Una guida pratica all'evoluzione quasi continua assistita da fagi e robotica
Summary
L’evoluzione quasi continua assistita da fagi e robotica (PRANCE) è una tecnica per l’evoluzione rapida e robusta delle proteine. La robotica consente la parallelizzazione degli esperimenti, il monitoraggio in tempo reale e il controllo del feedback.
Abstract
Le tecniche di evoluzione accelerata dalla robotica migliorano l’affidabilità e la velocità dell’evoluzione utilizzando il controllo del feedback, migliorando i risultati degli esperimenti di evoluzione delle proteine e degli organismi. In questo articolo, presentiamo una guida alla configurazione dell’hardware e del software necessari per implementare l’evoluzione quasi continua assistita da fagi e robotica (PRANCE). PRANCE combina una rapida evoluzione molecolare basata sui fagi con la capacità di eseguire simultaneamente centinaia di esperimenti di evoluzione indipendenti e controllati dal feedback. Questo documento descriverà i requisiti hardware e la configurazione di PRANCE, tra cui uno strumento per la gestione dei liquidi, un lettore di piastre, pompe ausiliarie, riscaldatori e contenitori stampati in 3D. Descriviamo come configurare il robot per la gestione dei liquidi in modo che sia compatibile con il software open source basato su Python. Infine, forniamo suggerimenti per i primi due esperimenti che possono essere condotti con un sistema PRANCE di nuova costruzione che esercita le sue capacità e convalida che il sistema è pronto per condurre un’evoluzione multiplexata. Questa guida ha lo scopo di fungere da manuale per orientarsi nella considerevole configurazione delle apparecchiature associate alla conduzione dell’evoluzione accelerata dalla robotica.
Introduction
PRANCE è una combinazione di due potenti tecniche di evoluzione diretta. La prima è PACE1, una tecnica molecolare che accoppia cicli di diversificazione e selezione genica al rapido ciclo di vita del batteriofago M13, consentendo cicli rapidi di evoluzione che si verificano continuamente in colture di fagi liquidi. Questa selezione è guidata dall’uso di un circuito genico codificato da plasmidi che accoppia la funzione della proteina in evoluzione all’espressione di pIII, la proteina del rivestimento della coda di M13, necessaria per la propagazione dei fagi, questo è illustrato nella Figura 1. A livello sperimentale, la diluizione continua della coltura fagica liquida consente una selezione continua. Il rigore selettivo può quindi essere modulato sia a livello del circuito genico che a livello sperimentale controllando la velocità di diluizione della coltura fagica. PACE può quindi essere applicato a qualsiasi sfida di ingegneria biomolecolare per la quale esiste un sensore molecolare in grado di rilevare l’attività desiderata nei batteri E. coli per indurre l’espressione di pIII. Le applicazioni includono l’evoluzione del legame proteina-proteina 2,3,4, del legame proteina-DNA 5, della solubilità proteica6 e di numerose funzioni enzimatiche specifiche7. Il secondo è Evolution 8,9, accelerato dalla robotica, che utilizza un controller di feedback per eliminare due comuni modalità di fallimento dell’evoluzione diretta: l’estinzione, che si verifica quando l’ambiente è troppo rigoroso, e la mancanza di evoluzione, che si verifica quando l’ambiente è troppo indulgente. A differenza del passaggio seriale dei fagi come avviene in PANCE (Phage-assisted Non-continuous Evolution)7,10, l’evoluzione “quasi continua” accelerata dalla robotica comporta un rapido pipettaggio che mantiene le colture a metà fase logaritmica, consentendo alle popolazioni di sperimentare cicli continui di infezione e propagazione. Quando queste due tecnologie vengono utilizzate insieme, vengono denominate PRANCE, acronimo di Phage and Robotics-assisted Near-continuous Evolution8, che consente un’evoluzione continua robusta, multiplexata e rapida. PRANCE è stato utilizzato per far evolvere polimerasi, tRNA e ammino-aciltRNA sintetasi e per effettuare il controllo del feedback durante tali evoluzioni per migliorarne la velocità e l’affidabilità8.
Ci sono diversi dettagli sulla configurazione hardware e software di PRANCE che consentono l’uso di batteriofagi su un robot per la manipolazione dei liquidi. Invece di utilizzare il software predefinito fornito dal produttore del robot, utilizziamo un pacchetto software open source basato su python11, che consente un’esecuzione rapida e simultanea e, quindi, la possibilità di mantenere i bioreattori semi-continui a metà fase logaritmica. Il tempo di assenza dei ricercatori può essere esteso a diversi giorni facendo in modo che diversi componenti sul ponte si autosterilizzino regolarmente, e questo si ottiene con il controllo automatico delle pompe in grado di candeggiare e risciacquare questi componenti. La contaminazione incrociata dei fagi può essere eliminata mediante l’uso di un robot per la manipolazione dei liquidi che non utilizza punte a montaggio forzato e un’attenta regolazione delle impostazioni di manipolazione dei liquidi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nonostante gli sforzi per standardizzare le apparecchiature, in pratica, ogni configurazione PRANCE sarà diversa a causa dei cambiamenti nella fornitura delle apparecchiature, nell’hardware e nel controllo delle versioni del software. Di conseguenza, ogni configurazione PRANCE presenta sfide di configurazione uniche, che richiedono una comprensione completa dello scopo di ciascun componente per un’efficace risoluzione dei problemi modulare.
