Практическое руководство по почти непрерывной эволюции с помощью фагов и робототехники
Summary
Почти непрерывная эволюция с помощью фагов и роботов (PRANCE) — это метод быстрой и устойчивой эволюции белков. Робототехника позволяет распараллеливать эксперименты, осуществлять мониторинг в режиме реального времени и управлять обратной связью.
Abstract
Методы эволюции с ускорением робототехники повышают надежность и скорость эволюции с помощью управления обратной связью, улучшая результаты экспериментов по эволюции белков и организмов. В этой статье мы представляем руководство по настройке аппаратного и программного обеспечения, необходимого для реализации почти непрерывной эволюции с помощью фагов и робототехники (PRANCE). PRANCE сочетает в себе быструю молекулярную эволюцию на основе фагов с возможностью одновременного проведения сотен независимых эволюционных экспериментов с обратной связью. В этом документе будут описаны требования к аппаратному обеспечению и настройка PRANCE, включая прибор для работы с жидкостями, считыватель пластин, вспомогательные насосы, нагреватели и контейнеры, напечатанные на 3D-принтере. Мы опишем, как настроить робота для работы с жидкостями так, чтобы он был совместим с программным обеспечением с открытым исходным кодом на основе Python. Наконец, мы даем предложения по первым двум экспериментам, которые могут быть проведены с помощью недавно построенной системы PRANCE, которая использует свои возможности и подтверждает, что система готова к мультиплексной эволюции. Это руководство предназначено для того, чтобы служить настольной книгой для навигации по значительной настройке оборудования, связанной с проведением ускоренной эволюции робототехники.
Introduction
PRANCE представляет собой комбинацию двух мощных методов направленной эволюции. Во-первых, это PACE1, молекулярный метод, который связывает раунды диверсификации и отбора генов с быстрым жизненным циклом бактериофага M13, позволяя непрерывно происходить быстрым циклам эволюции в культуре жидких фагов. Этот отбор обусловлен использованием генной цепи, кодируемой плазмидой, которая связывает функцию эволюционирующего белка с экспрессией pIII, белка хвостового покрова M13, который необходим для размножения фагов, это проиллюстрировано на рисунке 1. На экспериментальном уровне непрерывное разведение жидкой фаговой культуры позволяет проводить непрерывную селекцию. Таким образом, строгость отбора может быть скорректирована как на уровне генной цепи, так и на экспериментальном уровне, контролируя скорость разведения фаговой культуры. Таким образом, PACE может быть применен к любой задаче биомолекулярной инженерии, для которой существует молекулярный сенсор, способный обнаруживать желаемую активность бактерий E. coli для индуцирования экспрессии pIII. Области применения включают эволюцию связывания белкас белком 2,3,4, связывания белка с ДНК5, растворимости белка6 и многочисленных специфических ферментативных функций7. Во-вторых, это Robotics-accelerated Evolution 8,9, которая использует контроллер обратной связи для устранения двух распространенных видов сбоев направленной эволюции: вымирания, которое происходит, когда окружающая среда слишком строга, и отсутствия эволюции, которое происходит, когда окружающая среда слишком мягкая. В отличие от серийного пассажа фага, как это делается в PANCE (Phage-assisted Non-continuous Evolution)7,10, «почти непрерывная» эволюция с ускорением робототехники включает в себя быстрое пипетирование, которое поддерживает культуры в средней логарифмической фазе, позволяя популяциям испытывать непрерывные циклы инфекции и размножения. Когда эти две технологии используются вместе, они называются PRANCE, что означает «почти непрерывная эволюция8 с помощью фагов и робототехники», которая обеспечивает надежную, мультиплексированную и быструю непрерывную эволюцию. PRANCE используется для эволюции полимераз, тРНК и аминоацил-тРНК-синтетаз, а также для управления обратной связью во время этих эволюций с целью повышения их скорости и надежности8.
