Ein praktischer Leitfaden für die Phagen- und Robotik-gestützte nahezu kontinuierliche Evolution
Summary
Phagen- und Robotik-unterstützte nahezu kontinuierliche Evolution (PRANCE) ist eine Technik für die schnelle, robuste Proteinevolution. Robotik ermöglicht die Parallelisierung von Experimenten, Echtzeitüberwachung und Feedback-Steuerung.
Abstract
Robotikbeschleunigte Evolutionstechniken verbessern die Zuverlässigkeit und Geschwindigkeit der Evolution durch Rückkopplungskontrolle und verbessern die Ergebnisse von Protein- und Organismus-Evolutionsexperimenten. In diesem Artikel stellen wir eine Anleitung zur Einrichtung der Hard- und Software vor, die für die Implementierung von Phagen- und Robotik-gestützter Near-continuous Evolution (PRANCE) erforderlich ist. PRANCE kombiniert eine schnelle Phagen-basierte molekulare Evolution mit der Möglichkeit, Hunderte von unabhängigen, rückkopplungsgesteuerten Evolutionsexperimenten gleichzeitig durchzuführen. In diesem Dokument werden die Hardwareanforderungen und das Setup für PRANCE beschrieben, einschließlich eines Liquid-Handling-Instruments, eines Plattenlesers, zusätzlicher Pumpen, Heizungen und 3D-gedruckter Behälter. Wir beschreiben, wie der Liquid-Handling-Roboter so konfiguriert wird, dass er mit Python-basierter Open-Source-Software kompatibel ist. Schließlich machen wir Vorschläge für die ersten beiden Experimente, die mit einem neu konstruierten PRANCE-System durchgeführt werden können, das seine Fähigkeiten ausübt und bestätigt, dass das System für die Multiplex-Evolution bereit ist. Dieser Leitfaden soll als Handbuch für die Navigation durch die beträchtliche Ausrüstungskonfiguration dienen, die mit der Durchführung einer roboterbeschleunigten Evolution verbunden ist.
Introduction
PRANCE ist eine Kombination aus zwei leistungsstarken gerichteten Evolutionstechniken. Die erste ist PACE1, eine molekulare Technik, die Runden der Gendiversifizierung und -selektion an den schnellen Lebenszyklus des M13-Bakteriophagen koppelt und so schnelle Evolutionsrunden in flüssigen Phagenkulturen ermöglicht. Diese Selektion wird durch die Verwendung eines Plasmid-kodierten Genschaltkreises angetrieben, der die Funktion des sich entwickelnden Proteins an die Expression von pIII, dem Schwanzhautprotein von M13, koppelt, das für die Phagenvermehrung benötigt wird, dies ist in Abbildung 1 dargestellt. Auf experimenteller Ebene ermöglicht die kontinuierliche Verdünnung der flüssigen Phagenkultur eine kontinuierliche Selektion. Die Selektionsstringenz kann somit sowohl auf der Ebene des Genkreislaufs als auch auf experimenteller Ebene moduliert werden, indem die Verdünnungsrate der Phagenkultur gesteuert wird. PACE kann daher auf jede Herausforderung im Bereich der Biomolekülentwicklung angewendet werden, für die es einen molekularen Sensor gibt, der die gewünschte Aktivität in E. coli-Bakterien nachweisen kann, um die pIII-Expression zu induzieren. Zu den Anwendungen gehören die Evolution der Protein-Protein-Bindung 2,3,4, der Protein-DNA-Bindung5, der Proteinlöslichkeit6 und zahlreicher spezifischer enzymatischer Funktionen7. Zweitens ist die roboterbeschleunigte Evolution 8,9, die einen Feedback-Controller verwendet, um zwei häufige Fehlermodi der gerichteten Evolution zu eliminieren: das Aussterben, das auftritt, wenn die Umwelt zu streng ist, und das Fehlen von Evolution, das auftritt, wenn das Umfeld zu nachsichtig ist. Im Gegensatz zur seriellen Passage von Phagen, wie sie in PANCE (Phagen-unterstützte nicht-kontinuierliche Evolution)7,10 durchgeführt wird, beinhaltet die roboterbeschleunigte “nahezu kontinuierliche” Evolution ein schnelles Pipettieren, bei dem die Kulturen in der Mitte der Log-Phase erhalten bleiben, so dass die Populationen kontinuierliche Infektions- und Vermehrungszyklen erleben können. Wenn diese beiden Technologien zusammen verwendet werden, werden sie als PRANCE (Phagen- und Robotik-unterstützte nahezu kontinuierliche Evolution8) bezeichnet, was eine robuste, gemultiplexte und schnelle kontinuierliche Evolution ermöglicht. PRANCE wurde verwendet, um Polymerasen, tRNAs und Aminoacyl-tRNA-Synthetasen zu entwickeln und während dieser Entwicklungen eine Rückkopplungskontrolle durchzuführen, um ihre Geschwindigkeit und Zuverlässigkeit zu verbessern8.