Questo metodo delinea un protocollo passo-passo per l’installazione e il collaudo di un sistema PRANCE consolidato. Per prima cosa ci concentriamo sugli elementi critici dell’hardware e del software e poi dettagliamo i passaggi essenziali per preparare e condurre una serie di test, che stabiliscono che il sistema è pronto per PRANCE.
Una caratteristica essenziale dell’hardware è l’ottimizzazione per ridurre il rischio di contaminazione incrociata del campione durante gli esperimenti multiplexati che utilizzano batteriofagi. Si consiglia di utilizzare esclusivamente puntali filtrati con tecnologia robotizzata che è compatibile con il riutilizzo del puntale ed è pensata per ridurre al minimo gli aerosol prodotti durante l’espulsione del puntale evitando l’accoppiamento forzato dei puntali. Il lavaggio robusto dei puntali secondo questo protocollo consente il riutilizzo dei puntali, anche se l’adeguatezza di questo deve essere convalidata come parte del test di infezione su ciascun sistema. L’autosterilizzazione dipende anche da una fornitura costante di acqua e candeggina per il sistema. Questi sono conservati in serbatoi/secchi e, se esauriti, compromettono l’autosterilizzazione e la rapida contaminazione incrociata. È possibile scattare fotografie dei serbatoi/secchi prima e dopo l’esecuzione del programma per confrontare la velocità con cui l’attrezzatura di lavaggio consuma acqua e candeggina data una particolare configurazione della pompa.
Un altro elemento chiave del sistema è il mantenimento della fase di crescita batterica e della temperatura. Gli esperimenti PRANCE sono condotti utilizzando il ceppo batterico S2060 di E. coli (Addgene: #105064). Si tratta di un ceppo contenente plasmide F derivato da K12 ottimizzato per ridurre i biofilm7. Inoltre, il plasmide F in questo ceppo è stato modificato con l’aggiunta di una cassetta di resistenza alla tetraciclina per il mantenimento del plasmide, luxCDE e luxR per integrare il monitoraggio della luminescenza mediata da luxAB, nonché lacZ sotto il promotore di shock fagico per consentire la visualizzazione colorimetrica delle placche. L’F-pilus codificato dal plasmide F è necessario per l’infezione da fago M13. I batteri utilizzati in PACE devono quindi essere coltivati a 37 °C e a metà fase logaritmica, quando l’F-pilus12 è espresso e l’infezione, la propagazione e l’evoluzione del fago M13 sono possibili. Per la regolazione statica della temperatura, è possibile utilizzare un portapiastre riscaldato standard. Un’alternativa è semplicemente riscaldare l’aria che entra nel filtro HEPA utilizzando riscaldatori economici, anche se questo non è raccomandato in quanto potrebbe portare a un’usura accelerata dell’hardware. Inoltre, questo accelera l’evaporazione dei fluidi ausiliari sul ponte, come i secchi di candeggina/acqua e l’induttore, quando utilizzati.
Anche la calibrazione dei pacchetti software è essenziale per il corretto funzionamento del sistema. Le divergenze tra il layout del deck software e il deck del robot effettivo sono la causa più comune di guasto del sistema durante il funzionamento. La calibrazione regolare delle pompe ausiliarie che alimentano la coltura batterica, la candeggina e drenano il sistema è fondamentale poiché l’uso della pompa peristaltica può portare all’usura dei tubi e alle alterazioni del volume del fluido.