Существует несколько деталей аппаратной и программной настройки PRANCE, которые позволяют использовать бактериофаг на роботе для работы с жидкостями. Вместо использования программного обеспечения по умолчанию, предоставляемого производителем робота, мы используем программный пакет с открытым исходным кодом на основе Python11, который обеспечивает быстрое, параллельное выполнение и, таким образом, возможность поддерживать полунепрерывные биореакторы в середине логарифмической фазы. Время невмешательства исследователя может быть увеличено до нескольких дней, если несколько компонентов на палубе регулярно проходят самостерилизацию, и это достигается автоматическим управлением насосами, которые могут отбеливать и промывать эти компоненты. Перекрестное загрязнение фагами может быть устранено с помощью робота для работы с жидкостями, который не использует наконечники с принудительной посадкой и тщательной регулировкой параметров работы с жидкостью.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несмотря на усилия по стандартизации оборудования, с практической точки зрения, каждая конфигурация PRANCE будет отличаться из-за изменений в поставках оборудования, аппаратном обеспечении и версиях программного обеспечения. В результате, каждая конфигурация PRANCE имеет уникальные проблемы с настройкой, требующие всестороннего понимания назначения каждого компонента для эффективного модульного поиска и устранения неисправностей.
Этот метод описывает пошаговый протокол настройки и тестирования установленной системы PRANCE. Сначала мы сосредоточимся на критических элементах аппаратного и программного обеспечения, а затем подробно опишем основные шаги по подготовке и проведению серии тестовых запусков, которые определят, что система готова к PRANCE.
Существенной особенностью аппаратного обеспечения является оптимизация для снижения риска перекрестного загрязнения образцов при мультиплексированных экспериментах с использованием бактериофагов. Рекомендуется использовать исключительно фильтрованные наконечники с технологией роботизированных наконечников, которая совместима с повторным использованием наконечников и, как считается, сводит к минимуму аэрозоли, образующиеся при выбросе наконечника, избегая принудительной посадки наконечников. Надежная промывка наконечников в соответствии с этим протоколом допускает повторное использование наконечников, хотя адекватность этого должна быть подтверждена в рамках теста на заражение каждой системы. Самостерилизация также зависит от постоянной подачи воды и отбеливателя в систему. Они хранятся в резервуарах/ведрах, и если они истощаются, это приведет к нарушению самостерилизации и быстрому перекрестному загрязнению. Можно сделать фотографии резервуаров/ведер, сделанные до и после запуска программы, чтобы оценить скорость, с которой моечное оборудование потребляет воду и отбеливатель при определенной настройке насоса.
Еще одним ключевым элементом системы является поддержание фазы роста бактерий и температуры. Эксперименты PRANCE проводятся с использованием штамма бактерий E. coli S2060 (Addgene: #105064). Это штамм, содержащий F-плазмиду на основе K12, оптимизированный для уменьшения биопленок7. Кроме того, F-плазмида в этом штамме была отредактирована с добавлением кассеты резистентности к тетрациклину для поддержания плазмиды, luxCDE и luxR в дополнение к luxAB-опосредованному мониторингу люминесценции, а также lacZ под промотором фагового шока, чтобы обеспечить колориметрическую визуализацию бляшек. F-пилус, кодируемый F-плазмидой, необходим для фаговой инфекции M13. Таким образом, бактерии, используемые в PACE, должны культивироваться при 37 °C и в середине логарифмической фазы, когда экспрессируется F-pilus12 и возможно заражение, размножение и эволюция фагами M13. Для статического регулирования температуры можно использовать готовый плитонос с подогревом. Альтернативой является простой нагрев воздуха, поступающего в фильтр HEPA, с помощью недорогих нагревателей, хотя это не рекомендуется, так как это может привести к ускоренному износу оборудования. Кроме того, это ускоряет испарение вспомогательных жидкостей на палубе, таких как ведра для отбеливателя/воды и индуктор при использовании.