Es gibt mehrere Details des Hardware- und Software-Setups für PRANCE, die den Einsatz von Bakteriophagen auf einem Liquid-Handling-Roboter ermöglichen. Anstelle der vom Roboterhersteller bereitgestellten Standardsoftware verwenden wir ein Python-basiertes Open-Source-Softwarepaket11, das eine schnelle, gleichzeitige Ausführung und damit die Fähigkeit ermöglicht, die halbkontinuierlichen Bioreaktoren in der Mitte der Log-Phase zu halten. Die Hands-Off-Zeit der Forscher kann auf mehrere Tage verlängert werden, indem mehrere Komponenten an Deck routinemäßig selbst sterilisiert werden, und dies wird durch die automatische Steuerung von Pumpen erreicht, die diese Komponenten bleichen und spülen können. Phagenkreuzkontaminationen können durch den Einsatz eines Liquid-Handling-Roboters, der keine kraftschlüssigen Spitzen verwendet, und durch eine sorgfältige Anpassung der Liquid-Handling-Einstellungen vermieden werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trotz der Bemühungen, die Geräte zu standardisieren, wird praktisch jedes PRANCE-Setup aufgrund von Änderungen in der Geräteversorgung, der Hardware- und Softwareversionierung anders sein. Infolgedessen weist jedes PRANCE-Setup einzigartige Setup-Herausforderungen auf, die ein umfassendes Verständnis des Zwecks jeder Komponente für eine effektive modulare Fehlerbehebung erfordern.
Diese Methode beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für den Aufbau und Test eines etablierten PRANCE-Systems. Wir konzentrieren uns zunächst auf die kritischen Elemente der Hard- und Software und beschreiben dann die wesentlichen Schritte zur Vorbereitung und Durchführung einer Reihe von Testläufen, die feststellen, dass das System für PRANCE bereit ist.
Ein wesentliches Merkmal der Hardware ist die Optimierung, um das Risiko einer Kreuzkontamination von Proben bei Multiplex-Experimenten mit Bakteriophagen zu reduzieren. Es wird empfohlen, ausschließlich gefilterte Spitzen mit Roboterspitzentechnologie zu verwenden, die mit der Wiederverwendung von Spitzen kompatibel ist und Aerosole minimieren soll, die beim Spitzenauswurf entstehen, indem kraftschlüssige Spitzen vermieden werden. Robustes Waschen von Spitzen gemäß diesem Protokoll ermöglicht die Wiederverwendung von Spitzen, obwohl die Angemessenheit im Rahmen des Infektionstests auf jedem System validiert werden muss. Die Selbststerilisation ist auch von einer gleichmäßigen Zufuhr von Wasser und Bleichmittel für das System abhängig. Diese werden in Tanks/Eimern gelagert und führen bei Erschöpfung zu einer beeinträchtigten Selbststerilisation und einer schnellen Kreuzkontamination. Es können Fotos von den Tanks/Eimern gemacht werden, die vor und nach dem Ausführen des Programms aufgenommen wurden, um die Rate zu bewerten, mit der die Waschanlage bei einer bestimmten Pumpenkonfiguration Wasser und Bleichmittel verbraucht.