Il test di funzionamento dell’acqua rivelerà rapidamente una serie di problemi di configurazione comuni, tra cui impostazioni errate di gestione dei liquidi, perdite fluidiche/connessioni difettose e instabilità del software. Un flusso d’acqua di successo non mostrerà perdite di liquido impreviste e funzionerà in modo stabile senza errori durante la notte. Ci sono una serie di problemi comuni che possono sorgere durante un’esecuzione dell’acqua, come la mancata esecuzione di alcune fasi di gestione dei liquidi, il gocciolamento dalle pipette e l’arresto del protocollo a metà corsa. In caso di mancata esecuzione di alcune fasi di manipolazione dei liquidi, verificare che tutte le classi di liquidi siano state installate. Questi elencano la viscosità e le velocità di pipettaggio appropriate e vengono regolati nel software di controllo del robot fornito dal produttore. In caso di gocciolamento dalle pipette, è importante che le impostazioni del braccio di pipettaggio del robot siano corrette per consentire un pipettaggio pulito ed eliminare la contaminazione incrociata dei fagi. Il successo del pipettaggio robotico richiede, oltre alle corrette classi di liquidi, corrette altezze di layout del piano di tutto il materiale da laboratorio e offset appropriati dell’altezza di pipettaggio specificati nel programma del metodo robotico PRANCE. Questi offset di altezza possono richiedere una regolazione diretta. Se il protocollo si arresta a metà esecuzione, spesso questo sarà generato da un’ampia gamma di errori che indicano che il file di layout del deck potrebbe non corrispondere alla configurazione effettiva del deck.
Il test di esecuzione dei soli batteri rivelerà problemi con le impostazioni del lettore di piastre e la visualizzazione dei dati in tempo reale, problemi con un’eccessiva concentrazione di candeggina o un risciacquo insufficiente e stabilità della temperatura. Una corsa di soli batteri di successo mostrerà l’equilibrio dell’assorbanza lagunare nei primi tre cicli, seguita da un’assorbanza stabile per tutta la durata della corsa. Inoltre, potrebbe rivelare diversi problemi comuni. Questo è il primo passaggio in cui vengono tracciati i dati generati dal lettore di piastre. I dati nel database del lettore di lastre potrebbero non essere salvati correttamente o tracciati correttamente. Se i batteri non riescono a mantenere l’equilibrio nella loro assorbanza, ciò può indicare che la concentrazione di candeggina è troppo alta. Un’eccessiva candeggina o un lavaggio insufficiente possono sterilizzare l’intero esperimento, piuttosto che solo il pezzo di laboratorio. Se si sospetta questo, le strisce di rilevamento della candeggina possono essere utilizzate per testare la laguna. La stabilità della temperatura della coltura può essere verificata con una pistola termometrica.
Un test di infezione superato indica che il sistema è pronto per le esecuzioni di PRANCE. Un test di infezione può essere eseguito inoculando un sottoinsieme di lagune contenenti coltura batterica. Questi batteri esprimeranno pIII quando infettati dal fago appropriato che manca del gene per pIII (ΔgIII), consentendo la propagazione dei fagi. Una possibile combinazione per i test consiste nell’utilizzare batteri S2060 trasformati con un plasmide che esprime pIII sotto il promotore di shock fagico con qualsiasi fago ΔgIII. Si consiglia di utilizzare un fago ΔgIII portatore della RNA polimerasi T7 wild-type con batteri S2060 trasformati con un plasmide accessorio, in cui pIII e luxAB sono guidati dal promotore T7 (plasmide pJC173b13), come illustrato nella Figura 1. Ciò consente anche il monitoraggio dell’infezione mediato dal lettore di piastre durante l’esecuzione del test. La prova definitiva del successo del test di infezione e dell’assenza di contaminazione incrociata verrà dalla titolazione fagica delle lagune di test e controllo. Quando viene utilizzato un reporter luciferasi, un aumento della luminescenza solo nei pozzetti di prova, come si vede nella Figura 3, è anche un indicatore del successo dell’infezione e della propagazione dei fagi. Il gold standard per la quantificazione del titolo fagico è il test della placca7. Esiste anche un protocollo per la quantificazione di M13 mediante qPCR7 che può essere più veloce, anche se questo non discrimina tra particelle fagiche infettive e non infettive e quindi può sovrastimare i titoli.
Il programma principale fa riferimento a un file manifesto, questo è un file di database di testo normale, che determina il volume di diluizione per ciclo di ogni coltura di propagazione, nonché la selezione di un numero qualsiasi di potenziali materie prime per colture batteriche, che possono differire nel rigore di selezione. In questo modo, il file manifesto definisce molti dei parametri dell’esecuzione di PRANCE. Va notato che questo file può essere modificato durante la corsa sia dall’operatore che dal sistema, il che significa che è possibile effettuare un controllo manuale o automatico del feedback.
L’utilità di una configurazione PRANCE pienamente funzionante risiede nella sua capacità di far evolvere rapidamente grandi popolazioni in un ambiente attentamente monitorato e controllato. Il formato a piastre distingue PRANCE da altre tecniche, come l’utilizzo di sistemi più piccoli a base di turbidostati14,15. La configurazione basata su piastre non solo facilita la facile integrazione con ulteriori fasi di lavorazione robotica, ma anche la compatibilità con altri strumenti di laboratorio come le centrifughe. Inoltre, la capacità di condurre un’evoluzione accelerata simultaneamente su più istanze introduce un’ulteriore dimensione all’esperimento, migliorando la prospettiva di ottenere risultati diversi e robusti. Il sistema di controllo granulare e feedback integrato in PRANCE rafforza ulteriormente la prevedibilità e l’affidabilità dell’esperimento, segnando un progresso significativo nel campo delle tecniche di evoluzione diretta. Tuttavia, questa tecnica è limitata nel numero di esperimenti paralleli che può condurre. A seconda della configurazione, le configurazioni PRANCE sono solitamente limitate dalla velocità di pipettaggio del robot o dallo spazio disponibile sul piatto.
