parte de uma grade ou uma grade inteira. Ocasionalmente, autoscreen.py pode usar muita memória e congelar, oferecendo duas opções: ‘forçar a saída’ ou ‘esperar’. Se ‘forçar encerramento’ for selecionado, todo o script será encerrado, exigindo que o usuário execute novamente o script a ser aplicado às grades restantes para triagem. Se ‘esperar’ for selecionado, o script continuará e as configurações poderão ser alteradas para evitar congelamento futuro, por exemplo, desativar a exibição da imagem no nó Exposição, diminuir o tamanho do pixel no atlas ou executar um script de limpeza de memória. Se o programa congelar sem oferecer as duas opções, os erros de memória podem não resolver por conta própria, causando uma pausa na aquisição. A opção ‘forçar encerramento’ pode ser útil neste caso.
Smart Leginon Autoscreen é usado regularmente na SEMC. À medida que os gargalos no pipeline de crioEM de partícula única continuam a ser reduzidos, a adoção do cryoEM continuará a aumentar para ajudar a responder a questões biológicas. Este protocolo é um passo na direção de otimizar todo o pipeline, fornecendo um caminho claro para reduzir significativamente os loops de feedback.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Parte deste trabalho foi realizado no Simons Electron Microscopy Center no New York Structural Biology Center, com apoio da Simons Foundation (SF349247), NIH (U24 GM129539) e NY State Assembly.
Materials
| Glacios cryoTEM | Thermo Fisher Scientific | GLACIOSTEM | FEG, 200 keV, Falcon 3EC camera |
| Krios cryoTEM | Thermo Fisher Scientific | KRIOSG4TEM | XFEG, 300 keV, Gatan BioQuantum energy filter, Gatan K3 camera |
| Leginon | Simons Electron Microscopy Center | http://leginon.org | |
| Ptolemy | Simons Machine Learning Center | https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy |
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