Ein weiteres Schlüsselelement des Systems ist die Aufrechterhaltung der Bakterienwachstumsphase und -temperatur. PRANCE-Experimente werden mit dem Bakterienstamm S2060 E. coli (Addgene: #105064) durchgeführt. Dies ist ein von K12 abgeleiteter F-Plasmid-haltiger Stamm, der für die Reduzierung von Biofilmen optimiert ist7. Darüber hinaus wurde das F-Plasmid in diesem Stamm mit einer Tetracyclin-Resistenzkassette zur Plasmiderhaltung, luxCDE und luxR zur Ergänzung der luxAB-vermittelten Lumineszenzüberwachung sowie lacZ unter dem Phagenschockpromotor zur kolorimetrischen Visualisierung von Plaques editiert. Der F-Plasmid-kodierte F-Pilus ist für die M13-Phageninfektion notwendig. Die in PACE verwendeten Bakterien müssen daher bei 37 °C und in der Mid-Log-Phase kultiviert werden, wenn der F-pilus12 exprimiert wird und eine M13-Phageninfektion, -vermehrung und -evolution möglich ist. Zur statischen Temperaturregelung kann ein handelsüblicher beheizter Plattenträger eingesetzt werden. Eine Alternative besteht darin, die Luft, die in den HEPA-Filter strömt, einfach mit kostengünstigen Heizungen zu erhitzen, obwohl dies nicht empfohlen wird, da dies zu einem beschleunigten Verschleiß der Hardware führen kann. Darüber hinaus beschleunigt dies die Verdunstung von Hilfsflüssigkeiten an Deck, wie z. B. den Bleich-/Wassereimern und dem Induktor, wenn sie verwendet werden.
Die Kalibrierung der Softwarepakete ist ebenfalls für die ordnungsgemäße Funktion des Systems unerlässlich. Abweichungen zwischen dem Layout des Softwaredecks und dem tatsächlichen Roboterdeck sind die häufigste Ursache für Systemausfälle während des Betriebs. Eine regelmäßige Kalibrierung der Hilfspumpen, die Bakterienkulturen, Bleichmittel und Entleerungen des Systems liefern, ist von entscheidender Bedeutung, da die Verwendung der Schlauchpumpe zu Schlauchverschleiß und Änderungen des Flüssigkeitsvolumens führen kann.
Der Wasserlauftest wird schnell eine Reihe häufiger Setup-Probleme aufdecken, darunter falsche Liquid-Handling-Einstellungen, Fluidiklecks/fehlerhafte Verbindungen und Software-Instabilität. Ein erfolgreicher Wasserlauf weist keine unerwarteten Flüssigkeitslecks auf und läuft über Nacht stabil und fehlerfrei. Es gibt eine Reihe von häufigen Problemen, die während eines Wasserlaufs auftreten können, wie z. B. das Nichtausführen bestimmter Schritte zur Handhabung von Flüssigkeiten, das Tropfen von Pipetten und das Anhalten des Protokolls während des Laufs. Falls bestimmte Liquid-Handling-Schritte nicht ausgeführt werden, vergewissern Sie sich, dass alle Flüssigkeitsklassen installiert wurden. Diese listen die passende Viskosität und Pipettiergeschwindigkeiten auf und werden in der vom Hersteller bereitgestellten Robotersteuerungssoftware eingestellt. Wenn Pipetten tropfen, ist es wichtig, dass die Einstellungen des Roboter-Pipettierarms korrekt sind, um ein sauberes Pipettieren zu ermöglichen und eine Phagen-Kreuzkontamination zu vermeiden. Für ein erfolgreiches Roboterpipettieren sind neben den korrekten Flüssigkeitsklassen auch die korrekten Deckhöhen aller Laborgeräte und entsprechende Pipettierhöhenversätze erforderlich, die im PRANCE-Robotermethodenprogramm festgelegt sind. Diese Höhenversätze müssen möglicherweise direkt angepasst werden. Wenn das Protokoll während des Durchlaufs stoppt, wird dies häufig durch eine Vielzahl von Fehlern generiert, die darauf hinweisen, dass die Deck-Layout-Datei möglicherweise nicht mit der tatsächlichen Deck-Konfiguration übereinstimmt.
Der reine Bakterientest wird Probleme mit den Einstellungen des Plattenlesers und der Echtzeit-Datenvisualisierung, Probleme mit übermäßiger Bleichmittelkonzentration oder unzureichender Spülung sowie Temperaturstabilität aufdecken. Ein erfolgreicher Lauf nur mit Bakterien zeigt eine Äquilibrierung der Lagunenabsorption über die ersten drei Zyklen, gefolgt von einer stabilen Absorption für die Dauer des Laufs. Darüber hinaus kann es mehrere häufige Probleme aufdecken. Dies ist der erste Schritt, in dem die vom Plattenleser generierten Daten aufgetragen werden. Daten in der Plattenleser-Datenbank werden möglicherweise nicht richtig gespeichert oder nicht richtig dargestellt. Wenn Bakterien ihre Absorption nicht ausgleichen, kann dies darauf hindeuten, dass die Bleichmittelkonzentration zu hoch ist. Übermäßiges Bleichen oder unzureichendes Waschen kann das gesamte Experiment sterilisieren und nicht nur das Laborgerät. Bei Verdacht darauf können Bleichmittel-Erkennungsstreifen verwendet werden, um die Lagune zu testen. Die Temperaturstabilität der Kultur kann mit einer Thermometerpistole überprüft werden.
