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Biochemistry

Smart Leginon を使用した複数のグリッドにわたるクライオ電子顕微鏡スクリーニングの自動化

Published: December 01, 2023
doi:
10.3791/66007
, , , , , ,
1Simons Electron Microscopy Center, New York Structural Biology Center, 2Herbert Wertheim UF Scripps Institute for Biomedical Innovation & Technology

Summary

クライオ電子顕微鏡(クライオ電子顕微鏡)のマルチグリッドスクリーニングは、多くの場合、何時間もの注意を必要とする退屈なプロセスです。このプロトコルでは、このプロセスを自動化するために、標準の Leginon コレクションと Smart Leginon Autoscreen を設定する方法を示します。このプロトコルは、大部分のクライオ電子顕微鏡穴埋めグリッドに適用できます。

Abstract

過去10年間のクライオ電子顕微鏡(クライオ電子顕微鏡)技術の進歩により、構造生物学者は高分子タンパク質複合体を原子に近い分解能で日常的に分離できるようになりました。クライオ電子顕微鏡パイプライン全体の一般的なワークフローでは、高分解能データ収集に移る前に、サンプル調製、クライオ電子顕微鏡グリッド調製、サンプル/グリッドスクリーニングを繰り返します。サンプル/グリッド調製とスクリーニングの繰り返しは、すべての反復実験で、サンプル濃度、バッファー条件、グリッド材料、グリッドホールのサイズ、氷の厚さ、氷中のタンパク質粒子の挙動などの変数を最適化する必要があるため、研究者にとって通常、大きなボトルネックとなります。さらに、これらの変数が十分に決定されると、同じ条件下で準備されたグリッドは、データ収集の準備ができているかどうかで大きく異なるため、高解像度のデータ収集に最適なグリッドを選択する前に、追加のスクリーニングセッションが推奨されます。このサンプル/グリッドの調製およびスクリーニングプロセスでは、多くの場合、数十グリッドと数日分のオペレーターが顕微鏡で作業する時間が消費されます。さらに、スクリーニングプロセスは、オペレーター/顕微鏡の可用性と顕微鏡へのアクセス性に限定されます。ここでは、LeginonとSmart Leginon Autoscreenを使用してクライオ電子顕微鏡グリッドスクリーニングの大部分を自動化する方法を紹介します。Autoscreenは、機械学習、コンピュータービジョンアルゴリズム、顕微鏡処理アルゴリズムを組み合わせて、オペレーターが常に手動で入力する必要をなくします。Autoscreenは、自動検体交換カセットシステムを使用して、マルチスケールイメージングでグリッドを自律的にロードしてイメージングできるため、カセット全体の無人グリッドスクリーニングが可能になります。その結果、12グリッドをスクリーニングするオペレーター時間は、グリッド間の大きな変動性を考慮できないために妨げられていた以前の方法を使用した~6時間と比較して、自動スクリーニングを使用すると~10分に短縮できます。このプロトコルでは、まずLeginonの基本的なセットアップと機能を紹介し、次にテンプレートセッションの作成から12グリッドの自動スクリーニングセッションの終了まで、自動スクリーニング機能を段階的にデモンストレーションします。

Introduction

単粒子クライオ電子顕微鏡(クライオEM)は、精製された高分子複合体の原子分解能に近い構造決定を可能にします。単一粒子クライオ電子顕微鏡実験では、サンプルとグリッド条件が異なる、はるかに大きなグリッドセットから選択された1つまたは2つのグリッドのみが必要です。これらのグリッドを調べるための顕微鏡スクリーニングでは、各グリッドを数倍でイメージングし、氷の厚さ、完全なデータ収集のための十分な面積、タンパク質の純度、タンパク質濃度、タンパク質の安定性、および最小優先配向の問題など、高解像度データ収集の最も重要な要件を満たすグリッドを決定します1.これらの重要な要件に合わせて最適化するには、多くの場合、顕微鏡でのスクリーニングと、タンパク質産生、バッファーの選択、界面活性剤の候補、グリッドタイプ2、3、4 などの調製条件との間のフィードバックが必要です(図1)。従来のグリッドスクリーニングは、Leginon5、SerialEM6、EPU7などのソフトウェアを使用して手動または半手動で行われます。従来のスクリーニングでは、顕微鏡オペレーターが顕微鏡で何時間もかけて複数のグリッドをスクリーニングする必要があり、サンプル/グリッドの最適化ではなく、オペレーターを暗記操作に費やすため、高解像度の単粒子ワークフローに大きなボトルネックが生じていました。

以前、Smart Leginon Autoscreenと基礎となる機械学習ソフトウェアであるPtolemyを紹介し、その基礎となる方法とアルゴリズムを例とともに説明しました8,9。SmartScope11、Smart EPU12、CryoRL13,14など、他のいくつかのソフトウェアパッケージは、完全に自動化されたマルチグリッドスクリーニング10が可能であるか、またはそれに向けて機能しています。スクリーニングのボトルネックに対処するために、Smart Leginonでは、まずテンプレート顕微鏡セッションでスクリーニングパラメータを設定し、次にそのテンプレートセッションのパラメータをテンプレートとして使用して、顕微鏡オートローダーでグリッドのフルカセットをスクリーニングすることができます。カセットスクリーニング中の手作業がすべて排除されるため、最適化のフィードバックループが大幅に効率的に進行します。

このプロトコルでは、読者が完全に自動化されたマルチグリッドクライオ電子顕微鏡スクリーニングを独立して実行できるように、完全なSmart Leginon Autoscreenワークフローが説明されています。Leginonを初めて使用する人のために、プロトコルの最初のセクションでは、従来のLeginonの使用法について説明します。この知識は、複数のオートローダー顕微鏡での数年間の経験から構成されており、プロトコルの次のSmart Leginonセクションで構築されています。その他のチュートリアルビデオは、https://memc.nysbc.org にあります。