Калибровка пакетов программного обеспечения также важна для правильного функционирования системы. Расхождения между компоновкой программной платформы и фактической декой робота являются наиболее распространенной причиной сбоев системы во время работы. Регулярная калибровка вспомогательных насосов, которые подают бактериальные культуры, отбеливают и сливают в систему, имеет жизненно важное значение, поскольку использование перистальтических насосов может привести к износу трубок и изменению объема жидкости.
Тест на прогон воды быстро выявит ряд распространенных проблем с настройкой, включая неправильные настройки работы с жидкостями, утечки жидкости/неисправные соединения и нестабильность программного обеспечения. Успешный прогон воды не покажет неожиданных утечек жидкости и будет работать стабильно без ошибок в течение ночи. Существует ряд распространенных проблем, которые могут возникнуть во время прогона водой, такие как невыполнение определенных этапов работы с жидкостью, капание из пипеток и остановка протокола в середине прогона. В случае невыполнения определенных действий по работе с жидкостями убедитесь, что установлены все классы жидкостей. В них указаны соответствующие скорости вязкости и пипетирования, которые настраиваются в программном обеспечении для управления роботом, предоставляемом производителем. Если пипетки капают, важно, чтобы роботизированный манипулятор был настроен правильно, чтобы обеспечить чистое пипетирование и исключить перекрестное загрязнение фагами. Для успешного роботизированного пипетирования требуется, помимо правильных классов жидкостей, правильная высота расположения деки всего лабораторного оборудования и соответствующие смещения высоты пипетирования, указанные в программе метода робота PRANCE. Эти смещения высоты могут потребовать прямой регулировки. Если протокол останавливается на полпути, часто это будет вызвано широким спектром ошибок, которые указывают на то, что файл макета колоды может не соответствовать фактической конфигурации колоды.
Тест только на бактерии выявит проблемы с настройками считывателя пластин и визуализацией данных в режиме реального времени, проблемы с чрезмерной концентрацией отбеливателя или недостаточным ополаскиванием, а также стабильностью температуры. Успешный прогон только с бактериями будет демонстрировать равновесие поглощения лагуны в течение первых трех циклов, за которым последует стабильная абсорбция в течение всего прогона. Кроме того, он может выявить несколько распространенных проблем. Это первый шаг, на котором наносятся данные, сгенерированные считывателем пластин. Данные в базе данных считывателя пластин могут быть неправильно сохранены или неправильно отображены на графике. Если бактерии не могут уравновесить свою абсорбцию, это может указывать на то, что концентрация отбеливателя слишком высока. Чрезмерное количество отбеливателя или недостаточное мытье может стерилизовать весь эксперимент, а не только лабораторную посуду. При подозрении на это можно использовать полоски для обнаружения отбеливателя для проверки лагуны. Стабильность температуры культуры можно проверить с помощью термометрического пистолета.
Успешный тест на заражение указывает на то, что система готова к запуску PRANCE. Тест на инфекцию может быть проведен путем инокуляции подгруппы лагун, содержащих бактериальную культуру. Эти бактерии будут экспрессировать pIII при заражении соответствующим фагом, у которого отсутствует ген pIII (ΔgIII), что позволяет размножаться фагам. Одной из возможных комбинаций для тестирования является использование бактерий S2060, трансформированных плазмидой, экспрессирующей pIII, под промотором фагового шока с любым фагом ΔgIII. Мы рекомендуем использовать фаг ΔgIII, несущий РНК-полимеразу Т7 дикого типа, с бактериями S2060, трансформированными с помощью дополнительной плазмиды, в которой pIII и luxAB управляются промотором Т7 (плазмидой pJC173b13), как показано на рисунке 1. Это также позволяет контролировать инфекцию с помощью считывателя пластин во время тестового запуска. Окончательным доказательством успешности теста на инфекцию и отсутствия перекрестного загрязнения будет титрование фагов тестовых и контрольных лагун. При использовании репортера люциферазы увеличение люминесценции только в тестовых лунках, как показано на рисунке 3, также является показателем успешной фаговой инфекции и размножения. Золотым стандартом количественного определения титра фагов является анализ бляшек7. Существует также протокол количественного определения М13 с помощью кПЦР7 , который может быть более быстрым, хотя он не делает различий между инфекционными и неинфекционными фаговыми частицами и, таким образом, может завышать титры.