Ein erfolgreicher Infektionstest zeigt an, dass das System für PRANCE-Läufe bereit ist. Ein Infektionstest kann durchgeführt werden, indem eine Untergruppe von Lagunen geimpft wird, die Bakterienkulturen enthalten. Diese Bakterien exprimieren pIII, wenn sie mit dem entsprechenden Phagen infiziert werden, dem das Gen für pIII (ΔgIII) fehlt, was eine Phagenvermehrung ermöglicht. Eine mögliche Kombination für Tests besteht darin, S2060-Bakterien zu verwenden, die mit einem Plasmid, das pIII exprimiert, unter dem Phagen-Schock-Promotor mit einem beliebigen ΔgIII-Phagen transformiert wurden. Wir empfehlen die Verwendung von ΔgIII-Phagen mit der Wildtyp-T7-RNA-Polymerase mit S2060-Bakterien, die mit einem akzessorischen Plasmid transformiert wurden, bei dem pIII und luxAB vom T7-Promotor (Plasmid pJC173b13) angetrieben werden, wie in Abbildung 1 dargestellt. Dies ermöglicht auch eine Plattenleser-vermittelte Überwachung der Infektion während des Testlaufs. Ein endgültiger Beweis für den Erfolg des Infektionstests und das Fehlen einer Kreuzkontamination wird durch Phagentitering von Test- und Kontrolllagunen erbracht. Wenn ein Luciferase-Reporter verwendet wird, ist eine Zunahme der Lumineszenz nur in Testvertiefungen, wie in Abbildung 3 zu sehen, ebenfalls ein Indikator für eine erfolgreiche Phageninfektion und -vermehrung. Der Goldstandard für die Quantifizierung von Phagentitern ist der Plaque-Assay7. Es gibt auch ein Protokoll für die M13-Quantifizierung durch qPCR7 , das möglicherweise schneller ist, obwohl es nicht zwischen infektiösen und nicht-infektiösen Phagenpartikeln unterscheidet und daher die Titer überschätzen kann.
Das Hauptprogramm verweist auf eine Manifestdatei, dies ist eine Klartext-Datenbankdatei, die das Verdünnungsvolumen pro Zyklus jeder Vermehrungskultur sowie die Auswahl einer beliebigen Anzahl potenzieller Bakterienkultur-Rohstoffe vorgibt, die sich in der Auswahlstrenge unterscheiden können. Auf diese Weise definiert die Manifestdatei viele der Parameter der PRANCE-Ausführung. Es ist zu beachten, dass diese Datei während des Laufs entweder vom Bediener oder vom System bearbeitet werden kann, was bedeutet, dass eine manuelle oder automatische Rückkopplungssteuerung erfolgen kann.
Der Nutzen eines voll funktionsfähigen PRANCE-Setups liegt in seiner Fähigkeit, große Populationen in einer sorgfältig überwachten und kontrollierten Umgebung schnell zu entwickeln. Das plattenbasierte Format unterscheidet PRANCE von anderen Techniken, wie z. B. der Verwendung kleinerer handelsüblicher Systeme auf Turbidostatenbasis 14,15. Der plattenbasierte Aufbau ermöglicht nicht nur die einfache Integration mit zusätzlichen Roboterbearbeitungsschritten, sondern auch die Kompatibilität mit anderen Laborgeräten wie Zentrifugen. Darüber hinaus führt die Fähigkeit, eine beschleunigte Evolution gleichzeitig über mehrere Instanzen hinweg durchzuführen, dem Experiment eine zusätzliche Dimension ein, die die Aussicht auf vielfältige und robuste Ergebnisse erhöht. Das granulare Steuerungs- und Feedbacksystem, das in PRANCE integriert ist, stärkt die Vorhersagbarkeit und Zuverlässigkeit des Experiments weiter und stellt einen bedeutenden Fortschritt auf dem Gebiet der gerichteten Evolutionstechniken dar. Diese Technik ist jedoch in der Anzahl der parallelen Experimente, die sie durchführen kann, begrenzt. Je nach Konfiguration sind PRANCE-Setups in der Regel entweder durch die Pipettiergeschwindigkeit des Roboters oder durch den verfügbaren Platz an Deck begrenzt.