Protocol

図2に示すこのプロトコルに従うには、Leginon 3.6+を顕微鏡コンピュータと追加のLinuxワークステーションにインストールし、PtolemyをLinuxワークステーションにインストールする必要があります。このプロトコルは、サーモフィッシャーサイエンティフィック(TFS)のGlaciosおよびKrios顕微鏡を使用して数年にわたって開発されました。このプロトコルは、読者がすでにLeginon、Appion15、関連データベース、顕微鏡キャリブレーションを設定し、顕微鏡上で直接アライメントを行い、2つのLeginonアプリケーション(1つは標準的な単一粒子収集用、もう1つはPtolemyによる単一粒子収集用)をセットアップしていることを前提としています。Leginonの設定に関する情報は、https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Manual を参照してください。Leginon内でプトレマイオスを設定するための情報は、https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Multi-grid_autoscreening で入手できます。http://leginon.org から Leginon を、https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy から Ptolemy をダウンロードしてください。Leginon は Apache License, Version 2.0 でライセンスされており、Ptolemy は CC BY-NC 4.0 でライセンスされています。 1. Leginonの使用法 Leginon を起動します顕微鏡のWindowsコンピュータで、Leginonクライアントをすべて閉じてから、再度開きます。Linuxワークステーションで、ターミナル・ウィンドウを開き、 start-leginon.py またはLeginonを起動するためのシステムの適切な エイリアス を入力します。 新しい [Leginon Setup ] ウィンドウで、[ Create a new session ] を選択し、[ Next] をクリックします。 ドロップダウンリストからプロジェクトを選択し、「 次へ」をクリックします。 名前はそのままにして、顕微鏡のセットアップに適したホルダーを選択し、[次へ]をクリックします。 説明には、顕微鏡名、グリッド/サンプルの説明、実験の説明などの関連情報を入力し、[ 次へ]をクリックします。 イメージディレクトリで、適切なファイルシステムが選択されていること、およびフルパスがイメージの保存に適していることを確認してから、「 次へ」をクリックします。 [ クライアントへの接続] で [編集] をクリックします。ドロップダウンメニューで、接続するすべてのコンピューターを選択し、それぞれの[+]ボタンをクリックして、[ OK ]と[ 次へ]をクリックします。 正しい C2 アパーチャ サイズを入力し、[ 次へ] をクリックします。この値は、TFS TUI ソフトウェアの [ 絞り ] タブにあります。 Leginonインターフェースツールバーから「 アプリケーション 」を選択し、「 実行」をクリックします。 ドロップダウンメニューから適切なアプリケーションを選択します(必要に応じて[ すべて表示 ]をクリックします)。 main をLeginonコンピュータに設定し、 スコープとカメラ をそれぞれのコンピュータに設定して、[ 実行]をクリックします。Leginon のメイン ウィンドウの左側にノードが表示されます。注:左側のパネルには、すべてのLeginonノードが表示されます。緑色のカメラアイコンノードは、保存される画像(グリッド、正方形、穴、露出)です。ターゲット符号が付いているノードは、高倍率の画像をターゲットとするための低倍率の画像です。紫色のカメラ ノードは、ユーセントリック Z ハイトとユーセントリック フォーカスを検出するようにプログラムされたノードです。さらに、ゼロロスピークのアライメント、バッファーサイクルの監視、液体窒素充填の監視、ゲイン補正画像の収集、氷の厚さ(IceT)の計算、ステージと画像シフトを使用したさまざまな倍率でのグリッドのナビゲーションを行うノードがあります。 プリセットマネージャーPresets_Managerノードをクリックします。そのノードで、一番下のアイコンをクリックしてプリセットをインポートするか、その上のアイコンをクリックして、顕微鏡の現在の状態から新しいプリセットを作成します。 下部のアイコンをクリックすると、 プリセットのインポート ウィンドウが開きます。正しいTEMとデジタルカメラを選択し、 検索 をクリックして、目的のプリセットを持つ最新のセッションを選択します。必要なプリセットをすべてハイライト表示し、「 読み込み」をクリックしてから 、「完了」をクリックします。注: [Presets Manager]ノードには、インポートおよび作成されたすべてのプリセットが一覧表示されます。gr:グリッド倍率、sq:正方形倍率、hln:穴倍率、ファン:オートフォーカス、fcn:中心焦点、enn:露光倍率(末尾の「n」はナノプローブ)など、いくつかの倍率とフォーカシングのプリセットを用意することをお勧めします。各倍率の標準的なプリセットパラメータを表1、表2、表3に示します。このプロトコルでは、Glaciosには70 μm、Selectris XおよびFalcon 4iを搭載したKriosには50 μm、K3を搭載したBioQuantumを搭載したKriosには100 μmのC2開口サイズを使用することに注意してください。 ナビゲーションとユーセントリック高さLeginon による顕微鏡の制御とグリッドの Z 高さの設定に慣れるには、 ナビゲーション ノードに移動し、上部にある gr プリセットを選択し、右側の 赤い矢印 をクリックしてプリセット設定を顕微鏡に送信します。顕微鏡は1〜2秒後に更新されます。更新したら、右側の カメラボタンをクリックして 画像を取得します。 カーソルツールを使用して、ステージを移動するグリッドの正方形を選択します。 平方 倍率をクリックしてから 赤い矢印 をクリックして顕微鏡に送信し、 カメラボタンをクリックして 画像を取得します。 Z_Focusノードに移動し、ボタンの中央付近の上部にある [Simulate Target] ボタンをクリックします。ステージチルトフォーカシングのために画像を収集している間に、相関ビューに切り替えてピークを観察し、ピークが相関画像の隅にあることを確認します。フォーカスが終了したら、ステージがグリッドの Z 高さに設定されていることを確認します。 昏睡状態の矯正注:このサブセクションでは、直接アライメントがすでに実行されており、コマ収差補正が実行されていないことを前提としています。カーボン基板などの透明なトーンリングを生成するグリッドの領域に移動します。注:コレクションが金のグリッドで行われる場合は、クロスグレーティングを使用できます。 Beam_Tilt_Image設定で、プリセットの順序に 0.005 ラジアンの角度で 4 つの傾斜方向を持つ fcn のみが含まれていることを確認します。 [ ターゲットのシミュレート] をクリックして、Zemlin タブローを作成します。メイン ウィンドウの左側にある [ Tableau ] をクリックして、Tableau を表示します。 左右のフーリエ変換を相互に比較し、上下のフーリエ変換を相互に比較してコマ収差を補正します。イメージのペアが同一でない場合は、まずイメージ調整の右側にあるカーソル アイコンをクリックし、次に Tableau イメージの中心からわずかにずれた差分の方向をクリックして、新しいフーリエ変換のセットが収集されるのを待ちます。フーリエ変換が同一になるまで繰り返します。注: 各 Tableau クリックは完了するまでに数秒かかるため、この間、追加のクリックは行わないでください。 ゲイン基準注意: カメラに自動ハードウェアリファレンスがある場合は、このセクションをスキップしてください。ナビゲーションノードで、grなどの低倍率プリセットを送信し、ビームパスに障害物がない領域に移動します。 ステージ位置がビームパスに遮られない位置にあることを、 sq または hln プリセットを使用して中倍率の画像を撮影して確認します。 高倍率 enn プリセットを顕微鏡に送ります。 補正ノードの設定で、適切なインストゥルメント情報を選択し、コレクションの設定と一致するようにカメラ設定を設定します。 顕微鏡のカラムバルブを閉じて暗い参照画像を収集し、 補正ノードで上部のドロップダウンメニューから [暗い ]と[ 両方のチャンネル ]を選択し、右側の [カメラを取得 ]ボタンをクリックします。 完了したら、ドロップダウンメニューから [Bright ]を選択し、[ 取得]をクリックします。Leginonはカラムバルブを自動的に開きます。 ドロップダウン メニューから [補正済み ] を選択し、[ 取得] をクリックして、結果の画像を観察して、ゲインが正しく収集されたことを確認します。 氷の厚さの参考画像顕微鏡にエネルギーフィルターがある場合は、IceTノード設定で氷の厚さ画像を収集にチェックを入れ、平均自由行程に395と入力し、セットアップの残りの値を入力します。 顕微鏡にエネルギーフィルターがない場合は、ナビゲーションノードでennプリセットを顕微鏡に送信し、取得をクリックします。左側の [平均ピクセル] の値をメモします。IceTノードの設定で、開口制限散乱から氷の厚さを計算にチェックを入れ、ALS係数と測定された平均ピクセル値に1055と入力します。注:値395と1055は、前述のように、それぞれTFS KriosとGlaciosについて決定されたものであり、顕微鏡構成によっては再校正が必要な場合があります。 画像線量キャリブレーションPreset_Managerで、ennプリセットを選択し、カメラボタン(選択したプリセットの線量画像を取得)をクリックします。底面の測定線量を確認してください。期待値に近い場合 (通常は 30 から 70 の間) は、[はい] をクリックします。 プリセットの配置Preset_Managerで、すべての高倍率プリセット(enn、fcn、fan)をチェックして、画像シフトとビームシフトが0、0であることを確認します。 顕微鏡コンピュータで、炭素領域 に移動します 。 Leginon コンピューターの Navigation ノードで、gr プリセットを使用して画像を取得します。 目的のオブジェクトを見つけ、 カーソルツールを使用してその場所に移動します。 hlnプリセットで画像を取得し、カーソルツールを使用して、その対象オブジェクトの一意の部分を中央に再配置します。 ennプリセットで画像を取得し、カーソルツールを使用して目的のオブジェクトの同じ一意の部分に再配置します。 プルダウンメニューから 画像シフト を選択し、hlnプリセットで画像 を取得します 。 カーソルツールを使用して、対象オブジェクトの同じ一意の部分に移動します。 Presets_Managerで、hln プリセットを選択し、設定ボタンをクリックし、画像シフト値の横にある左緑色の矢印をクリックして、ナビゲーションから画像シフトをインポートします。 手順 2.9.7 と 2.9.8 を sq プリセットと gr プリセットに対して繰り返します。 グリッドアトラス顕微鏡コンピュータで、 カラムバルブ を閉じ、対物レンズの開口部を 引っ込め ます。 Grid_Targetingノードに移動します。設定で、グリッドのラベルを変更します。アトラスの目的の半径を選択します(最大半径は0.0009 mです)。[ OK] をクリックします。次に、上部にある [Calculate atlas calculator] ボタンをクリックし、 緑色の [Play] ボタン (‘Submit Targets’) をクリックします。 Square_Targetingノードでは、グリッド画像が収集され、つなぎ合わされてアトラスが形成されます。ドロップダウンメニューを使用してズームインおよびズームアウトし、コントラストと明るさを調整します。スクロール バーを使用して、グリッド内を移動します。 アトラスが収集されたら、必要に応じて対物レンズの開口部 を挿入し ます。 顕微鏡にエネルギーフィルターがある場合は、壊れた正方形の中央にある 参照ターゲット を選択し、 再生ボタンを押して、次のサブセクションでZLPアライメントに進みます。それ以外の場合は、ZLPアライメント手順をスキップします。 ZLPアライメントAlign_ZLPノード設定で、参照ターゲットを移動するステージ位置nを選択し、ムーバーとしてプリセットマネージャーを選択します。バイパスコンディショナーの選択を解除し、OKを押します。注意: ZLPアライメントは、顕微鏡が定期的に参照ターゲットに移動し、カメラのZLPアライメントルーチンを実行するように構成する必要があります。ZLPの再アライメント時間は、通常、Gatan BioQuantumおよびTFS Selectris Xエネルギーフィルターでそれぞれ30分および60分で安全です。これらの値は、一定の湿度、一定の温度、電磁界絶縁、振動絶縁など、エネルギーフィルタの条件によって異なります。 穴テンプレートのターゲット設定Square_Targetingノードで、複数の集録ターゲットを選択し、再生を押します。 Hole_Targetingノード設定で、[Allow user verification of selected targets] (選択したターゲットのユーザー検証を許可)と[Queue up targets] (ターゲットをキューに入れる)がオンになっていることを確認します。また、チェックしてください 自動穴探知機をスキップする 今のところ。「適用」をクリックし、「OK」をクリックします。 メインウィンドウで、[ Ctrl]-[Shift]を押しながら右クリック して、すべてのターゲットを削除します。 取得カーソル を選択し、ターゲットを配置します。 フォーカスカーソル を選択し、取得ターゲットの間にフォーカスターゲットを配置します。[ 再生] をクリックします。 次の Hole_Targeting 画像では、設定の 自動穴探知 機をスキップするチェックを外し、[ 適用 ]と[ OK]をクリックします。 