Основная программа ссылается на файл манифеста, это обычный текстовый файл базы данных, который диктует объем разведения за цикл каждой размножающейся культуры, а также выбор любого количества потенциального сырья для бактериальной культуры, которое может отличаться строгостью отбора. Таким образом, файл манифеста определяет многие параметры выполнения PRANCE. Следует отметить, что этот файл может быть отредактирован во время работы как оператором, так и системой, что означает, что может быть осуществлено ручное или автоматическое управление с обратной связью.
Полезность полностью функционирующей системы PRANCE заключается в ее способности быстро эволюционировать большие популяции в тщательно контролируемой и контролируемой среде. Формат на основе пластин отличает PRANCE от других методов, таких как использование небольших готовых систем на основе турбидостата14,15. Установка на основе планшета не только облегчает интеграцию с дополнительными роботизированными этапами обработки, но и совместима с другими лабораторными приборами, такими как центрифуги. Более того, возможность проводить ускоренную эволюцию одновременно в нескольких экземплярах привносит в эксперимент дополнительное измерение, повышая перспективу получения разнообразных и надежных результатов. Детальная система управления и обратной связи, неотъемлемая часть PRANCE, еще больше повышает предсказуемость и надежность эксперимента, отмечая значительный прогресс в области методов направленной эволюции. Однако этот метод ограничен в количестве параллельных экспериментов, которые он может проводить. В зависимости от конфигурации настройки PRANCE обычно ограничены либо скоростью роботизированного дозатора, либо доступным пространством на деке.
То же самое аппаратное и программное обеспечение, используемое для PRANCE, может быть применено и к методам эволюции, не использующим бактериофаг. Как было продемонстрировано в методе11 многих турбин, этот же инструмент может быть использован исключительно для бактерий, что позволяет проводить эксперименты по адаптивной эволюции всего генома. Эта адаптивность расширяет область применения этого инструмента, прокладывая путь для новых форм эволюции с ускорением робототехники.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Благодарим Эмму Чори и Кевина Эсвельта за помощь и советы по настройке аппаратного и программного обеспечения. Самир Ауджан, Осаид Атер и Эрика ДеБенедиктис получают грант Steel Perlot Early Investigator Grant. Эта работа была поддержана Институтом Фрэнсиса Крика, который получает основное финансирование от Cancer Research UK (CC2239), Совета по медицинским исследованиям Великобритании (CC2239) и Wellcome Trust (CC2239).
Materials
| 3D printed bacterial reservoir "waffle" | – | – | https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view; For Robot deck |
| 3D printer | FormLabs | Form 3B+ | 3D printer components |
| 3D printer resin (clear) | FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | consumable for 3D printer |
| 8-1,000 µL head | Hamilton | 10140943 | For Liquid handling robot |
| 96-1,000 µL pipetting head | Hamilton | 10120001 | For Liquid handling robot |
| Black polystyrene plate reader microplates | Millipore Sigma | CLS3603 | For Robot deck |
| BMG Labtech Spectrostar FLuorstar Omega | BMG Labtech | 10086700 | For Liquid handling robot |
| Cleaning solution | Fluorochem Limited | F545154-1L | used to clean the liquid handling parts of the robot |
| Deep Well plates | Appleton Woods | ACP006 | these are used to contain evolving bacteria on the deck of the robot |
| encolsure heater | Stego | 13060.0-01 | heats inside robot enclosure |
| Hamilton STAR | Hamilton | 870101 | For Liquid handling robot |
| Heater | Erbauer | BGP2108-25 | For Liquid handling robot |
| HIG Bionex centrifuge | Hamilton | 10086700 | For Liquid handling robot |
