מדידת עצירות במודל דרוזופילה של מחלת פרקינסון
Summary
פרוטוקול זה מציג בדיקה למידול עצירות במודל דרוזופילה מבוסס אלפא-סינוקלאין של מחלת פרקינסון.
Abstract
תסמינים לא מוטוריים במחלת פרקינסון (PD) שכיחים, קשים לטיפול ופוגעים משמעותית באיכות החיים. סימפטום לא מוטורי שכיח אחד הוא עצירות, אשר יכולה להקדים את האבחנה של PD בשנים או אפילו עשרות שנים. עצירות לא נחקרה מספיק במודלים של פרקינסון בבעלי חיים וחסרה טיפולים ספציפיים. בדיקה זו משתמשת במודל דרוזופילה של פרקינסון שבו אלפא-סינוקלאין אנושי מבוטא תחת מניע פאן-עצבי. זבובים המבטאים אלפא-סינוקלאין מפתחים את המאפיינים הבולטים של מחלת פרקינסון: אובדן נוירונים דופמינרגיים, ליקוי מוטורי ותכלילי אלפא-סינוקלאין.
פרוטוקול זה מתווה שיטה לחקר עצירות בזבובים אלה. זבובים מונחים על מזון זבובים עם תוסף צבע כחול במשך הלילה ולאחר מכן מועברים מזון רגיל למחרת. לאחר מכן הם מועברים לבקבוקונים חדשים עם מזון זבובים סטנדרטי כל שעה במשך 8 שעות. לפני כל העברה מחושב אחוז כתמי הצואה בצבע כחול בהשוואה לסך כתמי הצואה על דופן הבקבוקון. זבובי בקרה חסרי אלפא-סינוקלאין מגרשים את כל הצבע הכחול שעות לפני שזבובים המבטאים אלפא-סינוקלאין. בנוסף, ניתן לעקוב אחר מעבר המזון בצבע כחול מהמעיים באמצעות צילום פשוט. הפשטות של בדיקה זו מאפשרת את השימוש בו במסכים גנטיים או כימיים קדמיים כדי לזהות משנים של עצירות בדרוזופילה.
Introduction
מחלת פרקינסון (PD) היא הפרעה נוירודגנרטיבית מתקדמת המאופיינת קלינית בנוכחות תסמינים מוטוריים כגון ברדיקינזיה, נוקשות ורעד, וכתוצאה מכך תחלואה משמעותית1. מבחינה פתולוגית, מחלת פרקינסון מוגדרת על ידי אובדן נוירונים דופמינרגיים בחומר השחור וקיפול שגוי של אלפא-סינוקלאין, מה שמוביל להיווצרות גופי לוי ונויריטים לויים. הפתוגנזה של מחלת פרקינסון עדיין אינה מובנת היטב, ככל הנראה כתוצאה מיחסי גומלין מורכבים של גורמים גנטיים וסביבתיים 2,3. נכון לעכשיו, טיפולים משנים מחלה אינם זמינים, אולי בשל השלב המתקדם של הפתולוגיה הקיימת בזמן האבחון. מחקרים הראו כי יותר מ -60% מהנוירונים הדופמינרגיים בחומר השחור כבר אבדו עם הופעת הסימפטומים המוטוריים, מה שמדגיש את הצורך לחקור סמנים ביולוגיים פוטנציאליים לגילוי מוקדם של מחלות4. סמן ביולוגי קליני אחד כזה הוא עצירות, הנפוצה בקרב חולי פרקינסון 5,6 ועשויה להקדים את הופעת התסמינים המוטוריים בשנים ואף עשרות שנים.
למרות ההגדרה הקלינית של פרקינסון המבוססת על תסמינים מוטוריים, עצירות היא אחד ממספר תסמינים לא מוטוריים המאתגרים יותר לטיפול סימפטומטי וגורמים לפגיעה משמעותית באיכות החיים של החולים7. שינויים בציר מעי-מוח, המייצג תקשורת דו-כיוונית בין המוח למערכת העצבים האנטרית, היו מעורבים בפתוגנזה של פרקינסון. אגרגטים של אלפא-סינוקלאין נמצאו בדגימות רקמה ממערכת העיכול של חולי פרקינסון8, ומודלים של בעלי חיים מציעים כי אגרגטים של אלפא-סינוקלאין במערכת העצבים האנטרית התפשטו באופן דמוי פריון למערכת העצבים המרכזית9. נוסף על כך, חולי פרקינסון מפגינים חריגות במיקרוביום המעי10 ועלולים לחוות דלקת מעיים מוגזמת11. עצירות בפרקינסון לא נחקרה מספיק, עם מעט מודלים מדווחים של עצירות הקשורה לפרקינסון בזבובים12,13 או מכרסמים14,15.