Ctrl-Shift-右クリックで自動ターゲットを削除します。 定規ツールを選択し、穴の直径を測定します。テンプレート設定(Template settings)で、最終テンプレート直径(Final Template Diameter)を測定された穴の直径に変更します。元のテンプレートの直径は変更しないでください。[テスト] をクリックします。明るいピークが各穴の中心にない場合は、最終テンプレートの直径(Final Template Diameter)を大きくします。終了したら、「OK」をクリックします。 しきい値(Threshold)設定で、[テスト]をクリックしたときに穴を個別にセグメント化する A の値を選択します。問題がなければ [OK] をクリックします。 [ BLOB] 設定で、値を入力し、[ テスト] をクリックします。[最大 BLOB] の値は 1 であるため、1 つの BLOB のみが表示されます。[ OK] をクリックします。 ラティス設定で、定規ツールを使用して、2つの穴間の距離(中心から中心)を測定します。[間隔]に値を入力し、[テスト]をクリックします。1つのブロブが格子点に変わります。[OK] をクリックします。 取得設定に移動し、氷の厚さのしきい値と[ターゲットをテスト]ボタンを使用して取得ターゲットを最適化します。格子点にカーソルを合わせると、氷の厚さの情報を取得します。 取得ターゲットが満足のいくものでない場合は、 定規ツールを使用して 、格子点から取得ターゲットの目的の位置までの距離と角度を測定します。前の 取得ターゲット テンプレート ポイントを削除します。 Auto Fillをクリックし、ターゲットの数を 4 にして、半径と角度を測定値に変更します。[ OK] をクリックします。 Apply ice thickness threshold on template-convolved acquisition targetsにチェックを入れます。 ラティスポイントと氷の厚さの閾値に問題がなければ、 Submit Targets ボタンをクリックします。 必要に応じて、選択した各正方形について、上記の手順を繰り返します。すべての正方形ターゲットが送信されたら、[ Submit Queued Targets] ボタン を使用してキュー全体を送信します。 Leginonは、ターゲットの各セットの焦点合わせとイメージングを開始します。 Z_Focusノードで、ユーセントリックの高さが正しく検出されていることを確認します。 露出テンプレートのターゲット設定露出ターゲティングノードに、穴の拡大画像が表示されます。[Ctrl]-[Shift]を押しながら右クリックして、自動ターゲットを削除します。 定規ツールで穴の直径を測定します。テンプレート設定で、直径を最終テンプレート直径(Final Template Diameter)に入力し、テスト(Test)をクリックします。これで、各穴の中心にピークが配置されます。必要に応じて、直径(Diameter)の値を調整します。 [しきい値]設定で、2値化されたテスト画像に穴がある部分のみの白い領域が表示されるまで、A値を調整します。 [BLOB] 設定で、[テスト] をクリックします。セグメント化された穴ごとに 1 つのブロブが表示されます。必要に応じて、境界線を大きくして、画像の端からブロブを削除します。 ラティス(Lattice)設定で、テスト(Test)をクリックします。すべてのブロブがラティスポイントに変わるまでパラメータを調整します。[OK] をクリックします。 定規ツールをクリックして、2つの格子点間の距離を測定します。ラティス(Lattice)設定で、間隔(Spacing)をその距離に変更します。 各格子点にカーソルを合わせると、平均強度、平均厚さ、標準偏差強度、標準偏差厚さが表示されます。各ラティスポイントの強度をメモし、それらを使用して 、取得設定で必要な氷の厚さパラメータを設定します。 定 規ツールで、1つの格子点から4つの穴の中心までの距離と角度を測定します。 取得設定で、現在のフォーカスターゲットを削除します。 [オートフィル]をクリックし、半径と角度を測定値に変更します。「 ターゲットをテスト」をクリックし、「 OK」をクリックして、「 ターゲットを送信」をクリックします。注:Leginonはユーセントリックフォーカス(フォーカスノード)を検出し、露出 ノードに表示される露出を収集します。 すべてのターゲットがイメージ化されたら、 Exposure_Targetingノード に移動して次の穴のイメージを確認します。設定で 、[選択したターゲットのユーザー検証を許可する] のチェックを外します。また、 ターゲットをキューに入れる と 自動穴探知機をスキップする のチェックを外します。「 OK 」をクリックし、「 ターゲットの送信」をクリックします。注:Leginonは、上記の設定に基づいて画像を自動的に収集します。Appionの画像とメタデータを参照してください。 自動収集中に変更を行うことができます。たとえば、コレクションの焦点ぼけ範囲は、Preset_Managerのennプリセットを編集することでいつでも変更できます。 収集を停止する必要がある場合は、[穴]ノードと[露出]ノードの[ 中止 ]ボタンと[ キューの中止 ]ボタンをクリックしてキューを終了します。 収集が終了したら、[ アプリケーション ]に移動して [強制終了]をクリックし、[ ファイル ]に移動して [終了]をクリックします。 2. Smart Leginon Autoscreenの使用法 Smart Leginon テンプレート セッションの作成セクション 1 の指示に従って Leginon を起動します。 「 アプリケーション 」に移動し、「 実行」をクリックします。「 アプリケーションの実行 」ウィンドウで、 Ptolemy アプリケーション を選択します(必要に応じて「 すべて表示 」を選択します)。 main を Leginon コンピューターに設定し、 スコープとカメラ をそれぞれのコンピューターに設定します。 Preset_Managerで、手順1.2.3の説明に従ってプリセットをインポートします。 ノード設定を構成します。Square_Targetingノード設定で、最短パスでターゲットを並べ替える と 自動ターゲティングを有効にする がオンになっていることを確認します (補足図 1A)。 Squareノードの設定で、Wait for node to process the imageにチェックが入っていることを確認します。ドロップダウンメニューから右側のリストに正方形プリセットを追加します(まだ追加されていない場合)。[詳細設定]で、[イメージング中にこれらの絞りを設定する]をオンにし、2つの絞りの値が正しいことを確認します(補足図1B)。 Hole_Targetingノード設定で、「選択したターゲットのユーザー検証を許可」にチェックを入れます。Queue up targets と Skip automated hole finder のチェックを外します (補足図 2A)。 Hole node(穴ノード)設定で、Wait for a node to process the image(ノードが画像を処理するのを待つ)にチェックを入れると、右側のリストにHoleプリセットが表示されます。