| iSWAP plate gripper | Hamilton | 190220 | For Liquid handling robot |
| laboratory tubing | Merck | Z280356 | to construct liquid handling manifold |
| luer to barb connector | AIEX | B13193/B13246 | for connectorizing tubing |
| Magnetic stir plate | Camlab | SKU – 1189930 | For Auxiliary Fridge |
| Molcular pipetting arm | Hamilton | 173051 | For Liquid handling robot |
| Omega | BMG labtech | 5.7 | plate reader control software |
| One way Check Valves | Masterflex | MFLX30505-91 | to one way sections of liquid handling manifold |
| pyhamilton | MIT/Open source | https://github.com/dgretton/std-96-pace%20PRANCE | open source python robot control software |
| pymodbus | opensource | 3.5.2 | python pump software interface |
| Refrigetator | Tefcold | FSC175H | allows cooled bacteria to be used instead of turbidostat |
| S2060 Bacterial strain | Addgene | Addgene: #105064 | E. coli |
| temperature controller | Digiten | DTC102UK | Used to control heaters thermostatically |
| Thermostat switch controller | WILLHI | WH1436A | WILLHI WH1436A 10 A Temperature Controller 110 V Digital Thermostat Switch Sous Vide Controller NTC 10K Sensor Improved Version; for Liquid handling robot |
| Venus | Hamilton | 4.6 | proprietary robot control software |
| Wash Station for MPH 96/384 | Hamilton | 190248 | For Liquid handling robot |
| Suggested pump manufacturers | |||
| Company | Catalog number | Notes | Documentation |
| Agrowtek | AD6i Hexa Pump | https://www.agrowtek.com/doc/im/IM_ADi.pdf | |
| Amazon | INTLLAB 12V DC | ||
| Cole-Parmer | EW-07522-3 | Masterflex L/S Digital Drive, 100 RPM, 115/230 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
| Cole-Parmer | EW-07554-80 | Masterflex L/S Economy variable-speed drive, 7 to 200 rpm, 115 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
References
- Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472, 499-503 (2011).
- Pu, J., Zinkus-Boltz, J., Dickinson, B. C. Evolution of a split RNA polymerase as a versatile biosensor platform. Nat Chem Biol. 13 (4), 432-438 (2017).
- Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA polymerase biosensors. Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).
- Xie, V. C., Styles, M. J., Dickinson, B. C. Methods for the directed evolution of biomolecular interactions. Trends Biochem Sci. 47 (5), 403-416 (2022).
- Popa, S. C., Inamoto, I., Thuronyi, B. W., Shin, J. A. Phage-assisted continuous evolution (PACE): A guide focused on evolving protein-DNA interactions. ACS Omega. 5 (42), 26957-26966 (2020).
- Wang, T., Badran, A. H., Huang, T. P., Liu, D. R. Continuous directed evolution of proteins with improved soluble expression. Nat Chem Biol. 14 (10), 972-980 (2018).
- Miller, S. M., Wang, T., Liu, D. R. Phage-assisted continuous and non-continuous evolution. Nat Protoc. 15 (12), 4101-4127 (2020).
- DeBenedictis, E. A., et al. Systematic molecular evolution enables robust biomolecule discovery. Nat Methods. 19 (1), 55-64 (2022).
- Zhong, Z., et al. Automated continuous evolution of proteins in vivo. ACS Synth Biol. 9 (6), 1270-1276 (2020).
- Roth, T. B., Woolston, B. M., Stephanopoulos, G., Liu, D. R. Phage-assisted evolution of Bacillus methanolicus methanol dehydrogenase 2. ACS Synth Biol. 8 (4), 796-806 (2019).
- Chory, E. J., Gretton, D. W., DeBenedictis, E. A. Enabling high-throughput biology with flexible open-source automation. Mol Syst Biol. 17 (3), 9942 (2021).
- Novotny, C. P., Lavin, K. Some effects of temperature on the growth of F pili. J Bacteriol. 107 (3), 671-682 (1971).
- Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution. Nat Chem Biol. 10 (3), 216-222 (2014).
- Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. In situ characterization and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLOS Biology. 18 (7), e3000794 (2020).
- Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nat Biotechnol. 36 (7), 614-623 (2018).