Lo stesso hardware e software utilizzati per PRANCE può essere applicato anche a metodi evolutivi che non coinvolgono i batteriofagi. Come dimostrato nel metodo11 dei multi-turbidostati, questo stesso strumento può essere impiegato esclusivamente con i batteri, consentendo esperimenti di evoluzione adattativa dell’intero genoma. Questa adattabilità amplia il campo di applicazione di questo strumento, aprendo la strada a nuove forme di evoluzione accelerata dalla robotica.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Emma Chory e Kevin Esvelt per il loro aiuto e i loro consigli con la configurazione hardware e software. Samir Aoudjane, Osaid Ather ed Erika DeBenedictis sono supportati dallo Steel Perlot Early Investigator Grant. Questo lavoro è stato sostenuto dal Francis Crick Institute, che riceve i suoi finanziamenti principali dal Cancer Research UK (CC2239), dal Medical Research Council del Regno Unito (CC2239) e dal Wellcome Trust (CC2239).
Materials
| 3D printed bacterial reservoir "waffle" | – | – | https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view; For Robot deck |
| 3D printer | FormLabs | Form 3B+ | 3D printer components |
| 3D printer resin (clear) | FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | consumable for 3D printer |
| 8-1,000 µL head | Hamilton | 10140943 | For Liquid handling robot |
| 96-1,000 µL pipetting head | Hamilton | 10120001 | For Liquid handling robot |
| Black polystyrene plate reader microplates | Millipore Sigma | CLS3603 | For Robot deck |
| BMG Labtech Spectrostar FLuorstar Omega | BMG Labtech | 10086700 | For Liquid handling robot |
| Cleaning solution | Fluorochem Limited | F545154-1L | used to clean the liquid handling parts of the robot |
| Deep Well plates | Appleton Woods | ACP006 | these are used to contain evolving bacteria on the deck of the robot |
| encolsure heater | Stego | 13060.0-01 | heats inside robot enclosure |
| Hamilton STAR | Hamilton | 870101 | For Liquid handling robot |
| Heater | Erbauer | BGP2108-25 | For Liquid handling robot |
| HIG Bionex centrifuge | Hamilton | 10086700 | For Liquid handling robot |
| iSWAP plate gripper | Hamilton | 190220 | For Liquid handling robot |
| laboratory tubing | Merck | Z280356 | to construct liquid handling manifold |
| luer to barb connector | AIEX | B13193/B13246 | for connectorizing tubing |
| Magnetic stir plate | Camlab | SKU – 1189930 | For Auxiliary Fridge |
| Molcular pipetting arm | Hamilton | 173051 | For Liquid handling robot |
| Omega | BMG labtech | 5.7 | plate reader control software |
| One way Check Valves | Masterflex | MFLX30505-91 | to one way sections of liquid handling manifold |
| pyhamilton | MIT/Open source | https://github.com/dgretton/std-96-pace%20PRANCE | open source python robot control software |
| pymodbus | opensource | 3.5.2 | python pump software interface |
| Refrigetator | Tefcold | FSC175H | allows cooled bacteria to be used instead of turbidostat |
| S2060 Bacterial strain | Addgene | Addgene: #105064 | E. coli |
| temperature controller | Digiten | DTC102UK | Used to control heaters thermostatically |
| Thermostat switch controller | WILLHI | WH1436A | WILLHI WH1436A 10 A Temperature Controller 110 V Digital Thermostat Switch Sous Vide Controller NTC 10K Sensor Improved Version; for Liquid handling robot |
| Venus | Hamilton | 4.6 | proprietary robot control software |
| Wash Station for MPH 96/384 | Hamilton | 190248 | For Liquid handling robot |
| Suggested pump manufacturers | |||
| Company | Catalog number | Notes | Documentation |
| Agrowtek | AD6i Hexa Pump | https://www.agrowtek.com/doc/im/IM_ADi.pdf | |
| Amazon | INTLLAB 12V DC | ||
| Cole-Parmer | EW-07522-3 | Masterflex L/S Digital Drive, 100 RPM, 115/230 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
| Cole-Parmer | EW-07554-80 | Masterflex L/S Economy variable-speed drive, 7 to 200 rpm, 115 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
References
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