[詳細設定]で、[イメージング中にこれらの絞りを設定する]をオンにし、2つの絞りの値が正しいことを確認します(補足図2B)。 Exposure_Targetingノード設定で、「選択したターゲットのユーザー検証を許可」にチェックを入れます。Queue up targets と Skip automated hole finder のチェックを外します (補足図 3A)。 露出ノードの設定で、ノードが画像を処理するのを待つ]がオフになっていることを確認し、露出プリセットが右側にリストされていることを確認し、[詳細設定]で、イメージング中にこれらの絞りを設定するをオンにして、2つの絞りの値が正しいことを確認します(補足図3B)。 [フォーカス ノード] 設定で、[ノードが画像を処理するのを待つ] がオフになっていること、オートフォーカス プリセットが右側に表示されていること、および [目的のオートフォーカス精度] が 4 x 10-6 m に設定されていることを確認します (補足図 4A)。 フォーカスノードのフォーカスシーケンス(設定ボタンの横)で、2つのビームチルトオートフォーカスステップのみを有効にします(補足図4B、C)。 Z_Focusノード設定で、ノードが画像を処理するのを待つ]がオフになっていること、穴プリセットが右側にリストされていること、および目的のオートフォーカス精度が5 x 10-5 mであることを確認します(補足図5A)。 Z_Focusノードのフォーカスシーケンスで、低倍率のステージチルトステップを2つだけ有効にします(補足図5B、C)。 手順 1.2.4 の説明に従って、グリッドの Z 高さを決定します。 手順1.2.10の説明に従ってアトラスを収集します。 スクエアファインダーのパラメータを設定します。アトラスが収集されると、プトレマイオスは Square_Targetingノードで正方形を見つけます。各正方形には、ブロブと呼ばれる青い円が表示されます。各ブロブにカーソルを合わせると、レギノンはプトレマイオスによって計算されたサイズを報告します。最大と最小のブロブをメモします。 [しきい値] 設定で、最小フィルター範囲と最大フィルター範囲を変更して、望ましい正方形を含め、望ましくない正方形を除外します。 上部のツールバーの「正方形を検索」ボタンをクリックします。Find Squaresがうまくターゲットを絞るまで、Filter Rangeを調整します。 取り込み設定で、[最大ターゲット数]と[サンプリングするターゲットグループの数]の値を選択します。これらのパラメータは、ターゲットとする正方形の数と正方形のグループを定義します。 パラメータに満足したら、[ 再生 ]ボタンをクリックします。セットアップ後のアトラスの例を 補足図6に示します。 穴探知機のパラメータを設定します。Hole_Targetingノードで、定規ツールを使用して穴の直径を測定します。 テンプレート設定で、直径を最終テンプレート直径(Final Template Diameter)に入力し、テスト(Test)をクリックします。すべての穴の中心に明るい白いピークができるまで直径を調整します。 「しきい値」設定で、「テスト」をクリックします。2値化された画像に穴がある部分だけに白い領域が表示されるまで、A値を調整します。 ブロブの設定で、ルーラーを使用してエッジからの最小距離を決定し、その値を入力して、境界線のターゲットを除外することを選択します。ブロブは、サイズ、丸み、および必要な数でフィルタリングできます。ブロブにカーソルを合わせると、その値が表示されます。「テスト」をクリックして、現在の値を調べます。 ラティス設定で、穴の半径と穴の間隔を入力し(測定ツールを使用)、42ボタンをクリックして、真空領域(空の穴または壊れたサポートフィルム)の基準強度値を測定します。 取り込み設定で、取り込みターゲットのサブセットを使用にチェックを入れ、サンプルの最大値を2などの小さい数値に設定します。氷の厚さの平均と標準偏差を幅広く設定します(これらの値は、ターゲットにカーソルを合わせて測定します)。[ターゲット設定をテスト] をクリックして、上記の値に基づいてターゲットの選択をランダム化します。 すべての設定に満足したら、[ 再生]ボタンをクリックします 。レギノンは ステージZ_Focus を行い、最初のターゲットを回収します。セットアップ後の画像例を 補足図7に示します。 露出ターゲティングパラメータを設定します。穴(Hole)設定で、シェル スクリプト(Shell Script)を Ptolemy インストールのhl_finding.shスクリプト パスに設定します。受け入れる最小スコアを ≤0 に設定します。穴の半径を入力し(測定ツールを使用)、42ボタンをクリックして、真空領域(空の穴または壊れたサポートフィルム)の基準強度値を測定します。[テスト]をクリックして、穴のラティスを検出します。 取り込み設定で、取り込みターゲットのサブセットを使用(Use subset of the acquisition targets)にチェックを入れ、サンプルの最大値を 4 などの小さな数値に設定して、スクリーニング用の穴のサブセットで収集します。氷の厚さの平均と標準偏差を幅広く設定します(これらの値は、ターゲットにカーソルを合わせて測定します)。 すべての設定に満足したら、[ 再生]ボタンをクリックします 。Leginonはユーセントリックフォーカスを実行し、 露出 ノードで確認できる高倍率画像を収集します。セットアップ後の画像例を 補足図8に示します。 次のExposure_Targeting画像をチェックして、上記の設定がまだ十分かどうかを確認します。問題がなければ、露出のターゲット設定と穴のターゲット設定で、選択したターゲットのユーザー検証を許可するのチェックを外します。注: これで、現在のグリッドのスクリーニングが無人で実行されるはずです。このセッションは、すべてのグリッドのテンプレート セッションとして使用されます。 グリッドのスクリーニングが終了したら、[ファイル] > [終了 ] をクリックして Leginon を閉じます。 Smart Leginon Autoscreenの設定ターミナルウィンドウで、 Smart Leginon の autoscreen.py を実行します。 guiを選択し、画面にグリッドスロットのカンマ区切りリストを入力し、ワークフローにfullと入力し、新しいセッションのベースとなるテンプレートセッション名を入力し(これはAppion imageviewerにあります)、テンプレートセッションのz高さ値を入力します(補足図9)。 GUIが開き、各グリッドのセッション名 を入力し 、それぞれのプロジェクトの関連付け を選択できます (補足図10)。注:Smart Leginon Autoscreenは、テンプレートセッション設定を使用して、各グリッドを自動的にスクリーニングし、無人でグリッドを切り替えます。 Leginon、Appion、および顕微鏡コンピュータで収集中に従うか、顕微鏡を完全に無人のままにします。注:すべてのグリッドがスクリーニングされると、Smart Leginonは顕微鏡のカラムバルブを閉じます。