בדיקה זו משתמשת במודל דרוזופילה של פרקינסון שבו זבובים מבטאים את הגן אלפא-סינוקלאין האנושי תחת שליטתו של נהג פאן-עצבי, n-synaptobrevin. זבובים אלה מציגים את כל המאפיינים הבולטים של מחלת פרקינסון, כולל צבירת אלפא-סינוקלאין, תפקוד מוטורי לקוי וניוון עצבי הקשור לגיל, וכתוצאה מכך אובדן נוירונים דופמינרגיים16,17. מחקרים קודמים הציגו מדידה של תפוקת צואה בזבובים כדי להעריך תפקוד לקוי של המעיים, כימות חומר צואתי של זבובים והשוואת כמויות הפרשות על פני קווים גנטיים שונים כדי לגלות הבדלים תפקודיים במערכת העיכול 18,19,20. כאן, אנו מדגימים את בדיקת העצירות באמצעות זבובים המבטאים אלפא-סינוקלאין אנושי. כלי פשוט אך רב ערך זה מאפשר לחקור סימפטום לא מוטורי חשוב של פרקינסון.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מספר שלבים בפרוטוקול זה שיסייעו לסיום מוצלח של הבדיקה. ראשית, חשוב לוודא שמרווחי הזמן בין כל סבב לכל בקבוקון יהיו עקביים לאורך כל הניסוי. תיוג הבקבוקונים במספרים יעזור למנוע את הצורך בתיאורי גנוטיפ ארוכים, ויחסוך זמן. בנוסף, חיוני שהשיטה לספירת חומר צואתי22 תישאר עקבית לאורך כל הניסוי. בעוד חומר צואתי כחול נראה על מזון תקע בקבוקון, חומר צואה חסר צבע לא. לכן, אין לספור את הנקודות הכחולות על תקע המזון או הבקבוקון.
עם בדיקות התנהגותיות, תמיד קיימת אפשרות של חוסר עקביות בתוצאות עקב תנודות בהתנהגות הזבוב או משתנים לא ידועים המשפיעים על הבדיקה. אנו ממליצים להשתמש באותה מדיה של דרוזופילה , באותו צבע מאכל ובאותו מותג בקבוקונים לכל הניסויים. באופן מעניין, במספר ניסויים נצפה כי זבובים נוטים לעשות את צרכיהם בתדירות נמוכה יותר בשעות אחר הצהריים המוקדמות, אולי בגלל השעון הביולוגי של הזבובים23. עם זאת, התנהגות זו עקבית הן בזבובי ביקורת והן בזבובים המבטאים אלפא-סינוקלאין, ולכן היא לא צריכה לעורר חששות.
אם הזבובים אינם מפרישים חומר צואתי כחול בתחילת הבדיקה, ייתכן שהצבע בו משתמשים אינו פיגמנטי מספיק. במקרה זה, ניתן להגדיל את היחס בין צבע למים מזוקקים בהתאם. ייתכן גם שכאשר נשארת רק כמות קטנה של מזון כחול במערכת העיכול של הזבוב, ייתכן שיהיה קשה לקבוע אם החומר הצואתי הוא כחול בהיר או חסר צבע. כאשר זה קורה, הצבת גיליון נייר לבן מאחורי בקבוקון יעזור לקבוע את הצבע של נקודה צואה. גם אם החומר הצואתי הוא כחול בהיר מאוד, עדיף לרשום אותו כחומר צואתי כחול ולא כחומר צואתי חסר צבע.
מגבלה אחת של בדיקה זו היא שהיא דורשת ספירה ידנית של כתמי צואה. כדי לשפר את הפוטנציאל לסינון בתפוקה גבוהה, פרוטוקול זה עשוי להשתנות בעתיד כדי לאפשר כימות אוטומטי של כתמי צואה כחולים המיוצרים על ידי זבובים בודדים בצלחות מרובות בארות. מגבלה נוספת היא שלמרות שלמודל אלפא-סינוקלאין יש פוטנציאל להתפתח למודל פרודרומלי של פרקינסון, עדיין לא זוהתה נקודת זמן אופטימלית שבה עצירות קיימת ללא ניוון עצבי.
לסיכום, שיטה זו מציעה גישה פשוטה ופשוטה למידול עצירות, תסמין פרקינסון לא מוטורי שלא נחקר מספיק, במודל דרוזופילה של פרקינסון.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר מל פאני מבית החולים בריגהם ונשים ובבית הספר לרפואה של הרווארד על המתנה האדיבה של הבקרה והאלפא-סינוקלאין המבטאים קווי דרוזופילה . אנו מכירים במקורות הבאים לתמיכה במענקים לד”ר אולסן: NINDS K08, מלגת ג’ורג’ קוטציאס של האגודה האמריקאית למחלות פרקינסון, פרס החוקר המוקדם של מחלת הפרקינסון של משרד ההגנה.