Die gleiche Hard- und Software, die für PRANCE verwendet wird, kann auch auf Evolutionsmethoden angewendet werden, die keine Bakteriophagen beinhalten. Wie in der Many-Turbidostats-Methode11 gezeigt, kann dasselbe Instrument ausschließlich mit Bakterien eingesetzt werden, was Experimente zur adaptiven Evolution des gesamten Genoms ermöglicht. Diese Anpassungsfähigkeit erweitert den Anwendungsbereich dieses Instruments und ebnet den Weg für neue Formen der roboterbeschleunigten Evolution.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Emma Chory und Kevin Esvelt für ihre Hilfe und Beratung bei der Einrichtung von Hard- und Software. Samir Aoudjane, Osaid Ather und Erika DeBenedictis werden durch den Steel Perlot Early Investigator Grant unterstützt. Diese Arbeit wurde vom Francis Crick Institute unterstützt, das seine Grundfinanzierung von Cancer Research UK (CC2239), dem UK Medical Research Council (CC2239) und dem Wellcome Trust (CC2239) erhält.
Materials
| 3D printed bacterial reservoir "waffle" | – | – | https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view; For Robot deck |
| 3D printer | FormLabs | Form 3B+ | 3D printer components |
| 3D printer resin (clear) | FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | consumable for 3D printer |
| 8-1,000 µL head | Hamilton | 10140943 | For Liquid handling robot |
| 96-1,000 µL pipetting head | Hamilton | 10120001 | For Liquid handling robot |
| Black polystyrene plate reader microplates | Millipore Sigma | CLS3603 | For Robot deck |
| BMG Labtech Spectrostar FLuorstar Omega | BMG Labtech | 10086700 | For Liquid handling robot |
| Cleaning solution | Fluorochem Limited | F545154-1L | used to clean the liquid handling parts of the robot |
| Deep Well plates | Appleton Woods | ACP006 | these are used to contain evolving bacteria on the deck of the robot |
| encolsure heater | Stego | 13060.0-01 | heats inside robot enclosure |
| Hamilton STAR | Hamilton | 870101 | For Liquid handling robot |
| Heater | Erbauer | BGP2108-25 | For Liquid handling robot |
| HIG Bionex centrifuge | Hamilton | 10086700 | For Liquid handling robot |
| iSWAP plate gripper | Hamilton | 190220 | For Liquid handling robot |
| laboratory tubing | Merck | Z280356 | to construct liquid handling manifold |
| luer to barb connector | AIEX | B13193/B13246 | for connectorizing tubing |
| Magnetic stir plate | Camlab | SKU – 1189930 | For Auxiliary Fridge |
| Molcular pipetting arm | Hamilton | 173051 | For Liquid handling robot |
| Omega | BMG labtech | 5.7 | plate reader control software |
| One way Check Valves | Masterflex | MFLX30505-91 | to one way sections of liquid handling manifold |
| pyhamilton | MIT/Open source | https://github.com/dgretton/std-96-pace%20PRANCE | open source python robot control software |
| pymodbus | opensource | 3.5.2 | python pump software interface |
| Refrigetator | Tefcold | FSC175H | allows cooled bacteria to be used instead of turbidostat |
| S2060 Bacterial strain | Addgene | Addgene: #105064 | E. coli |
| temperature controller | Digiten | DTC102UK | Used to control heaters thermostatically |
| Thermostat switch controller | WILLHI | WH1436A | WILLHI WH1436A 10 A Temperature Controller 110 V Digital Thermostat Switch Sous Vide Controller NTC 10K Sensor Improved Version; for Liquid handling robot |
| Venus | Hamilton | 4.6 | proprietary robot control software |
| Wash Station for MPH 96/384 | Hamilton | 190248 | For Liquid handling robot |
| Suggested pump manufacturers | |||
| Company | Catalog number | Notes | Documentation |
| Agrowtek | AD6i Hexa Pump | https://www.agrowtek.com/doc/im/IM_ADi.pdf | |
| Amazon | INTLLAB 12V DC | ||
| Cole-Parmer | EW-07522-3 | Masterflex L/S Digital Drive, 100 RPM, 115/230 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
| Cole-Parmer | EW-07554-80 | Masterflex L/S Economy variable-speed drive, 7 to 200 rpm, 115 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
References
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