Representative Results

プロトコルに従って、クライオ電子顕微鏡スクリーニングセッションは、穴の開いたグリッドと条件の大部分(80%-90%)に対して自動的かつ正常に実行できます。Smart Leginon Autoscreenセッションの成功の期待される結果を実証するために、以前にいくつかの例と実験が提示されています8,9。成功したオートスクリーンセッションは、セットアップの~10分から始まり、通常、約6時間(グリッドあたり30分)後に自動的にスクリーニングされる12グリッドのフルカセットで、異なるサイズの3〜5個の正方形と正方形あたり3〜5個の穴が高倍率で画像化され、ユーザーは各グリッド上のサンプルの特性をすばやく決定し、サンプル/グリッド条件を迅速に反復できます(図3).時折、セッションが失敗することがありますが、その原因は、壊れた正方形をターゲットにした自動スクリーニング、グリッド全体または正方形全体の大きな氷の厚さの勾配を適切に解釈しない、またはカーボングリッド上の穴を適切に識別できないことです。さらに、メモリリークが発生すると、メモリ使用量が多すぎるためにLeginonがクラッシュする可能性がありますが、これはRAMを解放するか、コンピュータを再起動するか、コンピュータにRAMを追加することで改善できます。 図1:Smart Leginon AutoscreenのワークフローSmart Leginon Autoscreenワークフローの概要。まず、スクリーニングするグリッドのバッチ内の代表的なグリッドのパラメータを選択することにより、テンプレートセッションが作成されます。Leginonのセットアップとテンプレートセッションの作成には45分もかかりません。第 2 に、自動スクリーンは、テンプレート・セッション・パラメーターを使用してカセット内のすべてのグリッドをスクリーニングするように設定されています。自動スクリーンの設定には10分もかかりません。最後に、自動スクリーンはスクリーニングセッションを終了します。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図2: 自動スクリーニング前の従来の単粒子クライオ電子顕微鏡パイプライン。自動スクリーニング前の従来の単粒子クライオ電子顕微鏡パイプラインの最も一般的なステップと、改善可能な成分。各ステップは、そのステップが他のステップと比較してどの程度のボトルネックであるかを概算するために色分けされています。青い円形の矢印は、ほとんどのステップ間のいくつかのフィードバック ループを表します。いくつかのステップでのスループットは、サンプル、資金、および研究者の所在地に大きく依存します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図3:Smart Leginon Autoscreenの代表的な結果。BioQuantumエネルギーフィルターとK3カメラを備えたTFS KriosクライオTEMで収集されたSmart Leginon Autoscreenプロトコルに従った代表的なマルチスケール画像。(A)クライオ電子顕微鏡グリッドの概要を示す合成「アトラス」画像。(B-F)グリッドアトラス内の指定された位置からのマルチスケール画像。1列目の低倍率画像、2列目の中倍率画像、3列目の高倍率画像をそれぞれ自動的に選択し、薄い氷の正方形から厚い氷の正方形まで試料に関する情報を得た。レギノンが推定した氷の厚さは底面に示されています。スケールバーは、(A)が500μm、1列目が10μm、2列目が5μm、3列目(B-F)が100nmです。この図は、Cheng et al.8の許可を得て変更されています。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 gr: グリッド sq: 正方形 hln: 穴 ファン:オートフォーカス fcn:セントラルフォーカス enn: 露出  拡大 210 2600 6700 120000 120000 120000 デフォーカス -0.0002 -0.00015 -0.00015 -2×10-06  -7×10-07  △2.5×10-06  スポットサイズ 5 5 4 2 2 2 強度 1.1 0.83 0.65 0.44 0.44 0.45 次元  1024×1024 1024×1024 1024×1024 1024×1024 1024×1024 4096×4096 相殺 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0 512, 512 0, 0 ビニング 4×4 4×4 4×4 4×4 2×2 1×1 露光時間(ms) 200 500 500 500 500 1000 曝露前 0 0 0 0 0 0 線量 (e/Å2) — — — 36.5 36.5 64.7 生のフレームを保存 いいえ いいえ いいえ いいえ いいえ はい 表1:Simons Electron Microscopy Center(SEMC)で、Falcon 3ECカメラを搭載したGlaciosクライオTEMを使用したクライオ電子顕微鏡グリッドスクリーニングのプリセットパラメータ。 SEMCのFalcon 3ECカメラを搭載したGlaciosクライオTEMで一般的に使用される各プリセットのパラメータを示します。顕微鏡が異なれば、利用できる倍率も異なり、実験によって、焦点ぼけや露光時間などのパラメータも異なります。 gr: グリッド sq: 正方形 hln: 穴 ファン:オートフォーカス fcn:セントラルフォーカス enn: 露出  拡大 64 1700 2850 75000 75000 75000 デフォーカス 0 -5×10-05  -5×10-05  -1×10-06 -7×10-07 -2×10-06  スポットサイズ 6 9 9 6 6 7 強度 0.001 1.65×10-05  1.5×10-05  4.3×10-07  4.3×10-07  5.5×10-07  エネルギーフィルター幅 — — — 20 20 20 次元 1024×1024 1024×1024 1024×1024 1024×1024 2048×2048 4096×4096 相殺 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0 ビニング  4×4 4×4 4×4 4×4 2×2 1×1 露光時間(ms) 500 2000 1000 500 300 8700 曝露前 0 0 0 0 0 0 線量 (e/Å2) — — — — — 47.4 生のフレームを保存 いいえ いいえ いいえ いいえ いいえ はい 表2:Selectris XおよびFalcon 4iカメラを搭載したKriosクライオTEMを使用したSEMCでのクライオ電子顕微鏡グリッドスクリーニングのプリセットパラメータ。 