Materials
| 1400 g sucrose | MP Biomedicals | 904713 | |
| 1800 g dextrose | MP Biomedicals | 901521 | |
| 2884 g yeast | MP Biomedicals | 903312 | |
| 428 g agar | Fisher Scientific | 10253156 | |
| 4600 mL molasses | Grandma's Molasses | 7971942 | |
| 68 L water | N/A | N/A | |
| 680 mL tegosept mix (1200 g tegosept in 6 L ethanol) | |||
| 6864 g cornmeal | Pearl Milling | 125045 | |
| 800 mL acid mix (83 mL phosphoric acid in 1 L water + 836 mL propionic acid in 1 L water) | |||
| cellSens Standard software | Olympus | N/A | |
| Ethanol | Pharmco-Aper | 111ACS200 | |
| Flugs for wide plastic vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Flystuff wide Drosophila vials, polystyrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | N/A | Version 9.5.1 |
| Olympus DP23 camera | Olympus | N/A | |
| Olympus SZX12 Stereo Microscope | Olympus | N/A | |
| Phosphoric Acid | Fisher Scientific | S25470A | |
| Propionic Acid | Fisher Scientific | A258 – 500 | |
| Soft gel paste food color, Royal blue | AmeriColor | 202 | |
| Tegosept | Apex | 20-258 | |
| Drosophila Stocks | |||
| nSyb-QF2, nSyb-Gal4 | All lines provided by Dr. Mel Feany | N/A | Lines are available directly from Dr. Feany |
| nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein | N/A | ||
| w1118 | N/A |
References
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson’s disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
- Bloem, B. R., Okun, M. S., Klein, C. Parkinson’s disease. Lancet. 397 (10291), 2284-2303 (2021).
- Ball, N., Teo, W. P., Chandra, S., Chapman, J. Parkinson’s disease and the environment. Front Neurol. 10, 218 (2019).
- Zhou, J., Li, J., Papaneri, A. B., Kobzar, N. P., Cui, G. Dopamine neuron challenge test for early detection of Parkinson’s disease. NPJ Parkinsons Dis. 7 (1), 116 (2021).
- Ueki, A., Otsuka, M. Life style risks of Parkinson’s disease: association between decreased water intake and constipation. J Neurol. 251 (Suppl 7), vII18-vII23 (2004).
- Houser, M. C., Tansey, M. G. The gut-brain axis: is intestinal inflammation a silent driver of Parkinson’s disease pathogenesis. NPJ Parkinsons Dis. 3, 3 (2017).
- Pfeiffer, R. F. Non-motor symptoms in Parkinson’s disease. Parkinsonism Relat Disord. 22 (Suppl 1), (2016).
- Klann, E. M., et al. The Gut-brain axis and its relation to parkinson’s disease: A review. Front Aging Neurosci. 13, 782082 (2021).
- Mukherjee, A., Biswas, A., Das, S. K. Gut dysfunction in Parkinson’s disease. World J Gastroenterol. 22 (25), 5742-5752 (2016).
- Yemula, N., Dietrich, C., Dostal, V., Hornberger, M. Parkinson’s disease and the gut: symptoms, nutrition, and microbiota. J Parkinsons Dis. 11 (4), 1491-1505 (2021).
- Chen, S. J., Lin, C. H. Gut microenvironmental changes as a potential trigger in Parkinson’s disease through the gut-brain axis. J Biomed Sci. 29 (1), 54 (2022).
- Hawrysh, P. J., et al. PRKN/parkin-mediated mitophagy is induced by the probiotics Saccharomyces boulardii and Lactococcus lactis. Autophagy. 19 (7), 2094-2110 (2023).
- Liu, W., Lim, K. L., Tan, E. K. Intestine-derived α-synuclein initiates and aggravates pathogenesis of Parkinson’s disease in Drosophila. Transl Neurodegener. 11 (1), 44 (2022).
- Rota, L., et al. Constipation, deficit in colon contractions and alpha-synuclein inclusions within the colon precede motor abnormalities and neurodegeneration in the central nervous system in a mouse model of alpha-synucleinopathy. Transl Neurodegener. 8, 5 (2019).
- Diwakarla, S., et al. ATH434 reverses colorectal dysfunction in the A53T mouse model of Parkinson’s disease. J Parkinsons Dis. 11 (4), 1821-1832 (2021).
- Ordonez, D. G., Lee, M. K., Feany, M. B. α-synuclein Induces mitochondrial dysfunction through spectrin and the actin cytoskeleton. Neuron. 97 (1), 108.e6-124.e6 (2018).
- Olsen, A. L., Feany, M. B. Glial α-synuclein promotes neurodegeneration characterized by a distinct transcriptional program in vivo. Glia. 67 (10), 1933-1957 (2019).
- Cognigni, P., Bailey, A. P., Miguel-Aliaga, I. Enteric neurons and systemic signals couple nutritional and reproductive status with intestinal homeostasis. Cell Metab. 13 (1), 92-104 (2011).
- Urquhart-Cronish, M., Sokolowski, M. B. Gene-environment interplay in Drosophila melanogaster: chronic nutritional deprivation in larval life affects adult fecal output. J Insect Physiol. 69, 95-100 (2014).
- Popovic, R., et al. Blocking dPerk in the intestine suppresses neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Cell Death Dis. 14 (3), 206 (2023).
- Poteet, E., et al. Neuroprotective actions of methylene blue and its derivatives. PLoS One. 7 (10), e48279 (2012).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Schlichting, M., et al. A neural network underlying circadian entrainment and photoperiodic adjustment of sleep and activity in Drosophila. J Neurosci. 36 (35), 9084-9096 (2016).