SEMCのSelectris XエネルギーフィルターとFalcon 4iカメラを搭載したKriosで一般的に使用される各プリセットのパラメーターを示します。顕微鏡が異なれば、利用できる倍率も異なり、実験によって、焦点ぼけや露光時間などのパラメータも異なります。 gr: グリッド sq: 正方形 hln: 穴 ファン:オートフォーカス fcn:セントラルフォーカス enn: 露出  拡大 1550 940 2250 81000 81000 81000 デフォーカス 0 -5×10-05  -5×10-05  -1×10-06 -7×10-07 -2×10-06  スポットサイズ 4 8 7 6 6 6 強度 0.0015 0.00017 7.3×10-05  1.3×10-06  1.3×10-06  9.2×10-07  エネルギーフィルター幅 — — 50 20 20 20 次元 1024×1024 1440×1024 1440×1024 1440×1024 1008×1008 5760×4092 相殺  0, 0 0, 0 0, 0 0, 0 936, 519 0, 0 ビニング 4×4 8×8 8×8 8×8 4×4 2×2 露光時間(ms) 250 600 600 500 500 2100 曝露前 0 0 0 0 0 0 線量 (e/Å2) — — — — — 51 生のフレームを保存 いいえ いいえ いいえ いいえ いいえ はい 表3:BioQuantumおよびK3カメラを搭載したKriosクライオTEMを使用したSEMCでのクライオ電子顕微鏡グリッドスクリーニングのプリセットパラメータ。 SEMCのBioQuantumエネルギーフィルターとK3カメラを備えたKriosで一般的に使用される各プリセットのパラメーターが示されています。顕微鏡が異なれば、利用できる倍率も異なり、実験によって、焦点ぼけや露光時間などのパラメータも異なります。 補足図1:Smart Leginonのスクエアターゲティング設定とスクエア設定 (A)スクエア ターゲティング設定。(B)正方形の設定。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図2:Smart Leginonの穴ターゲット設定と穴設定。 (A)穴のターゲット設定。(B)穴の設定。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図3:Smart Leginonの露出ターゲティング設定と露出設定 (A)露出のターゲット設定。(B)露出設定。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図4:Smart Leginonのフォーカス設定とフォーカスシーケンス設定 (A)フォーカス設定。(B)フォーカスシーケンス設定(デフォーカス1)。(C)フォーカスシーケンス設定(デフォーカス2)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図5:Smart LeginonのZ_Focus設定とZ_Focusシーケンス設定 (A)Z_Focus設定。(B)Z_Focusシーケンス設定(Stage_Tilt_Rough)。(C)Z_Focusシーケンス設定(Stage_Tilt_Fine)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図6:Smart Leginon Square_Targetingパラメータを設定した後のアトラスの例。 青い円はブロブ、緑のプラス記号は取得場所、茶色の「x」は現在のステージ位置です。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図7:Smart Leginon Hole_Targetingパラメータを設定した後のアトラスの例。 紫色のプラス記号は格子の位置、ボックス付きの緑色のプラス記号は取得位置、青色のプラス記号はフォーカス位置です。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図8:Smart Leginon Exposure_Targetingパラメータを設定した後のアトラスの例。 青色の円はブロブ、緑色のプラス記号は取得位置、青色のプラス記号はフォーカス位置です。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図9:Smart Leginon Autoscreen端末のセットアップこのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図10:Smart Leginon AutoscreenのGUI設定このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

このプロトコルでは、Smart Leginon Autoscreenのパイプラインと、収集ソフトウェアを初めて使用する人のための基本的なLeginonの使用法について説明します。単粒子クライオ電子顕微鏡は、2024年末までに最も生産性の高い3次元(3D)タンパク質構造分解技術になる態勢を整えています17。単粒子クライオ電子顕微鏡パイプラインは、データ品質とスループットを向上させるために常に最適化されているいくつかのステップで構成されています。 図 2 は、最も一般的なステップ(サンプル調製、グリッド調製、スクリーニング時間と労力、高分解能収集時間、ライブ処理、完全な後処理)と、改善可能なパイプラインのその他のコンポーネント(スクリーニング顕微鏡へのアクセス、ステージの速度と精度、カメラの速度、高解像度顕微鏡へのアクセス)を示しています。ほとんどのステップの結果は、前のステップへのフィードバックループになり( 図2の青い矢印)、パイプライン全体が高度に相互依存します。 図 2 の各ステップは、他のステップと比較してボトルネックの程度を概算するために色分けされています。Smart Leginon Autoscreenは、12グリッドのスクリーニングにかかるオペレーターの時間と労力を6時間から10分未満に大幅に削減し、ボトルネックを解消し、サンプル/グリッド調製へのフィードバックをより迅速に行うことができます(図3)。

プロトコルには、 図1に示すいくつかの重要なステップがあります。テンプレート・セッションの作成に使用されるグリッドは、スクリーニングされる残りのグリッドを代表するものであることが重要です。重要なのは、Leginonはテンプレートセッションを作成するためのセットアッププロセス全体のすべての設定を記憶しているため( 図1の青いステップ)、繰り返しのテンプレートセッションを毎回より迅速にセットアップできることです。テンプレートセッションを作成する際の最も重要なステップは、すべての倍率でターゲット設定を行い、パラメーターとしきい値がスクリーニング対象のグリッド間で予想される変動を反映するようにすることです。さまざまな「テスト」ボタンにより、このセットアッププロセスを効率化できます。オートスクリーンセッション中は、Appionの最初の数グリッドを監視して、問題を迅速に検出し、Leginon 内でできるだけ早く修正することが重要です。

SEMCの典型的なワークフローは、オートスクリーニングデータをCryoSPARC Live18 に供給し、この追加情報を使用して、サンプル/グリッド調製へのフィードバックループを通知することです。研究者とオペレーターが集中的にクライオ電子顕微鏡を最適化する日には、サンプルとグリッドの状態に関する情報がサンプルとグリッドの調製にフィードバックされますが、Autoscreenはグリッドをスクリーニングしています。これにより、週に数十のグリッドを凍結してスクリーニングすることができます8。

Smart Leginon Autoscreenは、SEMCで観察される穴の開いたグリッドと条件の大部分(80%-90%)で機能します。残りの10%〜20%のグリッドには、穴と基板のコントラスト差が最小のグリッドなど、うまく機能しないグリッドが含まれます。穴や間隔が小さいグリッド(例:0.6/0.8)や、複数のグリッドをターゲットにすることが現実的でないグリッド – Spotiton/Chameleon グリッドを横切るサンプルの縞模様で構成される19,20グリッド。レイシーグリッド。自動スクリーンを使用した傾斜グリッドコレクションは開発中ですが、まだ利用できません。最初にストライプの領域を手動でイメージングして狭いパラメータしきい値を決定し、次にステップ2.1.7.4でそれぞれ大きな正方形と小さな正方形をグループ化し、次にiceのグループからターゲットを選択することで、Spotiton/Chameleonグリッドで動作するようにプロトコルを変更できる場合があります。この変更の目的は、Smart Leginon で空の正方形と空でない正方形を 2 つのグループに分離することです。パラメータが見つかった場合、スクリーニングされる残りのグリッドにうまく拡張されない可能性があります。また、手順2.1.9.1でhl_finding.shスクリプトを削除し、必要に応じて明るい/暗い領域をターゲットにするようにパラメータを設定することで、レイシーグリッドで動作するようにプロトコルを変更することもできます。この修正の成功率は、氷の厚さとグリッド材料に基づいてグリッドごとに異なる場合があります。

自動スクリーニングセッション中のトラブルシューティングは可能であり、適切な場合もあります。プリセット(デフォーカスなど)とターゲットパラメータ(穴ターゲットしきい値など)の変更は、自動収集中に行うことができます。自動スクリーン・セッションの収集中は、グリッド・セッションは autoscreen.py 終了するため、キャンセルできません。ただし、ターゲットノードの「中止」ボタンを使用して、グリッドの一部または全体をスキップできます。時折、autoscreen.py メモリを使いすぎてフリーズすることがあり、「強制終了」または「待機」の2つのオプションが提供されます。「強制終了」を選択すると、スクリプト全体が終了し、ユーザーはスクリプトを再実行して残りのグリッドに適用してスクリーニングを行う必要があります。’wait’ が選択されている場合、スクリプトは続行され、Exposure ノードで画像表示をオフにしたり、アトラスでピクセルサイズを小さくしたり、メモリクリアスクリプトを実行したりするなど、将来のフリーズを防ぐために設定を変更することができます。2つのオプションを提示せずにプログラムがフリーズすると、メモリエラーが自然に解決されず、集録が一時停止する可能性があります。この場合、「強制終了」オプションが役立つ場合があります。

Smart Leginon Autoscreenは、SEMCで定期的に使用されています。単粒子クライオ電子顕微鏡パイプラインのボトルネックが減り続けるにつれて、クライオ電子顕微鏡の採用は生物学的な疑問に答えるために増加し続けるでしょう。このプロトコルは、フィードバックループを大幅に削減するための明確なパスを提供することにより、パイプライン全体を最適化する方向への一歩です。

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究の一部は、サイモンズ財団(SF349247)、NIH(U24 GM129539)、およびニューヨーク州議会の支援を受けて、ニューヨーク構造生物学センターのサイモンズ電子顕微鏡センターで実施されました。

Materials

Glacios cryoTEM  Thermo Fisher Scientific  GLACIOSTEM FEG, 200 keV, Falcon 3EC camera 
Krios cryoTEM  Thermo Fisher Scientific  KRIOSG4TEM XFEG, 300 keV, Gatan BioQuantum energy filter, Gatan K3 camera 
Leginon  Simons Electron Microscopy Center  http://leginon.org 
Ptolemy  Simons Machine Learning Center  https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy 
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Sawh-Gopal, A., Ishemgulova, A., Chua, E. Y. D., Aragon, M. F., Mendez, J. H., Eng, E. T., Noble, A. J. Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon. J. Vis. Exp. (202), e66007, doi:10.3791/66007 (2023).
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